Заболеваемость сахарным диабетом (СД) в настоящее время приобрела характер глобальной эпидемии с высокой смертностью. которая поражает население не только высокоразвитых стран, таких как США, Великобритания, Германия, но и развивающихся стран, включая Китай, Индию, страны Южной Америки и Африки [1—5]. По расчетам, к 2040 г. из 600 млн пациентов с СД 400—500 млн будет приходиться на страны с низким и средним уровнем дохода [6].

Диабетическая ретинопатия (ДР) является наиболее частым микрососудистым осложнением СД. Она развивается при длительной продолжительности СД и связана с недостаточным контролем уровня гликемии, артериального давления и липидного статуса [7]. В ряде исследований доказано, что строгий контроль уровня гликемии снижает частоту и прогрессирование ДР [8]. Длительная инсулинотерапия способствует стабилизации ДР и заметному снижению риска ее прогрессирования [9, 10].

Тем не менее клинические исследования показывают, что заместительная инсулинотерапия вызывает транзиторное усугубление ДР у пациентов с СД 1-го и 2-го типа [9, 11—13]. Механизмы, лежащие в основе транзиторного усугубления ДР на фоне инсулинотерапии, остаются поводом для дискуссии.

Цель настоящего исследования — изучение влияния инсулинотерапии в течение 1 мес от ее начала на концентрацию сосудистого эндотелиального фактора роста А (VEGF-A) во внутриглазной жидкости (ВГЖ) крыс с аллоксановой моделью СД.

Материал и методы

Эксперимент выполнен с соблюдением принципов гуманности, изложенных в директивах Европейского сообщества и Хельсинкской декларации, в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных».

Для моделирования СД были использованы 80 беспородных крыс со средней массой тела 256,07±24,12 г (180—335 г). Всех животных содержали в виварии в индивидуальных клетках на стандартном рационе питания со свободным доступом к воде. У 65 крыс моделировали аллоксановую модель СД однократным внутрибрюшинным введением аллоксана гидрата (La Chema, Чехия) в дозе 100 мг/кг в 0,4 мл раствора цитратного буфера. Оставшиеся 15 здоровых крыс составили контрольную группу.

Поскольку диабетогенное действие аллоксана более активно проявляется у животных, находящихся на предварительной диете, все животные в течение 24 ч до начала эксперимента не получали пищу, но имели свободный доступ к воде.

При планировании дизайна эксперимента мы учитывали трехфазную реакцию организма на введение подопытным животным аллоксана моногидрата, заключающуюся в первоначальном повышении уровня сахара крови, достигающем максимума через 2—4 ч после введения препарата, которая сменяется фазой гипогликемии продолжительностью 15—20 ч. Если лабораторное животное в эту фазу не погибает, то возникает вторичная гипергликемия, свидетельствующая о развитии СД. Поэтому установление диабетического статуса и старт инсулинотерапии проводили через 7 дней после внутрибрюшинного введения аллоксана моногидрата.

За первые 7 дней после введения аллоксана моногидрата погибло 20 крыс. В исследовании осталось 45 экспериментальных животных с СД и 15 здоровых крыс. Для установления диабетического статуса осуществляли контроль концентрации глюкозы в крови, взятой из хвостовой вены.

Экспериментальных животных изучали в трех группах. Основную группу (1-я группа; n=21) составили животные с аллоксановой моделью СД, которым было начато ежедневное однократное внутрибрюшинное введение инсулина продленного действия в терапевтической дозе 0,9 Ед/кг массы тела. В группу сравнения (2-я группа; n=24) вошли животные с аллоксановой моделью СД, которые не получали специфическую терапию. Контрольная группа (3-я группа; n=15) состояла из здоровых животных, которые не получали специфическую терапию. Вместо инсулина животным группы сравнения и контрольной группы внутрибрюшинно вводили физиологический раствор.

Экспериментальные животные были выведены из исследования через 31 день после старта инсулинотерапии. К концу эксперимента контрольная группа по-прежнему насчитывала 15 крыс, основная группа — 17, группа сравнения — 20.

Из обоих глаз каждого животного был произведен забор ВГЖ в количестве 80—90 мкл, которые были помещены в индивидуальные пробирки Эппендорфа для последующего анализа. Концентрация VEGF-A определялась в лаборатории Чебоксарского филиала ФГАУ НМИЦ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова» методом иммуноферментного анализа с использованием тест-системы ELISA Kit for Vascular Endothelial Growth Factor A (Cloud-Clone Corp., США).

Так как полученные цифровые данные не подчинялись нормальному распределению, статистическую обработку и выявление статистической значимости проводили непараметрическим методом при помощи критериев Краскела—Уоллиса и Манна—Уитни с поправкой Бонферрони в программе IBM SPSS Statistics 20. Данные представлены в виде медианы (Me) [25-го; 75-го перцентилей].

Результаты

В основной группе (n=17) концентрация VEGF-A во внутриглазной жидкости составила 140 [136; 210] пг/мл, что в 1,94 раза выше, чем в группе сравнения (n=20; 72 [58; 86] пг/мл), и в 1,84 раза выше, чем в контрольной группе (n=15; 76 [62,5; 88] пг/мл; см. рисунок).

При помощи критерия Краскела—Уоллиса были установлены статистически значимые различия исследуемых групп по концентрации VEGF-A во ВГЖ (p_k<0,001).

Парные сравнения с помощью критерия Манна-Уитни с поправкой Бонферрони показали, что значения концентрации VEGF-A во ВГЖ в основной группе были статистически значимо выше, чем в группе сравнения (p_m—u<0,0004) и в контрольной группе (p_m—u=0,0045). Группа сравнения не имела статистически значимых различий при сопоставлении показателей контрольной группы (p_m—u=0,9979).

Обсуждение

Аллоксановая модель СД — одна из самых распространенных и изученных, она активно применяется исследователями по всему миру.

Аллоксан является структурным аналогом глюкозы, за счет чего он накапливается в B-клетках поджелудочной железы и приводит к их гибели с последующим развитием диабета. Поражению B-клеток сопутствуют дегенеративные изменения в почках и печени, что обусловливает высокую смертность лабораторных животных в 1-е сутки после введения аллоксана [14]. Более того, индивидуальная чувствительность к аллоксану животных одного и того же вида варьирует в очень широких пределах. Причины различной чувствительности в ответ на введение диабетогенных доз аллоксана определяются большим количеством факторов, в том числе возрастом, полом, состоянием нервной и эндокринной систем, характером обмена веществ, состоянием внутренних органов. В качестве примера можно привести работу Н.А. Пальчиковой и соавт. [15], в которой были исследованы гормонально-биохимические особенности аллоксановой и стрептозоциновой моделей СД у крыс. Авторы выявили высокую индивидуальную гетерогенность животных по реакции на введение аллоксана уже в 1-е сутки после введения препарата. За первые 5 сут исследования на фоне постепенного отказа от потребления воды и экскреции мочи погибли 31% подопытных животных.

Высокая смертность лабораторных животных является одним из недостатков данной модели СД, с которым мы столкнулись во время проведения эксперимента. Так, через 7 дней после внутрибрюшинного введения аллоксана моногидрата смертность лабораторных животных составила 30,8% (20 крыс), через 10 дней смертность составила 41,5% (27 крыс).

В патогенезе ДР лежит множество патологических процессов, из которых ключевыми считают оксидативный стресс, структурные изменения микроциркуляторного русла, гипоксию и экспрессию VEGF-A.

Y. Chen и соавторы in vitro на культуре эндотелиальных клеток крупного рогатого скота впервые показали, что оксидативный стресс и гипоксия через Wnt-сигнальный путь приводят к увеличению концентрации β-катенина в ядрах клеток. Высокие ядерные концентрации β-катенина через индуцированный гипоксией фактор 1a (HIF-1a) способствуют экспрессии VEGF-A [16].

VEGF-A — наиболее важный и хорошо изученный сигнальный белок. Наряду с другими белками он является частью системы, отвечающей за восстановление подачи кислорода к тканям при недостаточной циркуляции крови путем стимулирования ангиогенеза. VEGF-A играет одну из основных ролей в прогрессировании ДР, способствуя нарушению гематоретинального барьера и появлению новообразованных сосудов [17, 18]. Более того, в ряде экспериментальных работ на животных показано, что специфическое ингибирование VEGF предотвращает разрушение гематоретинального барьера и развитие неоваскуляризации [18—23].

V. Poulaki и соавторы доказали, что семидневная инсулинотерапия приводит к повышению уровня VEGF и HIF-1a у крыс со стрептозоциновой моделью СД, что приводит к клинически значимому нарушению гематоретинального барьера. Более того, было продемонстрировано, что инсулин-индуцированная экспрессия VEGF является HIF-1a-зависимой и осуществляется посредством p38 MAPK и фосфоинозитид-3-киназы (PI3Ks), тогда как экспрессия VEGF, индуцированная гипергликемией, является HIF-1a-независимой и осуществляется посредством протеинкиназы С и p42/p44 MAPK [19].

По всей видимости, инсулинотерапия увеличивает концентрацию VEGF-A, что может приводить к транзиторному усугублению ДР вплоть до проявлений нарушения гематоретинального барьера. Механизмы данного явления и его роль в клинической практике еще предстоит изучить более полно.

В данном исследовании мы продемонстрировали, что инсулинотерапия в течение 31 дня приводит к статически значимому повышению концентрации VEGF-A во ВГЖ in vivo у крыс с аллоксановой моделью СД. Более того, мы определили, что в вышеуказанные сроки развитие аллоксановой модели СД не приводит к статически значимому повышению концентрации VEGF-A во ВГЖ по сравнению со здоровыми животными.

Заключение

Инсулинотерапия в течение 1 мес вызывает увеличение концентрации VEGF-A во ВГЖ крыс с аллоксановой моделью СД.

Работа выполнена при поддержке Гранта РФФИ № 18-315-00029/18.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования: Г.Ш., Б.Г.

Сбор и обработка материала: Б.Г., Д.К., И.О.Х.

Статистическая обработка данных: Б.Г.

Написание текста: Б.Г.

Редактирование: Н.А.П., Н.П.П.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.