Нормальная микрофлора глазной поверхности (ГП) является одним из интенсивно изучаемых объектов в офтальмологии [1—4]. Нормальное сообщество микроорганизмов, населяющих эту нишу, — так называемая коровая микрофлора — может включать в себя минорные, но активные формы, способные к размножению и поддержанию своей численности. Изменение состава и соотношения микроорганизмов способно повлечь за собой патологические состояния ГП. При этом в ряде случаев инфекционное поражение может быть обусловлено не кардинальным изменением состава микробиома, а появлением в нем патогена — немногочисленного, играющего подчиненную роль, но обладающего выраженным токсическим воздействием на ткани глаза. В связи с этим точное описание нормального микробиома ГП крайне необходимо по двум причинам: во-первых, для использования его в качестве референса при описании патологических состояний ГП, во-вторых — для фундаментального понимания происходящих в пределах слизистой оболочки глаза процессов катаболизма и анаболизма различных веществ, предполагающих участие сообщества микроорганизмов в роли симбионтов.

Данные об универсальном составе «коровой микрофлоры» ГП весьма противоречивы. С одной стороны, можно предположить, что устойчивого микробиома ГП не существует и нормальный состав сообщества закладывается в онтогенезе индивидуально. Кроме того, микробиом ГП может значительно изменяться в процессе взаимодействия человека с окружающей средой и членами локальной субпопуляции [1—3]. С другой стороны, такая вариабельность данных может быть обусловлена и техническими особенностями исследования. При этом на результат могут повлиять как особенности забора материала для анализа, так и применение различных аналитических методов, что описано и для других локаций [5].

В данной работе предложен оригинальный алгоритм микробиологического анализа пробы, полученной с ГП с использованием жестких контактных линз (ЖКЛ) длительного ношения в качестве носителя микробной ДНК для снижения сигнала контаминирующего бактериального «шлама». Полученный материал анализировали с использованием различных платформ для анализа гена 16S рибосомальной РНК (рРНК) и оценивали вариабельность полученных данных.

Материал и методы

Отбор образцов. ЖКЛ длительного ношения из полиметилметакрилата снимали во время плановой замены с одного произвольно выбранного глаза у пациентов с миопией и без сопутствующих офтальмологических и системных заболеваний. Снятие линзы с глаза проводилось вакуумным пинцетом в асептических условиях. Средний возраст пациентов составил 41 год. Все пациенты на момент отбора линз проживали в европейской части России. Всего было отобрано 16 линз. У пяти пациентов линзы забирали дважды (5 из 16 линз) с интервалом в один год. Срок использования линз в режиме дневного ношения на момент забора составлял 1 год. Показанием к замене линзы служило образование биогенной пленки, снижающей прозрачность и качество коррекции зрения. Отрицательным контролем служили новые линзы, не контактировавшие с ГП пациента.

Соскобы с конъюнктивы получали путем аппликации на ее поверхность ребристого акрилового шпателя. Всего было отобрано 42 образца соскобов у пациентов с миопией и без сопутствующих офтальмологических и системных заболеваний.

Образец биоматериала переносили в пустую стерильную пробирку и помещали в низкотемпературный холодильник (–70 °C), где он хранился до момента дальнейшего анализа.

Ведение пациентов и получение образцов для анализа осуществляли на базе отдела контактной коррекции зрения ФГБНУ «НИИ глазных болезней». Было получено информированное согласие пациентов на дальнейшее изучение образцов методом высокопроизводительного секвенирования.

Образцы, дважды забранные у одного и того же пациента, были проанализированы на двух различных платформах.

Всего в анализ вошло 16 линз, 5 были проанализированы на платформе 454 GSJunior, IonTorrent, 11 — на платформе Illumina MiSeq.

Выделение ДНК. ДНК из биопленок на поверхности линз экстрагировали с помощью набора для изоляции ДНК PowerBiofilm^® (MoBio, США). ДНК из образцов слизистой оболочки экстрагировали с помощью набора для выделения ДНК AxyPrep kit (Axygen, США). Образец помещали в пробирку с частицами для разрушения и добавляли соответствующий лизирующий буфер. Разрушение биоматериала проводили с использованием гомогонизатора FastPrep-24 (MP Biomedicals, США) за два цикла по 30 секунд с частотой 5 движений в 1 секунду. Далее все манипуляции проводили в соответствии с протоколом, рекомендованным производителем.

В качестве контроля использовали «пустой» образец с применением выбранного набора, для выделения ДНК в который вместо биоматериала добавляли стерильную воду.

Количество экстрагированной ДНК оценивали с помощью флуориметра Qubit (Invitrogen, США). До момента дальнейших манипуляций выделенную ДНК хранили при –20 °С.

Подготовка ДНК-библиотек и секвенирование на платформе 454 GSJunior, IonTorrent, SOLiD — 5500xl. ДНК-библиотеки для секвенирования были созданы с использованием праймеров, фланкирующих V1—V5-регион гена 16S рРНК для прокариот (прямой праймер — 27F и обратный — 926R, который содержал в себе уникальную последовательность, или баркод, для отнесения продукта к определенному образцу).

Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили с использованием смеси Pfu и Taq ДНК-полимераз в следующих условиях: 95 °C, 5 мин, 30 циклов: 95°C 30 с, 55 °C 30 с, 68 °C 2 мин — в общем объеме 25 мкл. Продукты ПЦР были извлечены из агарозного геля с помощью набора Library Quick Gel Extraction kit (Applied BioSystems, США). Количество продукта определяли с помощью набора Quant-iT dsDNA BR Assay Kit (Invitrogen, США) на флуориметре Qubit (Invitrogen, США). Эквимолярные количества очищенного продукта ПЦР были объединены и повторно очищены с помощью Ampure Beads (Beckman Coulter, США) в соответствии с рекомендациями компании Roche (Германия).

Подготовка ДНК-библиотек и секвенирование на платформе Illumina MiSeq. ДНК-библиотеки для метабаркодинга по гену 16S рРНК были подготовлены в соответствии с рекомендациями Illumina с помощью Q5 High-Fidelity ДНК-полимеразы (NEB) с праймерами к V3—V4-вариабельным регионам гена рибосомальной РНК Bakt 341F (5-CCT ACG GGN GGC WGC AG-3) и Bakt 805R (5-GAC TAC HVG GGT ATC TAA TCC-3) [6]. Парноконцевое прочтение библиотек выполняли на платформе Illumina MiSeq с применением Reagent Kit v3PE (Illumina, США), 600 циклов.

Для обработки данных не использовали каких-либо дополнительных математических алгоритмов, кроме собственного программного обеспечения Illumina со стандартными настройками.

Микроорганизмы-загрязнители исключали путем вычета отдельных таксономических единиц (ОТЕ) из целевых образцов.

Относительная численность конкретных бактериальных групп была исследована на уровне рода (представлены группы, преодолевшие однопроцентный порог).

Результаты

Исследовано микробиологическое разнообразие в биопленках с поверхности ЖКЛ с помощью двух типов пробоподготовки и секвенирования методом 16S-метабаркодинга на платформах Illumina MiSeq и 454 GSJunior, IonTorrent, SOLiD.

На поверхности ЖКЛ были обнаружены следующие роды бактерий:

1) по данным метабаркодинга V1—V5-вариабельного региона гена 16S рРНК и секвенирования на платформе 454 GSJunior: Psedoumonas (45,6%), Sphingomonas (20,5%), Methylobacterium (19,5%), Yersinia (11,4%), Acinetobacter (1,8%).

2) по данным метабаркодинга V3—V4-вариабельного региона гена 16S рРНК и секвенирования на платформе Illumina: Acinetobacter (39%), Gluconacetobacter (10,8%), Propionibacterium (9,3%), Corynebacterium (9,3%), Staphylococcus (7,2%), Streptococcus (7%), Pseudomonas (4,1%), Micrococcus (3,3%), Yersinia (3%), Chondromyces (2,4%), Serratia (2,3%), Bacillus (2,1%).

Как видно из полученных данных, состав микробиома ЖКЛ зависит от выбора вариабельного региона гена 16S рРНК и платформы, используемой для секвенирования.

Анализ образцов слизистой оболочки ГП, исследованных с помощью метабаркодинга V3—V4-вариабельного региона гена 16S рРНК и секвенирования на платформе Illumina, выявил следующее соотношение бактериальных родов: Propionibacterium (36,3%), Staphylococcus (11,6%), Corynebacterium (10,8%), Streptococcus (6,9%), Pseudomonas (6,2%), Kocuria (3,1%), Acinetobacter (2,5%), Mycobacterium (1,5%), Paracoccus (1,3%).

Обсуждение

В настоящее время многие исследователи сходятся во мнении, что устойчивого микробиома, характерного для ГП, не существует, а имеется индивидуальный паттерн [1—4]. Данное предположение основано на значительной вариабельности состава выявляемых на ГП бактерий. Несмотря на относительно хорошую сходимость результатов на уровне доминирующих родов, многообразие сочетаний второстепенных и минорных представителей микробиома даже при большой выборке не позволяет описать устойчивые комбинации.

Одной из причин технического характера, влияющей на результаты микробиологических тестов, может быть нестандартизированная техника получения биологического материала для анализа. Например, при смене предпочитаемого региона взятия мазка на тампон (для разных регионов конъюнктивы и век) результаты достоверно различаются [7]. При этом сила нажатия при заборе материала с ГП также оказывает существенное влияние на спектр выявляемых бактерий [2]. Значительное влияние на состав микробиома оказывает и предварительная инстилляция анестетика [8].

Вторая, не менее значимая, причина низкой сходимости результатов различных исследований заключается в выборе метода анализа. Считается, что классический микробиологический анализ не имеет возможности обеспечить рост всех жизнеспособных микроорганизмов в пробе. Так, около 20% соскобов не дают никакого роста [4]. При выполнении рутинных исследований, без индивидуального подбора композиций питательных сред, ложноотрицательные результаты могут быть вполне воспроизводимыми. Следовательно, при использовании такого способа оценки микробного сообщества всегда надо иметь в виду ограниченность детектируемого спектра условиями культивирования (применяется термин «культивируемая микробиота») [9]. После распространения молекулярных методов эти ограничения классического микробиологического анализа привели к возникновению понятия «темная материя в микробиологии», объясняющего суть дискуссии между сторонниками двух гипотез: первой — если что-то не удалось культивировать, то его не существует в пробе в качестве жизнеспособной формы, и второй — все многообразие, определенное молекулярными методами, реально, но классический анализ не может обеспечить условия для культивации реально существующих штаммов [10—13]. Относительная простота исполнения и дешевизна классического микробиологического теста являются его неоспоримыми достоинствами. Кроме того, его несомненный плюс — то, что организмы, показавшие рост на питательной среде, обязательно должны были присутствовать в пробе в жизнеспособном состоянии, тогда как молекулярные методы могут дать ложноположительный сигнал, опираясь лишь на содержащие фрагменты ДНК остатки организмов, занесенные на слизистую оболочку случайным образом.

Молекулярные методы исследования позволяют обнаружить на ГП значительно большее разнообразие бактерий, чем культуральные. Тем не менее у каждого из них также есть свои преимущества и недостатки. Методы, предполагающие использование ПЦР и MALDI, позволяют избежать трудностей, связанных с длительным временем культивирования бактерий, высокой вероятностью контаминации и сложной логистикой. Однако эти методы основаны на принципе сравнения с предполагаемым кандидатом и требуют доступа к банку данных эталонных культур, с которыми производится сравнение (эти базы также обладают свойством «устаревать» и не всегда обладают полнотой видового разнообразия). Нарушение технологии пробоподготовки может приводить к селективному разрушению определенных бактерий, и в итоговые результаты анализа попадают наименее механически компетентные виды [14]. Аналогичная проблема может быть связана с избирательным лизисом. Таким образом, для всех молекулярных методов фактором, потенциально влияющим на результаты анализа, является устойчивость оболочек разных организмов к химическому и физическому разрушающему воздействию [15].

Анализ микробиома с помощью высокопроизводительного секвенирования гена 16S рРНК позволяет единовременно определять всю совокупность бактерий в пробе. Однако этот метод не позволяет производить количественную оценку соотношений микроорганизмов, так как обогащение библиотеки фрагментами вариабельной части гена 16S рРНК происходит с помощью ПЦР. ПЦР-индуцированные артефакты в исследованиях микробного разнообразия могут быть разделены на две категории: связанные с артефактами последовательности (ошибки ПЦР) и искажающие распределение продуктов из-за неравного усиления (смещение ПЦР) или эффективности клонирования [16]. Получение некорректных данных может происходить в результате образования химерных молекул, гетеродуплексных молекул, ошибок полимеразы. Смещение ПЦР может быть обусловлено внутренними различиями в эффективности амплификации матриц или ингибированием амплификации путем самоотжига наиболее распространенных матриц на поздних стадиях процесса.

Применительно к молекулярному анализу микробиома ГП сочетание широкого спектра детектируемых организмов в образцах с высокой чувствительностью к контаминациям делает трудноразрешимой задачу фильтрации получаемой информации для исключения паразитных данных. В связи с этим часть видов бактериального сообщества ГП, определяемых молекулярными методами, может не относиться к ней, но давать тем не менее доминирующий сигнал.

Действительно, в случае исследования увлажненной открытой поверхности, каковой является слизистая оболочка глаза, в образец может попадать случайная ДНК микроорганизмов из других локаций, преимущественно кожи — самого большого по площади органа человека. В такой ситуации представляется логичным, что при микробиологическом анализе ГП в данных, полученных методами высокопроизводительного секвенирования, наибольшую представленность и воспроизводимость от анализа к анализу имеют лишь несколько микробиологических таксонов, как правило, пересекающихся с кожной микрофлорой (Propionibacterium, Staphylococcus, Corynebacterium) [17]. В то же время полный спектр всех выявляемых этим методом бактерий гораздо шире. С одной стороны, это подтверждает версию об отсутствии характерного для ГП устойчивого микробиома, а с другой — может быть обусловлено различными методиками анализа, инструментарием и способами математической обработки [5].

Исходя из вышеизложенного нами было высказано предположение о том, что большая представленность бактерий кожной микрофлоры на конъюнктиве делает затруднительным выявление фракций реального микробиома ГП, которые оказываются в числе «минорных» видов и остаются за однопроцентным порогом отсечения, принятым в метагеномике. В значительной степени ситуацию могло бы исправить введение в схему манипуляций при получении проб некоторого физического фильтра, который не захватывал бы клеточный дебрис, мертвые клетки, остатки ДНК случайных для ГП микроорганизмов, но при этом обеспечивал бы адгезию живых клеток бактерий и грибов. В роли такого физического фильтра могут выступать контактные линзы длительного ношения, так как микробиота, «закрепившаяся» на поверхности из полимера с низкими адгезивными свойствами, не может иметь случайный характер.

Действительно, дизайн вещества гидрофобных ЖКЛ предполагает наименее благоприятные условия для выживания на их поверхности бактериальных сообществ вне жидкости. Они также препятствуют случайной пассивной адгезии бактериального «шлама». Одновременно с этим длительный характер ношения ЖКЛ, в отличие от большинства мягких контактных линз, теоретически способствует формированию адгезированных на поверхности колоний, в случае если бактерии активно существуют на слизистой оболочке. Поэтому проба, взятая с поверхности контактной линзы, заведомо обеднена генетическим материалом, заносимым в конъюнктивальную полость с кожи и/или из окружающей среды, и, вероятно, обогащена колониеобразующими организмами, характерными для микробиоты ГП.

Для обобщения полученных результатов на всю популяцию необходимо решить вопрос: может ли носитель контактных линз быть адекватной моделью для исследования микробиома в общем случае? Для таких групп спектр высеваемых с конъюнктивы и определяемых молекулярными методами организмов, как правило, такой же, как и у контрольной группы, однако в ряде случаев есть и некоторые характерные для них организмы, что необходимо учитывать при анализе результатов [18—21].

В таблице приведены данные о представленности микроорганизмов в проанализированных образцах и сравнение с данными литературы о микробиоте в аналогичной локации.

Примечание. + — больше 1%; ++ — больше 10% (если было указано); * — собственные данные; ** — минорные формы, высеваемые с линз.

Очевидно, что каждый инструментально-аналитический метод будет давать свой уникальный результат, это и является причиной лишь частичной сходимости данных у разных исследователей. При этом применение двух инструментально-аналитических подходов анализа гена 16S рРНК с использованием высокопроизводительного секвенирования для анализа собственных данных привело не только к количественному, но и к качественному расхождению в оценке состава микробиома. По результатам данного исследования совпали лишь три рода микроорганизмов из одиннадцати, обнаруженных двумя методами в совокупности: Pseudomonas, Acinetobacter и Yersinia.

Относительным указанием на бóльшую надежность получаемой аналитической информации при анализе вещества линз с применением платформы Illumina по сравнению с платформой 454 является не только сходимость с данными других исследований, но и присутствие в результатах выдачи Illumina минорных представителей — Micrococcus, Bacillus и Serratia, которые в ряде публикаций указываются в качестве постоянных представителей микрофлоры ГП носителей линз (но не превышают порога двадцатипроцентной представленности) [20, 21]. При этом описаны результаты классических тестов, где эти три рода демонстрируют рост на питательной среде, что говорит об их жизнеспособном состоянии на ГП [18, 19]. Использование платформы 454 не выявило эти бактерии.

Заключение

Таким образом, в настоящем исследовании продемонстрировано, что носители ЖКЛ представляют собой уникальный объект для изучения микробиома ГП. Линзы длительного ношения дают возможность получить принципиально новые данные за счет видов, образующих колонии на их поверхности, и, что еще более важно, за счет подавления сигнала ДНК микроорганизмов, имеющих высокую распространенность на коже и в аэрозолях. Последнее позволяет некоторым подтвержденным значимым бактериальным видам пройти однопроцентный порог отсечения по представленности ОТЕ и остаться в диапазоне результатов метагеномного анализа.

Вышесказанное дает основание предложить использовать ЖКЛ в качестве физического фильтра для уточнения состава регулярной нормальной микрофлоры ГП методами молекулярно-генетического анализа, а также для сравнительных исследований при возникновении патологических состояний бактериальной природы в тех случаях, когда пациент использует ЖКЛ по независимой причине, например для коррекции выраженных аномалий рефракции. При этом методом выбора для оценки состава микробиома ГП с привлечением ЖКЛ может быть анализ гена 16S рРНК с использованием высокопроизводительного секвенирования на платформе Illumina.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования: C.А., Е.Ш., Н.Г., И.Н.

Сбор и обработка материала: Т.М., Н.Г., О.Г.

Статистическая обработка: Н.Г., И.Н., А.С.

Написание текста: А.С., Н.Г., И.Н., Н.А.

Редактирование: С.А., Н.Г., Н.А.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.