Дегенеративные изменения ретинального пигментного эпителия (РПЭ) возникают при многих приобретенных и наследственных заболеваниях сетчатки, в том числе при часто встречающейся возрастной макулярной дегенерации (ВМД), приводя к необратимой потери зрения и слепоте у взрослых [1, 2].

Поскольку на данный момент возможности терапевтического лечения для восстановления РПЭ и его связей с прилежащими фоторецепторами (ФР) отсутствуют, наиболее перспективным методом лечения является хирургическая трансплантация РПЭ [3]. Одним из источников клеток для трансплантации может быть РПЭ, дифференцированный in vitro из плюрипотентных стволовых клеток (ПСК) [4]. При этом в качестве источника могут быть взяты эмбриональные стволовые клетки человека (чЭСК-РПЭ) или индуцированные ПСК (иПСК-РПЭ) [5].

Для экспериментального изучения возможности лечения дегенеративно-дистрофических заболеваний сетчатки многими авторами были разработаны способы моделирования этих патологических состояний на животных с помощью химического (гидрохлорид L-орнитин, натрий йодат, каиновая кислота, N-метил-N-нитрозомочевина), механического и светового (голубым светом, аргоновым и гелий-неоновым лазером) повреждения [6]. Некоторые исследователи для развития атрофии РПЭ использовали внутривенное введение раствора натрия йодата (NaIO₃) в различных дозах [7, 8]. После инъекции раствора развивалась атрофия РПЭ с последующей гибелью ФР разной степени выраженности.

В 2015 г. H. Bartuma и соавт. [9] методом трансвитреального введения через pars plana глаза кролика индуцировали субретинальные пузыри с помощью фосфат-буферного раствора (PBS) или солевого сбалансированного раствора (BSS) и, начиная с 5-го дня, отмечали появляющиеся изменения в РПЭ, с 14-го дня — выраженные изменения в виде географической атрофии, которые не изменялись до окончания эксперимента (12 нед).

Однако в 2017 г. S. Petrus-Reurer и соавт. [10] на модели кролика с предварительно PBS-/NaIO₃-индуцированной географической атрофией не удалось интегрировать суспензию чЭСК-РПЭ в связи с повреждением внешнего комплекса «ФР — РПЭ — мембрана Бруха (МБ)». Исследование также показало, что чЭСК-РПЭ в суспензии могут правильно интегрировать, только если субретинальная среда достаточно сохранена. Следовательно, для того чтобы метод введения клеточной суспензии был функционально эффективным, скорее всего, надо выбирать модели дегенерации сетчатки, которые будут соответствовать ранним стадиям заболевания, с относительно сохранной наружной сетчаткой. Кроме того, было высказано предположение, что сама субретинальная инъекция может привести к травме РПЭ, вероятно, в результате механического разрушения апикальных ворсинок на РПЭ [10]. Таким образом, создание и изучение моделей индуцированной дегенерации сетчатки может позволить развивать и совершенствовать новые методы лечения, связанные с трансплантацией стволовых клеток (СК).

Цель настоящей работы — моделирование повреждающего воздействия на РПЭ у животного для последующего изучения влияния нейрональных предшественников (НП) человека.

Материал и методы

Исследование проведено на 31 кролике (31 глаз) породы шиншилла в возрасте 2,5—3,5 мес, массой 2,5—3,5 кг. Все работы проведены в соответствии с «Европейской конвенцией о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях» (ETS №123 от 18.03.86) и Приказом Минздрава СССР №755 от 12.08.75 «О мерах по дальнейшему совершенствованию организационных форм работы с использованием экспериментальных животных». Все экспериментальные животные были разделены на три группы в зависимости от метода повреждающего воздействия на РПЭ:

1-я группа (5 кроликов, 5 глаз) — субретинальное введение BSS без лазеркоагуляции и витрэктомии (для создания модели повреждения РПЭ);

2-я группа (13 кроликов, 13 глаз) — субретинальное введение BSS с выполнением витрэктомии, смещением инъекционного пузыря в сторону от места вкола при помощи перфторорганического соединения (ПФОС) и с лазеркоагуляцией [11];

3-я группа (13 кроликов, 13 глаз) — субретинальная трансплантация культуры НП.

Для проведения оперативного вмешательства животных вводили в состояние медикаментозного сна (внутримышечная инъекция тилетамина гидрохлорида /золазепама гидрохлорида в комбинации с ксилазином гидрохлоридом в соотношении 60% к 40% — 0,5 мл на кролика массой 3 кг). За 30 мин до операции кроликам в глаз инстилировали 5% раствор проксиметакаина гидрохлорида для местной анестезии и 0,5% раствор тропикамида для расширения зрачка. После операции кролики получали внутримышечно раствор дексаметазона 2 мг/кг, местно инстилляции дексаметазона 1 мг/мл, неомицин 3 мг/мл, полимиксина В сульфат 6000 ЕД/мл по 1 капле 2 раза в день.

Разработка хода операции. У кроликов 1-й экспериментальной группы конъюнктива вскрыта ножницами и отсепарована от склеры на 1 и 10 часах, в 3 мм от лимба в образовавшиеся окна установлены два порта 25G, введен световод, оптическая система операционного микроскопа сфокусирована на диске зрительного нерва (ДЗН), в 5 мм от которого в нижнетемпоральном направлении произведена субретинальная инъекция 50 мкл BSS при помощи субретинальной канюли 41G, операцию заканчивали наложением двух узловых швов (шелк 8/0) на склеру в месте установки портов.

У кроликов 2-й экспериментальной группы ход операции отличался тем, что устанавливался третий порт 25G на 17 часах, в который подключалась инфузионная система, и использовался витреотом 25G. После выполнения центральной витрэктомии витреальная полость прокрашена суспензией триамциналона, индуцирована отслойка задней гиалоидной мембраны, витрэктомия выполнена в максимально полном объеме. В 5 мм от ДЗН в темпоральном направлении с помощью канюли для субретинальных инъекций 41G произведена субретинальная инъекция 50 мкл BSS. Образовавшийся в результате инъекции «пузырь» отдавливали в сторону от места вкола при помощи ПФОС для предотвращения рефлюкса. Вокруг места введения проведена эндолазеркоагуляция. ПФОС удален методом пассивной аспирации и замещен BSS (рис. 1). Операцию заканчивали наложением трех узловых швов (шелк 8/0).

Рис. 1. Схема операции по моделированию повреждения РПЭ путем субретинального введения BSS на модели животного (а—д).

Операции в 3-й группе проводили аналогично со 2-й группой, однако вместо BSS вводили клеточную суспензию (50 тыс. клеток НП в 100 мкл PBS).

На 1, 3, 5, 15 и 21-й дни после операции проводилась офтальмоскопия, спектральная оптическая когерентная томография (ОКТ), коротковолновая аутофлюоресценция (АФ) BluePeak (BAF, 488 нм) и снимки в инфракрасном режиме (IR; Heidelberg Engineering GmbH, Германия).

Животных выводили из эксперимента методом воздушной эмболии под общим эфирным наркозом (согласно приказу Минвуза СССР №724 от 13.11.84).

Для получения флюоресцентно-меченных линий клеток для 3-й экспериментальной группы ранее установленные в ИОГен РАН линии ПСК человека рассевались на чашки Петри диаметром 35 мм, покрытые матригелем, в плотности примерно 2 тыс. клеток/см², и культивировались в ростовой среде TeSR E8 (StemCell Technologies, Канада) с добавлением 50 ед/мл пенициллина и 50 мкг/мл стрептомицина во влажной атмосфере при температуре 37 °C и 5% содержанием CO₂. При достижении клетками 40% плотности монослоя клетки были трансдуцированы лентивирусным вектором, содержащим GFP и/или RFP (CMV или EF1a соответсвенно). Трансдукция проводилась в присутствии полибрена (8 мкг/мл) с множественностью заражения 4. После культивирования клеток в течение нескольких дней колонии ПСК человека, имеющие наибольший процент светящихся клеток, были механически отобраны и размножены до количества 10⁶ клеток, после чего светящиеся клетки были отсортированы на сортере Sony SH800. Полученные линии ПСК человека были использованы для последующих экспериментов по дифференцировке и трансплантации. Выбор линии с тем или иным флюоресцентным маркером будет зависеть от технологии дальнейшего анализа трансплантированных клеток.

Дифференцировка нейрональных предшественников. 10⁶ ПСК в среде mTeSR1 (или TeSR E8) переносили в планшеты AggreWell400 (StemCell Technologies, Канада) в соответствии с рекомендациями производителя в присутствии Y27632 (StemCell Technologies, Канада). Через 24—48 ч сформированные эмбриоидные тельца переносили на пластик с низкой адгезией в среде с В27 и культивировали в присутствии 500 нг/мл Noggin и 29 нг/мл bFGF. Через 10—12 дней культивирование продолжали на адгезивном пластике, в Neurobasal medium с добавлением ITSF. Еще через 5—7 дней клетки пересевали на чашки, покрытые матригелем, в Neurobasal medium с добавкой В27, bFGF и EGF.

Иммуногистохимия была проведена согласно протоколу, предоставленному фирмой — производителем антител, с модификациями. Клетки выращивали в чашках Петри. При достижении клетками 80—90% монослоя их фиксировали 4% раствором параформальдегида (10 мин, 4 °C). После трехкратной промывки PBS клетки инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре в PBS, содержащем 0,2% Tween 20, 0,2% TritonX100 и 2% сыворотку крови козы. После этого образцы инкубировали с раствором первичных антител в PBS с 0,2% Tween 20 и 0,2% сывороткой крови козы (12 ч, 4 °C) в рекомендованных разведениях. Препараты три раза промывали PBS, вносили вторичные антитела к соответствующим иммуноглобулинам и инкубировали 30 мин при 37 °C.

Результаты и обсуждение

По результатам исследования в 1-й группе после субретинального введения раствора BSS без витрэктомии у трех кроликов на 2-й день операции была выявлена локальная отслойка нейроэпителия, у одного — тотальная отслойка, и еще у одного сетчатка прилежала. Однако в последующие дни у двух кроликов начались витреоретинальные пролиферативные процессы в виде грубой деструкции стекловидного тела, тяжей и тракций.

Полученные результаты показали, что проведение операции без предварительной витрэктомии у кроликов не позволяет эффективно выполнять субретинальные инъекции и повышает риск возникновения пролиферативных процессов в сетчатке. Это можно объяснить тем, что плотность стекловидного тела выше, чем плотность введенного раствора, а также тем, что стекловидное тело кролика плотно спаяно с сетчаткой.

На основании результатов офтальмоскопии, ОКТ и АФ 1-й группе кроликов гистологические исследования было решено не проводить.

Экспериментальная работа в двух других группах также сопровождалась рядом осложнений. Так, во 2-й и 3-й группах два кролика из 26 погибли: один — сразу после анестезии, другой — на 2-й день после операции. В эксперименте использовали 24 кролика (24 глаза). Однако в 10 глазах во время операции или в послеоперационный период возникли осложнения: гемофтальм интраоперационный — два глаза, гемофтальм послеоперационный — два, эндофтальмит — один, отслойка сетчатки — пять глаз.

Проблемы, которые возникали при операции, можно разделить на несколько групп:

— инструментарий, который используется для витреоретинальных операций на глазах человека, не в полной мере подходит для использования его у кроликов;

— хрусталик кроликов занимает ¹/₃ объема глаза, что ограничивает свободу хирургических манипуляций, есть вероятность повреждения хрусталика при операциях с доступом через pars plana;

— наличие третьего века у кролика, а также тонкая склера усложняют фиксацию портов, вследствие чего возможно смещение; это особенно опасно в месте ирригации, так как способно индуцировать отслойку сетчатки;

— сложности анестезиологического пособия, при котором кролик может совершать микродвижения. Если движение совпадает с субретинальным введением клеток, индуцированием задней отслойки стекловидного тела и другими манипуляциями вблизи сетчатки, возможно развитие гемофтальма, отслойки сетчатки или рефлюкса клеточного материала в витреальную полость;

— стекловидное тело плотно спаяно с сетчаткой в области ДЗН и его волокон, что не позволяет полностью его удалить.

Проведенное нами исследование подтвердило результаты других авторов, которые также продемонстрировали высокий риск отслойки сетчатки и пролиферативных процессов в сетчатке кроликов (в первую очередь, без предварительной витрэктомии, а также, в меньшей степени, в глазах с витрэктомией) при субретинальном введении BSS для формирования модели дегенерации сетчатки [3].

Таким образом, из 26 кроликов удалось проанализировать результаты АФ и ОКТ для пяти глаз из 2-й группы и девяти глаз из 3-й группы.

По данным офтальмоскопии и ОКТ, у кроликов 2-й и 3-й групп с витрэктомией, введением BSS/НП и лазеркоагуляцией вокруг места вкола на 1—3-й день после операции на глазном дне видны локальная отслойка нейроэпителия, расположенная возле места вкола, и небольшой разрыв сетчатки (место вкола), окруженный лазеркоагулятами. На 5—21-й день в зоне инъекции отмечаются прилегание локальной отслойки нейроэпителия, атрофия сетчатки разной степени выраженности.

По данным ОКТ во 2-й группе на 1-й и 3-й дни после операции в области образованного пузыря визуализируется гиперрефлективная зона, соответствующая введенному клеточному материалу. Интактные слои сетчатки и комплекс «РПЭ — МБ» рядом с введенным BSS не изменены. На 5-й день отмечена дезорганизация эллипсоидной зоны, наружных сегментов ФР, на 15-й день — локальное истончение всех слоев сетчатки, атрофия наружных слоев сетчатки, слои не дифференцируются. На 21-й день выявлена атрофия всех слоев сетчатки, дезорганизация комплекса «ФР — РПЭ — МБ», уплотнение внутренней пограничной мембраны (рис. 2).

Рис. 2. BAF (а), снимки глазного дна в инфракрасном режиме и ОКТ-срез сетчатки кролика (б) на 21-й день после субретинального введения BSS.

а — гипоаутофлюоресценция, соответствующая атрофии клеток РПЭ; б — инфракрасная АФ демонстрирует выраженную гиперрефлективную область. Желтые стрелки указывают на место вкола и субретинального введения BSS, окруженного лазеркоагулятами, соответствующее первоначальному субретинальному пузырю. Белые стрелки соответствуют переходной зоне нормальной сетчатки в атрофичную.

В 3-й группе после субретинального введения НП во все дни исследования по данным ОКТ отмечена гиперрефлективная зона на уровне комплекса «РПЭ — МБ», соответствующая месту введения НП (рис. 3). Наблюдается увеличение толщины среза сетчатки за счет введенных НП, хориоидея на всем протяжении не изменена. Слои сетчатки и комплекс «РПЭ — МБ» рядом с гиперрефлективной зоной не изменены. На 3-й день наблюдения в месте локализации введенных НП все слои сетчатки структурны, дифференцируются, гиперрефлективны. На 5-й день наружные слои менее структурны, дезорганизация комплекса «РПЭ — МБ», внутренние слои сохранены на всем протяжении. На 15-й и 21-й дни в гиперрефлективной области отмечается дезорганизация эллипсоидной зоны с дальнейшей ее потерей, наружная пограничная мембрана не визуализируется, на сканах отмечены мелкие гиперрефлективные точки во внутренних слоях, возможно, представляющие собой мигрирующий пигмент из РПЭ. Внутренние слои сетчатки теряют четкую структурность. По данным BAF во все дни наблюдения периферийнее места вкола, окруженного лазеркоагулятами, прослеживается зона гипераутофлюоресценции с краевой гипоаутофлюоресценцией, соответствующая описанным изменениям на ОКТ.

Рис. 3. BAF (а), инфракрасная АФ (б) и ОКТ-срез (в) сетчатки кролика на 3, 5, 15, 21-й дни после субретинального введения НП.

а — BAF: гипоаутофлюоресценция, соответствующая атрофии клеток РПЭ в месте инъекции и ЛКС, гипераутофлюоресцентный сигнал в месте локализации НП; б — снимок глазного дна в инфракрасном режиме демонстрирует выраженную гипорефлективную область в месте инъекции и ЛКС, над ней область с гиперрефлективной границей, соответствующая НП; в — ОКТ-срез сетчатки: на уровне комплекса «РПЭ — МБ» визуализируется гиперрефлективный комплекс, соответствующий НП. Подробное описание в тексте.

Снимок глазного дна в инфракрасном режиме демонстрирует выраженную гипорефлективную область в месте инъекции и лазеркоагуляции сетчатки (ЛКС), над ней — гиперрефлективная область с краевой гипорефлективностью, соответствующая НП.

Лечение дегенеративно-дистрофических заболеваний сетчатки на сегодняшний день остается одной из важных проблем, которая требует изучения. Как уже было отмечено, наиболее многообещающим методом лечения считается трансплантация СК. Для адекватного понимания эффективности трансплантации и интеграции СК в субретинальное пространство необходимо, в первую очередь, создать модель повреждения сетчатки, близкую по характеристикам клиническим случаям. Однако существующие модели повреждения имеют некоторые недостатки.

Проведенное нами исследование подтвердило результаты предыдущих авторов, при которых трансвитреальное введение BSS приводит к дегенерации сетчатки, однако в их работах риск отслойки сетчатки и пролиферативных процессов в ней без предварительной витрэктомии был высокий. Такие же результаты были получены нами в данной работе в 1-й экспериментальной группе.

В исследованиях 2-й экспериментальной группы мы продемонстрировали новый способ моделирования повреждения РПЭ, показав, что удаление СТ во время операции может уменьшить риск послеоперационных осложнений, а введение ПФОС позволяет нивелировать обратный рефлюкс введенного раствора в стекловидное тело и сместить пузырь дальше от места вкола и, таким образом, тампонировать его. Лазеркоагуляция сетчатки вокруг места вкола «закрывает» отверстие и позволяет предупредить отслойку сетчатки в месте инъекции. Последующее удаление ПФОС необходимо для исключения дополнительного токсического воздействия на сетчатку, повышения внутриглазного давления и затруднения визуализации в послеоперационном периоде при проведении, офтальмоскопии, спектральной ОКТ и АФ. Однако нами было показано, что витреоретинальная хирургия на глазу кролика может сопровождаться рядом осложнений, что также было отмечено некоторыми авторами и является важной информацией для исследователей.

Было выявлено, что введение BSS во 2-й группе приводит к полной атрофии слоев сетчатки. Другие авторы также отмечают, что даже при использовании изотонических растворов для создания субретинального пузыря выявляются индуцированные инъекцией повреждения наружных слоев сетчатки [9, 12]. На модели кролика было показано, что сила, прилагаемая для ослабления адгезии нейросенсорной сетчатки, достаточна для создания ультраструктурных изменений ФР и РПЭ [13].

Учитывая, что более ранние исследования показали безуспешность правильной интеграции чЭСК-РПЭ без достаточной сохранности субретинальной среды [10], а также то, что сама субретинальная инъекция может привести к травме РПЭ и ФР, нами был выбран способ одновременного субретинального введения PBS и клеточной суспензии НП. Было показано, что в 3-й группе после субретинального введения НП в течение всего периода наблюдения, по данным ОКТ, сохранялась гиперрефлективная зона на уровне комплекса «РПЭ — МБ», соответствующая месту введения НП. В то же время были отмечены истончение наружных слоев сетчатки и частичная потеря клеток РПЭ и ФР, вероятно, в результате механического повреждения, но в значительно меньшем объеме, чем во 2-й группе на протяжении 21 дня наблюдения.

Подобные изменения были описаны и другими авторами. В эксперименте на кролике субретинальная инъекция только PBS приводила к фенотипу географической атрофии, при этом долгосрочная интеграция трансплантированной суспензии чЭСК-РПЭ способствовала сохранению наружного ядерного слоя и общей толщины наружной сетчатки [9, 14].

В результате наследственной дистрофии, возрастной или моделированной в эксперименте дегенерации наружных слоев сетчатки происходит повреждение и гибель ряда специализированных клеток нейроэпителия сетчатки глаза. Сохранность зрительного нерва и потенциально возможное восстановление физиологических взаимосвязей между различными типами клеток сетчатки свидетельствуют в пользу применения заместительной терапии поврежденных клеточных структур. Источником материала для заместительной терапии в этом случае могут служить неспециализированные клетки нейроэпителия, которые обладают дифференцировочным потенциалом для формирования таких типов клеток, как клетки РПЭ и ФР. В связи с этим является целесообразным дальнейшее изучение влияния дифференцированных in vitro НП, полученных из иПСК человека, при повреждении РПЭ и ФР.

Выводы

1. Субретинальное введение BSS без предварительной витрэктомии в эксперименте приводит к неконтролируемым осложнениям в виде отслойки сетчатки и пролиферативным процессам.

2. Предложенный новый способ субретинального введения BSS позволяет экспериментально моделировать дегенерацию РПЭ с последующей дегенерацией всех слоев сетчатки и уменьшить возможные послеоперационные осложнения до 45%, что повышает эффективность исследования.

3. Субретинальное введение культуры НП, дифференцированных из иПСК человека, в эксперименте может служить универсальной моделью для исследования выживания и интеграции СК.

4. Субретинальное введение культуры НП, дифференцированных из иПСК человека, в эксперименте приводит к формированию и сохранению по данным ОКТ гиперрефлективной зоны на уровне комплекса «РПЭ—МБ», соответствующей месту введения НП, на фоне частичной потери наружных слоев сетчатки, но в меньшем объеме по сравнению с введением BSS.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования: Н.Ш., С.К., А.М.

Сбор и обработка материала: А.М., А.П., Н.А., А.А.

Статистическая обработка данных: А.М., Н.Ш.

Написание текста: А.М., Н.Ш., С.К.

Редактирование: Н.Ш., Н.А., А.А., А.П., С.К.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.