Развитие и прогрессирование диабетической ретинопатии (ДР) вызвано хронической гипергликемией. Доказано, что инсулинотерапия способствует более эффективному контролю гликемии в сравнении с пероральными сахароснижающими препаратами. Многочисленные рандомизированные клинические исследования показывают, что ранняя интенсификация гликемического контроля снижает частоту и степень прогрессирования ДР в отдаленные периоды заболевания [1—6].

Тем не менее интенсивная инсулинотерапия, приводящая к быстрому и сильному снижению концентрации глюкозы в крови, может вызывать раннее усугубление ДР. В этом контексте термин «ранний» относится к прогрессированию ДР после усиления гликемического контроля, а не к короткой продолжительности сахарного диабета (СД).

Это явление было впервые описано в 1980-х годах у пациентов с СД 1-го типа, которых после терапии инсулином короткого или промежуточного действия перевели на интенсивную непрерывную подкожную инфузию инсулина [7—9].

Морфологические изменения сетчатки, которые были описаны при раннем усугублении ДР после интенсификации гликемического контроля, включали в себя мягкие экссудаты, интраретинальные микрососудистые аномалии, интраретинальные кровоизлияния, макулярный отек, неоваскуляризацию [9, 10].

В последующем результаты множества клинических исследований доказали, что интенсификация гликемического контроля у пациентов с плохо контролируемым СД 1-го и 2-го типа, сопровождающаяся резким снижением уровня HbA1c, приводит к раннему усугублению ДР [11, 12].

Так, в первый год исследования по контролю диабета и его осложнений (DCCT) раннее усугубление ДР выявлялось в 2 раза чаще в группе интенсивной инсулинотерапии (13,1%) по сравнению с группой пациентов, получавших традиционное лечение (7,6%) [10].

Актуальность раннего ухудшения ДР на фоне интенсификации инсулинотерапии у пациентов с СД 1-го типа была подтверждена в обзоре Кокрановского сотрудничества [13], который включал 2230 пациентов в рамках 12 исследований со средним периодом наблюдений в диапазоне от 1 года до 6 лет.

В ретроспективном исследовании A. Shurter и соавт. [12] доказали, что интенсификация гликемического контроля, сопровождающаяся резким изменением уровня HbA1c при плохо контролируемом СД 2-го типа, может приводить к раннему усугублению ДР.

Согласно большинству публикаций, раннее усугубление ДР развивается после начала инсулинотерапии — в срок от 3 мес до 3 лет после начала интенсификации гликемического контроля — и носит транзиторный характер [8—11]. Например, в исследовании по контролю диабета и его осложнений (DCCT) более чем у половины пациентов с проявлениями раннего усугубления ДР через 18 мес от начала исследования была отмечена ее регрессия, сохраняющаяся и в более отдаленные сроки [10].

Интересно и то, что научное сообщество не выработало единого мнения относительно способности пероральных сахароснижающих препаратов вызывать ранее усугубление ДР, в то время как способность инсулина усугублять состояние сетчатки не вызывает сомнений. Тем не менее механизм, приводящий к этому явлению, остается предметом дискуссий. Ряд ученых считают, что инсулин, способствуя повышению концентрации сосудистого эндотелиального фактора роста (vascular endothelial growth factor, VEGF), приводит к нарушению гематоретинального барьера и раннему усугублению ДР [14—17].Ранее нам также удалось доказать, что инсулинотерапия в течение 1 мес от ее старта вызывает увеличение концентрации VEGF-A во внутриглазной жидкости (ВГЖ) крыс с аллоксановой моделью СД [18]. Даже принимая во внимание способность инсулина вызывать гиперэкспрессию VEGF, остается неясным, почему раннее усугубление ДР носит транзиторный характер.

Цель исследования — изучить изменение концентрации VEGF-A в ВГЖ крыс с аллоксановой моделью СД в разные сроки инсулинотерапии.

Материал и методы

Эксперименты выполнены с соблюдением принципов гуманности, изложенных в директивах Европейского общества и Хельсинкской декларации, в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных».

Для проведения экспериментов были использованы беспородные крысы, которых содержали в индивидуальных клетках при температуре 20—26 °C на стандартном рационе со свободным доступом к воде.

В обоих экспериментах СД моделировали однократным внутрибрюшинным введением аллоксана гидрата (La Chema, Чехия) в дозе 100 мг/кг в 0,4 мл раствора цитратного буфера. Все животные в течение 24 ч до начала эксперимента не получали пищу, но имели свободный доступ к воде. Установление диабетического статуса проводили через 7 дней после внутрибрюшинного введения аллоксана моногидрата. Для этого определяли концентрацию глюкозы в крови, взятой из хвостовой вены крыс. Животные с уровнем глюкозы в крови ниже 13 ммоль/л исключались из экспериментов.

Первый эксперимент проводили на 80 крысах. У 65 крыс моделировали аллоксановую модель СД. За первые 7 дней после введения аллоксана моногидрата погибло 20 крыс. В исследовании осталось 45 экспериментальных животных с СД и 15 здоровых крыс. Экспериментальных животных изучали в трех группах. Основную группу (n=21) составили животные с аллоксановой моделью СД, которым через 3 сут после введения аллоксана моногидрата и определения диабетического статуса было начато ежедневное однократное внутрибрюшинное введение инсулина продленного действия в терапевтической дозе 0,9 Ед/кг массы тела. Группу сравнения (n=24) составили животные с аллоксановой моделью СД, которые не получали специфическую терапию. Общую для двух экспериментов контрольную группу (n=15) составили здоровые животные, которые не получали специфическую терапию.

Экспериментальные животные были выведены из исследования через 1 мес после старта инсулинотерапии. К концу эксперимента основная группа насчитывала 17 крыс, группа сравнения — 20, контрольная группа — 15.

Второй эксперимент проводили на 132 крысах, которым моделировали аллоксановую модель СД. За первые 7 дней после введения аллоксана моногидрата погибло 33 крысы; таким образом, в исследовании осталось 99 экспериментальных животных с СД. Экспериментальных животных изучали в двух группах. Основную группу (n=50) во втором эксперименте составили животные с аллоксановой моделью СД, которым через 7 дней после введения аллоксана моногидрата и определения диабетического статуса было начато ежедневное однократное внутрибрюшинное введение инсулина продленного действия в терапевтической дозе 0,9 Ед/кг массы тела. Группу сравнения (n=49) составили животные с аллоксановой моделью СД, которые не получали специфическую терапию.

За 5 дней до окончания эксперимента у всех животных основной группы (n=30) и группы сравнения (n=30) была определена концентрация глюкозы в крови, взятой из хвостовой вены. Животные основной группы не получали инсулин за 48 ч до забора крови. У 12 крыс из основной группы и 14 крыс из группы контроля концентрация глюкозы в крови была ниже 13 ммоль/л, эти животные были выведены из исследования. Таким образом, к концу второго эксперимента основная группа насчитывала 18 крыс, группа сравнения — 16. Экспериментальные животные были выведены из исследования через 4 мес после старта инсулинотерапии.

В обоих экспериментах из глаз каждого животного был произведен забор ВГЖ в количестве 70—90 мкл, образцы были помещены в индивидуальные пробирки Эппендорфа для последующего анализа. Концентрация VEGF-A определялась в лаборатории Чебоксарского филиала ФГАУ НМИЦ «МНТК "Микрохирургия глаза" им. акад. С. Н. Федорова» методом иммуноферментного анализа с использованием тест-системы ELISA Kit for Vascular Endothelial Growth Factor A (Cloud-Clone Corp., США).

Поскольку полученные цифровые данные не подчинялись нормальному распределению, статистическую обработку и выявление статистической значимости проводили непараметрическим методом при помощи критерия Краскела—Уоллиса и критерия Манна—Уитни с поправкой Бонферрони в программе IBM SPSS Statistics 20. Данные представлены в виде медианы (Me) [25-го; 75-го перцентилей].

Результаты

На сроке инсулинотерапии 1 мес (первый эксперимент) в основной группе (n=17) концентрация VEGF-A в ВГЖ составила 140 [136; 210] пг/мл, в группе сравнения (n=20) — 72 [58; 86] пг/мл, в контрольной группе (n=15) — 76 [62,5; 88] пг/мл.

При помощи критерия Краскела—Уоллиса были установлены статистически значимые различия исследуемых групп по концентрации VEGF-A в ВГЖ (p_k<0,0001; рис. 1).

Рис. 1. Сравнение концентрации VEGF-A в ВГЖ крыс в исследуемых группах через 1 мес инсулинотерапии, пг/мл, Me [25-й; 75-й перцентили].

Парные сравнения с помощью критерия Манна—Уитни с поправкой Бонферрони показали, что значения концентрации VEGF-A в ВГЖ в основной группе была статистически значимо выше, чем в группе сравнения (p_m-u<0,0004) и в контрольной группе (p_m-u=0,0045). Группа сравнения не имела статистически значимых различий при сравнении с контрольной группой (p_m-u=0,9979).

На сроке инсулинотерапии 4 мес (второй эксперимент) в основной группе (n=18) концентрация VEGF-A в ВГЖ составила 84,8 [61,1; 93,2] пг/мл, в группе сравнения (n=16) — 66,4 [54,4; 73,75] пг/мл.

Сравнение исследуемых во втором эксперименте групп и общей группы контроля при помощи критерия Краскела—Уоллиса и парные сравнения при помощи критерия Манна—Уитни с поправкой Бонферрони не показали статистически значимых различий по концентрации VEGF-A в ВГЖ (рис. 2).

Рис. 2. Сравнение концентрации VEGF-A в ВГЖ крыс в исследуемых группах через 4 мес инсулинотерапии, пг/мл, Me [25-й; 75-й перцентили].

Для выявления изменения концентрации VEGF-A в ВГЖ крыс на различных сроках СД и инсулинотерапии был проведен статистический анализ следующих групп: общая группа контроля, основная группа на сроке инсулинотерапии 1 мес и основная группа на сроке инсулинотерапии 4 мес. При помощи критерия Краскела—Уоллиса были установлены статистически значимые различия исследуемых групп (p_k=0,0004). Парные сравнения с помощью критерия Манна—Уитни с поправкой Бонферрони показали, что значение концентрации VEGF-A в ВГЖ в основной группе через 1 мес статистически значимо повышается по сравнению с контрольной группой, но через 4 мес в основной группе она статистически достоверно снижается и не отличается от таковой в группе контроля (рис. 3).

Рис. 3. Сравнение концентрации VEGF-A в ВГЖ крыс на различных сроках СД и инсулинотерапии, пг/мл, Me [25-й; 75-й перцентили].

Для выявления изменения концентрации VEGF-A в ВГЖ крыс на различных сроках СД без инсулинотерапии был проведен статистический анализ следующих групп: общая группа контроля, группа сравнения на сроке наблюдения 1 мес и группа сравнения на сроке наблюдения 4 мес. Сравнение исследуемых групп при помощи критерия Краскела—Уоллиса не показало статистически значимых различий по концентрации VEGF-A в ВГЖ (p_k=0,7955). Парные сравнения с помощью критерия Манна—Уитни с поправкой Бонферрони показали, что значения концентрации VEGF-A в ВГЖ крыс на различных сроках СД без инсулинотерапии постепенно снижаются, но не достигают уровня статистической значимости (рис. 4).

Рис. 4. Сравнение концентрации VEGF-A в ВГЖ крыс на различных сроках СД без инсулинотерапии, пг/мл, Me [25-й; 75-й перцентили].

Обсуждение

Научное сообщество выдвинуло несколько теорий развития раннего усугубления ДР у пациентов с СД после быстрого и значительного снижения концентрации сахаров в крови.

Синергетическая теория основана на том, что глюкоза является осмотически активной молекулой и может влиять на задержку воды в сосудистом русле. Уменьшение ее концентрации снижает внутрисосудистое осмотическое давление. Это создает градиент между плазмой крови и межклеточной жидкостью с последующим выходом воды в сетчатку и формированием макулярного отека [19]. Эта теория не способна объяснить развитие интраретинальных микроваскулярных аномалий и неоваскуляризации, характерных для ДР.

Согласно осмотической теории, аномально высокая концентрация VEGF совместно с инсулином воздействуют на эндотелий капилляров, вызывая пролиферацию сосудов и прогрессирование ДР [19].

Энергетическая теория основана на эксперименте A. Kennedy и R.N. Frank [20], которые in vitro на культуре ретинальных клеток человека и быка доказали, что в условиях гипоксии снижение концентрации глюкозы значительно увеличивает экспрессию VEGF с последующим повышением проницаемости капилляров и развитием ретинопатии. Авторы считают, что при ДР в условиях гипоксии энергетические потребности сетчатки обеспечиваются высокой концентрацией глюкозы в крови. Снижение концентрации глюкозы, остающейся основным поставщиком энергии, вызывает экспрессию VEGF в качестве компенсаторного механизма восполнения энергии путем ангиогенеза.

Синергетическая и энергетическая теории объясняют развитие интраретинальных микрососудистых аномалий, микроаневризм и неоваскуляризации, характерных для препролиферативной и пролиферативной стадий ДР. Данные теории объясняют более высокую частоту раннего ухудшения состояния сетчатки после начала инсулинотерапии у пациентов с развитыми стадиями диабетического поражения глаз, но не объясняют ухудшение состояния сетчатки у пациентов без признаков ДР к моменту перевода на инсулин.

Четвертая теория развития раннего усугубления ДР была предложена V. Poulaki и соавт. [14], она заключается в том, что инсулинотерапия через p38 MAPK и фосфоинозитид-3-киназу (PI3Ks) приводит к повышению ядерной концентрации индуцируемого гипоксией фактора 1a (HIF-1a) и увеличивает его способность связываться с VEGF promoter, в результате чего усиливается экспрессия VEGF. В исследовании in vivo авторы доказали, что высокая концентрация VEGF приводит к клинически значимому нарушению гематоретинального барьера у крыс со стрептозотоциновой моделью СД.

Таким образом, из четырех предложенных теорий три сходятся в том, что отличительным признаком раннего усугубления ДР является повышение концентрации VEGF на фоне начала инсулинотерапии.

Проведя два одинаковых по дизайну эксперимента, различающихся лишь сроком инсулинотерапии, нам удалось доказать, что инсулин у крыс с аллоксановой моделью СД приводит к статически значимому повышению концентрации VEGF-A в ВГЖ через 1 мес. Это явление носит временный характер, и уже через 4 мес инсулинотерапии концентрация VEGF-A в ВГЖ статистически значимо снижается до исходных величин.

По нашему мнению, открытие временного характера гиперэкспрессии VEGF-A в ответ на инсулинотерапию может объяснить транзиторный характер раннего усугубления ДР.

Заключение

Инсулинотерапия у крыс с аллоксановой моделью СД приводит к статически значимому повышению концентрации VEGF-A в ВГЖ через 1 мес, однако это явление носит транзиторный характер и через 4 мес инсулинотерапии концентрация VEGF-A снижается до исходных величин. Развитие аллоксановой модели СД в указанные сроки не приводит к статически значимому изменению концентрации VEGF-A в ВГЖ по сравнению со здоровыми животными.

Работа выполнена при поддержке Гранта РФФИ №18-315-00029.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования: Б.Г.

Сбор и обработка материала: Б.Г., И.О.Х.А.Д.

Статистическая обработка данных: Б.Г.

Написание текста: Б.Г.

Редактирование: Н.П.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.