Одной из наиболее распространенных причин необратимого снижения зрения у лиц старше 50 лет является возрастная макулярная дегенерация (ВМД), характеризующаяся хроническим течением и двусторонним вовлечением центральных отделов сетчатки, при этом многие вопросы этиологии и патогенеза ВМД остаются неизученными, хотя и установлен ряд факторов, предрасполагающих к развитию заболевания [1]. В то же время имеющиеся средства и методы профилактики и лечения ВМД не позволяют обеспечить полноценное восстановление функции сетчатки, а наблюдаемые эффекты препаратов, за исключением ингибиторов ангиогенеза, применяемых в поздних стадиях заболевания, по результатам разных исследований, незначительны или носят противоречивый характер [2].

В качестве перспективного направления в лечении ВМД и других заболеваний сетчатки с хроническим прогрессирующим течением рассматривается нейропротекторная (ретинопротекторная) терапия, основными целями которой являются защита нейрональных структур сетчатки от повреждения и обеспечение полноценного восстановления функции и структуры ткани [3]. Используемые для ретинопротекции препараты относятся к различным фармакологическим группам и имеют различные точки приложения. В России из ретинопротекторных препаратов наибольшее распространение в клинической практике получила группа пептидных биорегуляторов, в частности ретиналамин [4, 5].

Ранее нейропротекторные эффекты ретиналамина изучались и были описаны в ряде экспериментальных и клинических исследований. В частности, авторами исследований сообщалось об ускорении закрытия клетками пигментного эпителия сетчатки (ПЭС) экспериментально индуцированных дефектов сетчатки, снижении степени угнетения функционального состояния сетчатки, митогенных эффектах в культурах клеток со стимуляцией пролиферации и дифференцировки клеток [5—8]. Тем не менее точные механизмы действия препарата остаются неизвестными, а объем клинических исследований эффектов ретиналамина при ВМД значительно преобладает над количеством экспериментальных исследований.

Цель исследования — изучить функциональные и морфологические эффекты применения пептидного биорегулятора (ретиналамин) при моделировании фотохимического повреждения сетчатки кролика.

Материал и методы

Животные. Исследование выполнено на 36 кроликах (72 глаза) породы шиншилла (самцы массой 2,0—2,3 кг). В период исследования животные содержались в условиях 12-часовой циклической смены дня и ночи (при смене освещенности 200—300 лк/15—20 лк), имели достаточный доступ к воде и корму, при этом все эксперименты были проведены в соответствии с международными рекомендациями по работе с лабораторными животными, Стокгольмской декларацией о гуманном обращении с лабораторными животными и одобрены локальным этическим комитетом ФГБУ «Государственный научно-исследовательский испытательный институт военной медицины» Минобороны России.

Всех животных рандомизировали в четыре равные группы по 9 животных (18 глаз) — две опытные группы и две контрольные. В группе Опыт 1 (О1) введение препарата начинали с 1-го дня воздействия, в группе Опыт 2 (О2) на 10-е сутки эксперимента соответственно (с начала светового воздействия). В группах Контроль 1 и Контроль 2 (К1 и К2) соответственно с 1-го и 10-го дня эксперимента вводили изотонический раствор натрия хлорида. С целью ослепления исследования все животные перед рандомизацией были промаркированы с присвоением порядкового номера, не связанного с отнесением к той или иной группе; сотрудники, выполнявшие электрофизиологические и морфологические исследования, не были осведомлены о принадлежности обследуемого животного к той или иной группе (опытной или контрольной).

Введение исследуемого препарата. В опытных группах препарат пептидного биорегулятора ретиналамин («Герофарм», Россия) вводили парабульбарно в дозе 0,25 мг/кг массы животного в каждый глаз (суммарно каждому кролику ежедневно 0,5 мг/кг массы животного). Лиофилизат в каждой ампуле препарата (5 мг) перед введением растворяли в 4 мл изотонического раствора натрия хлорида. В контрольных группах осуществляли парабульбарное введение изотонического раствора натрия хлорида в эквивалентном объеме (по 0,2 мл на каждый глаз). Введение в каждой группе осуществляли ежедневно в течение 10 дней 1 раз в сутки по завершении очередного сеанса светового воздействия.

Световое воздействие на животных. Фотохимическое повреждение сетчатки моделировали в условиях наркоза (ксилазин 5 мг/кг и кетамина гидрохлорид 35 мг/кг внутримышечно за 15 мин до манипуляций), мидриаза (циклопентолат 1%), местной анестезии (оксибупрокаина гидрохлорид 0,4%) и наложения векорасширителя. Засвет центральных отделов сетчатки (до 50° поля зрения) осуществляли с помощью расфокусированного посредством оптической системы луча диодного лазера с длиной волны 405 нм, плотностью энергии у поверхности роговицы 5 мВт/см² в режиме непрерывной генерации и экспозиции 4 ч (с 11:00 до 15:00). Воздействие на оба глаза одновременно осуществляли у всех животных ежедневно в течение 20 сут, при этом животные вне воздействия находились в условиях 12-часовой смены светового и темнового периода (9:00 и 21:00). В период воздействия глазную поверхность увлажняли 0,3% раствором гипромелозы.

Методы электрофизиологического исследования. Для оценки биоэлектрической активности сетчатки проводили регистрацию ритмической и мультифокальной электроретинограммы (рЭРГ и мфЭРГ соответственно) с помощью соответствующих модулей электрофизиологического комплекса «Нейро-ЭРГ» (ООО «Нейрософт», Россия) в соответствии со стандартами ISCEV [9, 10]. Исследование осуществляли в условиях наркоза (ксилазин 5 мг/кг и кетамина гидрохлорид 35 мг/кг внутримышечно за 15 мин до манипуляций) и медикаментозного мидриаза (инстилляция циклопентолата 1% в конъюнктивальный мешок). Животных помещали в специальный бокс, позволявший мягко фиксировать голову наркотизированного животного в заданном положении. В качестве активного (роговичного) электрода использовали ретинографический электрод «крючок», закрепляя его за нижнее веко в условиях местной анестезии (оксибупрокаина гидрохлорид 0,4%). Референтный и заземляющий электроды располагали на ушных раковинах. Сопротивление под электродами не превышало 0,3 кОм.

Регистрацию рЭРГ проводили после световой адаптации в течение 15 мин. Стимуляцию осуществляли ганцфельд-стимулятором с частотой 30 Гц и интенсивностью вспышек 3 кд·с/м^–2. При анализе учитывали результаты 30 усреднений и анализировали амплитуду ответа (мкВ).

При регистрации мфЭРГ световую стимуляцию проводили на расстоянии 25 см с использованием паттерна высокого разрешения с ячейками паттерна гексагональной формы (61 гексагон в паттерне), охватывающего 30° поля зрения. Кролика располагали перед паттерн-стимулятором так, чтобы центр роговицы находился напротив фиксационной метки стимулятора, а плоскость монитора стимулятора была параллельна фронтальной плоскости глазного яблока, при этом стабильность фиксации и расположения в течение каждого сеанса регистрации контролировали с помощью видеокамеры. Для визуализации стимулируемого участка сетчатки производили съемку на фундус-камере Topcon TRC300CW (Topcon, Япония), при этом диск зрительного нерва занимал положение 12 ч условного циферблата как на фото, так и на записи мфЭРГ. Коэффициент усиления сигнала составил 50 000, полоса пропускания усилителя — 2—200 Гц. М-последовательность представляла собой псевдослучайное предъявление темного или светлого стимула в гексагоне с частотой 75 Гц при средней яркости стимула 16,6 кд/м² и контрастности 99,3%. Время записи в каждом сегменте составляло 13,65 с, всего было усреднено 511 стимулов М-последовательности. При анализе в ответе первого порядка оценивали амплитуду (нВ) пиков P1 и N1, ретинальную плотность биоэлектрической ответа пика P1 (нВ/град²), сравнивая усредненные по всему паттерну значения.

Регистрацию электрофизиологических показателей у всех животных осуществляли перед началом воздействия, через 10, 20 и 30 сут после начала светового воздействия.

Морфологическое исследование. Для морфологического исследования в каждой группе выводили по три кролика (шесть глаз) на 10, 20 и 30-е сутки эксперимента. После эвтаназии путем передозировки наркоза забирали глазные яблоки животных, фиксировали в 10% нейтральном растворе формалина и подвергали гистологической проводке с заливкой в парафиновые блоки по стандартному протоколу и последующим приготовлением серийных срезов толщиной 5 мкм, которые затем окрашивали гематоксилином и эозином. При световой микроскопии оценивали характер изменений структуры сетчатки, подсчитывали среднее количество ядер в наружном ядерном слое (НЯС; фоторецепторы). В качестве гистологического контроля использовали серийные срезы сетчатки шести интактных глаз кроликов, не задействованных в эксперименте, при этом порядок подготовки и окрашивания срезов не отличался от используемого в исследовании.

TUNEL. Для оценки апоптотической гибели клеток сетчатки применяли окраску методом TUNEL (Terminal deoxynucleotided transferase-mediated dUTP-biotin Nick-End Labeling), позволяющего посредством специфического связывания терминальной деоксинуклеотидилтрансферазы с 3’-концом нити ДНК верифицировать фрагменты ДНК, распадающейся под действием Mg²⁺/Ca²⁺-зависимых эндонуклеаз [11]. Окрашивание проводили с помощью набора Click-iT™ TUNEL Colorimetric IHC Detection Kit в соответствии с инструкцией изготовителя (Thermo Fisher Sciencific, США) с использованием в качестве хромогена 3,3’ диаминобензидина (DAB). Качество окрашивания оценивали по контрольным препаратам в составе набора.

Количественная оценка морфологических изменений. Для количественного анализа из каждого глазного яблока изготавливали пять срезов, выполняя их с интервалом 40 мкм в вертикальном направлении, так чтобы они проходили через зрительный нерв и перпендикулярно сосудистым пучкам. Подсчет клеток в каждом срезе осуществляли в трех полях зрения при увеличении 400, при этом учитывали клетки на участке протяженностью 5 мм ниже диска зрительного нерва (на уровне зрительной полоски — области центрального наилучшего видения у кроликов). Для анализа использовали средние показатели общего количества клеток в НЯС и внутреннем ядерном слое (ВЯС) сетчатки в поле зрения (кл/пз) и долю апоптотических клеток в них (%).

Статистический анализ. Анализ результатов производили в пакете программ Statistica 10.0 (Stat Soft Inc., США) с помощью непараметрических методов. Результаты представлены в виде M±SD. Анализ различия значений показателей в разные периоды тестирования проводили с использованием критерия Вилкоксона. При сравнении значений между опытными и контрольными группами использовали U-критерий Манна—Уитни. Статистически достоверными считали результаты с уровнем значимости меньше 0,05.

Результаты

Офтальмоскопически наблюдаемые изменения сетчатки. У животных из разных групп офтальмоскопически видимые изменения в форме перераспределения пигмента преимущественно в центральных отделах глазного дна были отмечены на 6—10-е сутки светового воздействия, при этом участки гипер- и депигментации были более заметны у кроликов с изначально менее пигментированным глазным дном (рис. 1). Площадь и наблюдаемая интенсивность перераспределения пигмента изменялись, преимущественно нарастая, на протяжении всего периода эксперимента, в том числе после завершения светового воздействия (период 21—30-х суток эксперимента).

Рис. 1. Примеры динамики дегенеративных изменений на глазном дне в течение эксперимента в разных группах.

Функциональные изменения сетчатки. При регистрации мфЭРГ во всех группах (опытных и контрольных) было отмечено значимое снижение амплитуды пиков N1 и P1, а также ретинальной плотности биоэлектрического ответа компонента P1 на 10-е и 20-е сутки от начала светового воздействия (p<0,001 при сравнении со значениями фона во всех группах) и незначимое увеличение показателей на 30-е сутки эксперимента при сравнении со значениями, зарегистрированными на 20-е сутки воздействия (см. таблицу). Амплитуда и ретинальная плотность биоэлектрического ответа пиков, снижаясь по всей площади стимулируемой сетчатки, изменялись неравномерно в различных участках сетчатки (рис. 2).

Динамика исследуемых показателей мфЭРГ в группах

Рис. 2. Примеры динамики ретинальной плотности биоэлектрического ответа компонента Р1 (нВ/град²) в течение эксперимента при регистрации мфЭРГ у животных из разных групп.

Цветовая шкала не является единой для всех представленных графиков, каждому 3D-графику соответствует своя шкала.

Попарное сравнение показателей между опытными и контрольными группами, а также между двумя опытными группами в разные периоды регистрации не выявило значимых различий в усредненных по всему стимулируемому паттерну значениях амплитуды и ретинальной плотности ответа пиков P1 и N1 (p>0,05).

При регистрации рЭРГ в ответ на световую стимуляцию с частотой 30 Гц во всех группах наблюдалось значимое снижение амплитуды ответа на 10-е и 20-е сутки засвета с незначительным (и не значимым) увеличением на 30-е сутки эксперимента (см. таблицу), при этом между опытными и контрольными группами не было выявлено значимых различий амплитуды регистрируемого ответа (p>0,05).

Морфологические изменения в сетчатке. В глазах, забранных на 10-е сутки воздействия, были выявлены дегенеративные изменения сетчатки в форме вакуолизации и фрагментации наружных сегментов фоторецепторов, уменьшения толщины НЯС (рис. 3, а) за счет значимого снижения количества клеток фоторецепторов (283,3±33,3 кл/пз в группе О1, p=0,03; 268,0±29,1 кл/пз в группе К1, p=0,009; 258,8±36,5 кл/пз в группе О2, p=0,02; 281,5±31,2 кл/пз в группе К2, p=0,04) в сравнении с сетчаткой из гистологического контроля (322,8±28,9 кл/пз; рис. 3, б). В сетчатке глаз, забранных на 20-е сутки воздействия, наблюдали полную или частичную утрату наружных сегментов фоторецепторов с еще большим истончением НЯС и уменьшением количества клеток в нем (215,0±41,1 кл/пз в группе О1, p=0,004; 197,3±40,5 кл/пз в группе К1, p=0,002; 196,0±39,8 кл/пз в группе О2, p=0,002; 208,8±42,4 кл/пз в группе К2, p=0,002) при сравнении с гистологическим контролем, а также пролиферацию и миграцию, в том числе во внутренние слои сетчатки клеток ПЭС (см. рис. 3). В глазах, забранных на 30-е сутки эксперимента (через 10 дней после прекращения светового воздействия), морфологические изменения были аналогичными выявленным на 20-е сутки, при этом отмечено увеличение, хотя и статистически незначимое, количества клеток в НЯС в сравнении со значениями на 20-е сутки (219,8±31,7 кл/пз в группе О1, p=0,94; 211,0±31,9 кл/пз в группе К1, p=0,67; 223,3±29,2 кл/пз в группе О2, p=0,39; 229,3±32,4 кл/пз в группе К2, p=0,48). Анализ количества клеток в ВЯС, несмотря на некоторое снижение количества относительно гистологического контроля, не выявил значимых отличий в образцах сетчатки на 10, 20 и 30-е сутки эксперимента (p>0,05; см. рис. 3, б).

Рис. 3. Морфологические изменения сетчатки, наблюдаемые в разные сроки эксперимента.

а — снижение во всех группах толщины сетчатки преимущественно за счет НЯС, а также ВЯС сетчатки, вакуолизация и фрагментация наружных сегментов фоторецепторов на 10-е сутки воздействия (синие стрелки) с их последующей утратой (красные стрелки) на 20-е и 30-е сутки воздействия, пролиферация (черные стрелки) и миграция, в том числе во внутренние слои сетчатки (звездочки) клеток ПЭС. Окраска гематоксилином и эозином; б — значимое снижение количества клеток НЯС и ВЯС сетчатки в сравнении с гистологическим контролем, наиболее выраженное на 20-е сутки воздействия.

Сравнение показателей количества клеток в ВЯС и НЯС сетчатки на 10, 20 и 30-е сутки эксперимента между опытными и контрольными группами не выявило значимых отличий (p>0,05).

Оценка апоптоза клеток сетчатки методом TUNEL. В глазах из гистологического контроля ни в одном из срезов не было выявлено апоптотических клеток в ВЯС сетчатки, выявление на уровне НЯС не превышало двух-трех клеток на весь серийный срез, поэтому дальнейший анализ не включал сравнения с данными гистологического контроля.

В глазах, забранных на 10-е сутки воздействия, доля апоптотических клеток в НЯС составила 10,7±3,1% в группе О1, 11,0±3,5% в группе К1, 10,5±3,6% в группе О2, 11,2±3,1% в группе К2. На 20-е сутки эксперимента доля апоптотических клеток значимо не отличалась от таковой на 10-е сутки (14,3±3,3% в группе О1, p=0,09; 14,0±3,6% в группе К1, p=0,18; 14,2±3,4% в группе О2, p=0,13; 14,2±3,9% в группе К2, p=0,24). На 30-е сутки доля апоптотических клеток была значимо меньше в сравнении со значениями на 20-е сутки (5,7±2,8% в группе О1, p=0,002; 6,2±3,2% в группе К1, p=0,004; 6,2±2,6% в группе О2, p=0,002; 6,0±3,0% в группе К2, p=0,002).

Содержание апоптотических клеток в ВЯС сетчатки в глазах, забранных на 10-е и 20-е сутки эксперимента, значимо не различалось, составляя на 10-е сутки 5,7±2,5% в группе О1, 6,3±2,8% в группе К1; 5,8±2,4% в группе О2; 6,6±2,4% в группе К2, а на 20-е сутки эксперимента — 6,2±2,3% в группе О1; 6,7±2,6% в группе К1; 6,5±2,6% в группе О2; 6,8±2,4% в группе К2 (p>0,05; рис. 4). На 30-е сутки была выявлена меньшая доля апоптотических клеток в группах (4,2±2,3% в группе О1; 4,7±1,9% в группе К1; 4,1±21,9% в группе О2; 4,1±1,8% в группе К2), тем не менее значимых отличий в сравнении с данными на 10-е и 20-е сутки выявлено не было (p>0,05; см. рис. 4).

Рис. 4. Детекция апоптотических клеток сетчатки методом TUNEL.

На микрофотографиях — положительное окрашивание ядер апоптотических клеток (коричневый цвет, стрелками показаны примеры) на уровне НЯС и ВЯС в разные сроки эксперимента (пояснения в тексте); на графиках — динамика содержания апоптотических клеток в группах в разные сроки эксперимента.

Сравнение показателей доли апоптотических клеток в ВЯС и НЯС сетчатки на 10, 20 и 30-е сутки эксперимента между опытными и контрольными группами не выявило значимых различий (p>0,05).

Проведение анализа апоптоза в клетках ПЭС было невозможно ввиду того, что хромоген DAB в составе набора TUNEL окрашивает целевые структуры в такой же коричневый цвет, как и гранулы меланина в составе клеток ПЭС.

Обсуждение

В проведенной работе были исследованы некоторые функциональные и морфологические эффекты курсового применения нейропротекторного препарата «Ретиналамин» при моделировании фотохимического повреждения сетчатки кролика. Ранее сообщалось о наличии значимых эффектов препарата в моделях токсической ретинопатии, вызванной 3% раствором йодистого калия и монойодуксусной кислоты, а также при лазерном и механическом повреждении сетчатки кролика в эксперименте [12]. В частности, по данным офтальмоскопии введение препарата сопровождалось уменьшением размеров дистрофических очагов и отека сетчатки, по данным ЭРГ снижалось дальнейшее прогрессирование патологического процесса и угнетение функции сетчатки, а на гистологическом уровне в 2,2—2,5 раза ускорялась миграция клеток ПЭС в зону повреждения, стимулировалась их репаративная регенерация [7, 8]. В целом авторы публикаций характеризуют препарат Ретиналамин как оказывающий тканеспецифическое стимулирующее действие на фоторецепторы сетчатки, способствующий улучшению функционального взаимодействия ПЭС и наружных сегментов фоторецепторов, нормализующий проницаемость сосудов, при этом на клеточном уровне эффекты опосредованы «нормализацией функции клеточных мембран, улучшением внутриклеточного синтеза белка, регуляцией процессов перекисного окисления липидов, способствованием оптимизации энергетических процессов» [13].

В настоящей работе выполнено моделирование фотохимического повреждения сетчатки, имеющего патогенетическое значение при ряде заболеваний сетчатки, в частности при пигментном ретините, а также, возможно, при ВМД [14, 15]. Использованная модель предусматривала избирательное повреждающее воздействие светом с длиной волны 405 нм на уровне преимущественно наружных слоев сетчатки [14, 16], при этом исключались возможное дополнительное влияние на клетки сетчатки в целом вследствие введения химических агентов (например, монойодуксусная кислота), термического или механического повреждения. Кроме того, энергетические и временные параметры были выбраны с учетом известных данных порогового воздействия для развития фотохимического повреждения [17]. В результате светового воздействия наблюдались офтальмоскопические, функциональные и морфологические изменения, ранее уже описанные в литературе [18], в частности, дегенеративные изменения в сетчатке с перераспределением пигмента на глазном дне, нарушение структуры наружных слоев сетчатки с увеличением доли апоптотических клеток и, как следствие, угнетение биоэлектрической активности сетчатки в зоне воздействия света.

Наблюдаемые офтальмоскопически изменения в нашем исследовании целенаправленно не анализировались ввиду сложности количественной оценки и возможной субъективности интерпретации изменений на глазном дне. Кроме того, наблюдаемая динамика перераспределения клеток ПЭС не имела выраженных различий в отношении скорости и площади в опытных и контрольных группах; таким образом, в целом она не может считаться критерием, отражающим нейропротективные эффекты, поскольку пролиферативный ответ ПЭС может иметь не только положительные (закрытие дефекта, репарация), но и отрицательные (формирование рубцовой ткани при избыточной пролиферации) стороны [19].

Выбор дозировки препарата основывался на результатах работы [8], при этом с учетом введения в оба глаза каждого животного суммарная доза была выше приведенной в указанном источнике. Кроме того, в эксперименте были выбраны два режима курсового введения препарата — с момента начала светового воздействия и в середине исследования, когда уже развились структурные и функциональные нарушения в сетчатке, при этом для каждого варианта введения препарата была сформирована группа контроля. В результате не было выявлено каких-либо значимых различий не только между опытными и контрольными группами, но и между опытными группами с разными сроками начала введения препарата.

В отличие от проведенных ранее работ нами была предпринята попытка «ослепления» исследования: в частности, сотрудники, выполнявшие функциональные и морфологические исследования, не знали, к какой из групп относится каждое тестируемое животное или приготовленный препарат.

В качестве изучаемых функциональных параметров были выбраны показатели мфЭРГ, позволяющей (в отличие от общей ЭРГ, чаще применяемой в исследованиях фотохимического повреждения сетчатки грызунов) оценить локальные изменения биоэлектрической активности центральных отделов сетчатки [20]. Полученные результаты показали неравномерное и зависимое от экспозиции снижение амплитуды локально регистрируемых сигналов по всей площади стимуляции как в опытных, так и в контрольных группах, при этом попарное сравнение опытных и контрольных групп не выявило значимых отличий. При этом через 10 сут после прекращения светового воздействия во всех группах было отмечено частичное восстановление (хотя и не значимое) биоэлектрической активности как локально, так и при расчете усредненного ответа по всей стимулируемой области сетчатки. Последнее наблюдение согласуется с имеющимися данными, свидетельствующими о практически полном восстановлении показателей ЭРГ в период от 2 нед до нескольких месяцев после лазерного термического воздействия [21]. Кроме того, поскольку N1- и P1-компоненты мфЭРГ отражают функциональную активность как фоторецепторов, так и (в большей степени) биполярных клеток, полученные функциональные результаты можно экстраполировать и на оценку нейропротективных эффектов ретиналамина на второй нейрон зрительного пути (биполярные клетки) [22].

Помимо мфЭРГ в работе использовали регистрацию ответа на световой стимул, предъявляемый с частотой 30 Гц, что позволило оценить изменения в колбочковом компоненте фоторецепторного слоя. В результате были выявлены сходные с результатами мфЭРГ по динамике изменения амплитуды ответа: угасание с частичным восстановлением после прекращения повреждающего светового воздействия. Таким образом, хотя в работе были использованы только два метода исследования биоэлектрической активности сетчатки, с учетом сопоставимой динамики результатов регистрации можно сделать вывод об отсутствии какого-либо влияния курсов введения препарата на исследуемые показатели функциональной активности сетчатки.

При проведении морфологического исследования оценивались преимущественно НЯС сетчатки как основная зона фотохимического повреждения [14]. При этом в отличие от ранее выполненных работ не предпринималось попыток количественной оценки изменений в слое ПЭС, поскольку на содержание клеток ПЭС в серийных гистологических срезах оказывает значительное влияние как неоднородность офтальмоскопических изменений пигментации (т.е. зависимость того, на каком уровне будут выполнены гистологические срезы), так и качество гистологических препаратов (например, неверная трактовка артефактов, связанных с отсутствием в срезе слоя клеток, наложением или толщиной препарата в целом). Кроме того, пигмент меланин в составе клеток ПЭС ввиду высокой внутриклеточной концентрации и сходства с хромогеном DAB, используемым для иммуногистохимического окрашивания, не позволил оценить апоптоз клеток ПЭС в эксперименте. Таким образом, морфологическая оценка влияния препарата сводилась, главным образом, к изучению изменений в слое фоторецепторов, страдающих в первую очередь, а также в ВЯС, оцениваемом по общему количеству визуализируемых ядер клеток ввиду отсутствия дифференцированной окраски клеточных типов (биполярные, амакриновые и другие клетки). Полученные результаты динамики изменения количества клеток и уровня апоптоза клеток в группах согласуются с имеющимися данными, наглядно иллюстрируя итог фотохимического повреждения [18, 23]. Выявленная обратимость эффектов повреждения в форме незначительного увеличения числа клеток фоторецепторов и снижения доли клеток с апоптозом после прекращения светового воздействия, вероятно, была связана с выбранными параметрами энергии и экспозиции, поскольку при более интенсивном воздействии в различных исследованиях были описаны исходы в форме атрофии с полным исчезновением НЯС [23].

Проведенное исследование показало, что курсовое применение ретиналамина, начатое как с 1-го дня светового воздействия, так и спустя 10 дней, не имело значимого влияния на динамику гибели клеток НЯС и ВЯС сетчатки, т. е. нейропротекторного эффекта по отношению к нейроэпителию, а также клеткам ВЯС в эксперименте выявлено не было.

Ограничением проведенного исследования является отсутствие данных о распределении препарата в тканях и его концентрации в сетчатке, хотя производителем и описана невозможность такового ввиду многокомпонентности препарата и отсутствия точных данных о его составе. В то же время введение препарата осуществляли предписанным инструкцией и используемым в опубликованных ранее работах способом (парабульбарно) в дозировке, равной применяемым ранее или превышающей их. Период наблюдения после прекращения светового воздействия составил только 10 сут, что не позволяет сделать выводы о динамике восстановления структуры и функциональной активности поврежденной сетчатки в более отдаленные сроки.

Кроме того, настоящее исследование вследствие ограниченности ресурсов не включало в себя всестороннюю оценку возможных эффектов препарата, поэтому полученные результаты не позволяют в полной мере проводить их экстраполяцию на заболевания, не связанные патогенетическими механизмами с использованной моделью фотохимического повреждения.

Заключение

В исследовании на модели фотохимического повреждения сетчатки кролика не получено значимых функциональных и морфологических данных, которые свидетельствовали бы о наличии нейропротекторных эффектов у препарата «Ретиналамин». Результаты эксперимента, а также недостаточные данные имеющихся экспериментальных работ диктуют необходимость более тщательного экспериментального исследования эффектов препарата.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования: А.С., С.А.

Сбор и обработка материала: С.А., А.С., М.О., А.К.

Статистическая обработка: А.С., А.К.

Написание текста: А.С., М.О.

Редактирование: С.А.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.