Возрастная макулярная дегенерация (ВМД) во всем мире является основной причиной необратимой потери центрального зрения у пациентов старшей возрастной группы [1]. Пролиферативная диабетическая ретинопатия (ПДР) занимает пятое место в мире среди причин слабовидения и четвертое — среди причин слепоты пациентов и служит основной причиной потери зрения среди трудоспособного населения в большинстве развитых стран. Важными звеньями патогенеза этих заболеваний являются развитие нейродегенеративного процесса в сетчатке и неуправляемая неоваскуляризация.

Патогенез ВМД сложный и многофакторный, а потеря зрения связана в первую очередь с прогрессирующей дегенерацией и гибелью постмитотических клеток ретинального пигментного эпителия (РПЭ), что вызывает нарушение метаболизма и гибель нервных клеток сетчатки. Клетки РПЭ отличаются высокой метаболической активностью и связанным с этим обильным потреблением кислорода, высоким содержанием полиненасыщенных жирных кислот. Кроме того, они подвергаются постоянному воздействию света, что способствует продукции активных форм кислорода. В стареющих клетках РПЭ антиоксидантная система ослаблена, развивается окислительный стресс, вызывающий повреждение структурных и функциональных элементов клетки, в том числе эндоплазматического ретикулума и митохондрий, что приводит к дальнейшему образованию кислородных радикалов, повреждению клеток и развитию воспаления [2]. При диабете нарушение барьерной функции РПЭ, ишемия, усиление продукции свободных радикалов, развивающиеся в глазу вследствие повышения содержания глюкозы, также приводят к окислительному стрессу и запуску каскада процессов, приводящих к нейродегенерации и нейровоспалению [3].

На этом фоне происходит образование неправильно свернутых белков и их токсичных агрегатов, например β-амилоида. В ответ развивается реакция на образование неправильно свернутых белков (unfolded protein response, UPR), при которой увеличивается синтез белков теплового шока, обладающих шаперонной активностью, т.е. способностью предотвращать образование неправильно свернутых белков, их агрегацию. Показано, что UPR активируется в стареющих клетках сетчатки, в том числе в РПЭ. Повышенное содержание белков теплового шока выявлено в сетчатке у пациентов с ВМД [4]. Реакция UPR — это клеточная программа, которая инициируется как защитный механизм, однако при длительном течении патологического процесса запускает апоптоз клеток, не поддающихся восстановлению [5].

Мультифункциональный белок α2-макроглобулин (α₂-МГ) принимает участие во всех этих процессах. Это белок острой фазы воспаления, и при воспалении происходит увеличение его экспрессии. Он связывает и удаляет из организма протеолитические ферменты всех классов. В то же время активированный при воспалении протеазами α₂-МГ становится переносчиком широкого круга цитокинов, факторов роста, иммуноглобулинов и может либо выводить их из организма, либо транспортировать с сохранением активности, что придает ему роль иммуномодулятора [6]. α₂-МГ также относится к классу белков-шаперонов и в качестве шаперона участвует в реакции UPR, поддерживая необходимую конформацию белков, препятствуя их агрегации и удаляя неправильно сформированные или разрушенные белки [7]. Удаление комплексов α₂-МГ с метаболитами осуществляется путем эндоцитоза при взаимодействии с липопротеиновым рецептором LRP1. При этом активируются различные внутриклеточные сигнальные пути во многих типах клеток, в том числе в макрофагах и глиальных клетках Мюллера; таким образом, α₂-МГ влияет на процессы клеточной пролиферации, миграции и дифференцировки [8]. Экспрессия LRP1 и α₂-МГ в сетчатке увеличивается в условиях гипоксии и, предположительно, играет роль в развитии неоваскуляризации [9]. Аналогичный процесс может иметь место и при хориоидальной неоваскуляризации. Таким образом, α₂-МГ принимает участие в ключевых звеньях патогенеза ВМД и ПДР.

Известно, что при диабете в крови увеличивается содержание α₂-МГ. Показано, что у больных диабетом с ретинопатией содержание α₂-МГ выше, чем у пациентов без ретинопатии [10]. Установлено повышение не только системного, но и локального синтеза α₂-МГ при диабете; так, его содержание возрастает в слюне [11] и в сетчатке [12]. В то же время отсутствуют сведения о содержании α₂-МГ в слезной жидкости при диабете и ВМД, нет данных об изменении уровня α₂-МГ в крови при ВМД. Изучение содержания α₂-МГ в этих биологических жидкостях у пациентов с ВМД и ПДР позволит дополнить существующий список биомаркеров нейродегенерации в глазу [13], которые могут быть полезны при скрининговом обследовании, прогнозировании течения болезни и оценке эффективности проводимой терапии.

Слезная жидкость в последние десятилетия привлекает все больший интерес как потенциальный источник биохимических маркеров глазных заболеваний, в особенности благодаря доступному неинвазивному способу получения.

Цель настоящей работы — определение активности α₂-МГ в слезе и сыворотке крови больных с ВМД и ПДР для выявления связи уровня активности α₂-МГ в этих биологических жидкостях с наличием патологического процесса в сетчатке.

Материал и методы

В исследование включено 17 больных (34 глаза) с ВМД (3 мужчин и 14 женщин в возрасте от 58 до 79 лет) и 15 больных (30 глаз) с сахарным диабетом 2-го типа с ПДР (8 мужчин и 7 женщин в возрасте от 38 до 63 лет). В 19 глазах диагностировали экссудативную форму ВМД, в 11 глазах — неэкссудативную форму, в 4 глазах выявлен субмакулярный фиброз. Пациентам с экссудативной формой ВМД и субмакулярным фиброзом не менее чем за 2 мес до включения в исследование проводилась антиангиогенная терапия. Всем пациентам с ПДР не менее чем за 1 год до включения в исследование была проведена панретинальная лазеркоагуляция. На момент осмотра ретинальный статус оценивался как стабильный, наличие диабетического макулярного отека являлось критерием исключения. У 10 (59%) пациентов с ВМД и у 7 (46%) пациентов с ПДР был сопутствующий диагноз «гипертоническая болезнь», артериальное давление было компенсировано за счет гипотензивной терапии. У всех пациентов на момент исследования отсутствовали острые воспалительные заболевания. Наличие ревматоидного артрита и других аутоиммунных патологий, бронхиальной астмы, тяжелых хронических воспалительных заболеваний также являлось критерием исключения.

Контрольной группой послужили 15 добровольцев (30 глаз) без сахарного диабета и офтальмопатологии, сопоставимые по возрасту с больными.

Всем пациентам проводили стандартное офтальмологическое обследование и оптическую когерентную томографию.

Слезную жидкость забирали из обоих глаз утром с помощью полосок стерильной фильтровальной бумаги шириной 5 мм, которые закладывали за нижнее веко на 5 мин. За день до взятия слезы пациенты не закапывали лекарственные препараты. Компоненты слезы элюировали изотоническим раствором натрия хлорида, элюат центрифугировали 10 мин при 3000 об/мин, надосадочную часть использовали для исследования. Для определения активности α₂-МГ в сыворотке крови использовали кровь, взятую для биохимического анализа, входящего в стандарт обследования.

Определение активности α₂-МГ проводили ферментативным методом со специфическим субстратом N-бензоил-DL-аргинин-p-нитроанилидом [14]. Активность выражали в нмоль/мин×мл слезы или сыворотки крови. Оптическую плотность образцов определяли на многофункциональном фотометре для микропланшетов Synergy MX (BioTek, США).

Статистический анализ проводили при помощи пакета прикладных программ Microsoft Office Excel, входящих в стандартный комплект Microsoft Office, а также статистического пакета Statistica 10.0 (Stat Soft Inc., США). Количественные показатели представлены в виде среднего арифметического и стандартной ошибки среднего (M±m). При сравнении групп использовали непараметрический U-критерий Манна—Уитни. Различия считали значимыми при p<0,05.

Результаты

У пациентов с ВМД активность α₂-МГ в слезной жидкости превышает норму в среднем в 3,5 раза (p=0,003). У пациентов с ПДР активность α₂-МГ в слезе также статистически значимо повышена (p=0,002), но в существенно меньшей степени, и в среднем превышает уровень контрольной группы в 1,5 раза (рис. 1).

Рис. 1. Активность α₂-МГ в слезе здоровых людей и больных с ПДР и ВМД.

Здесь и на рис. 2: на диаграммах для каждой группы представлены медиана, минимальное и максимальное значения, верхний и нижний квартили [25-й; 75-й перцентили]. * — статистически значимое отличие от контрольной группы (p<0,01).

Обращает на себя внимание большой разброс значений активности α₂-МГ в слезе пациентов с ВМД. В четверти глаз с ВМД она не выше уровня контроля, тогда как в большинстве глаз с ВМД многократно его превышает. Средние значения активности α₂-МГ в слезе пациентов с экссудативной формой ВМД оказались несколько выше, чем при неэкссудативной форме, однако в связи с большим разбросом значений этого показателя различия статистически не значимы (рис. 2).

Рис. 2. Активность α₂-МГ в слезе лиц контрольной группы и у больных с влажной и сухой формами ВМД.

В глазах с субмакулярным фиброзом активность α₂-МГ в слезе была в среднем вдвое ниже, чем в парном глазу с активным экссудативным процессом.

В сыворотке крови пациентов с ПДР и ВМД отмечено примерно одинаковое, менее значительное, чем в слезной жидкости, но статистически значимое повышение активности α₂-МГ, в среднем составляющее соответственно 23,7 и 25,4% от нормы (см. таблицу).

Активность α₂-МГ в сыворотке крови здоровых людей и пациентов с ПДР и ВМД, нмоль/мин×мл

Примечание. * — статистически значимое отличие от контрольной группы (p<0,05).

Корреляции между активностью α₂-МГ в слезе и крови ни при ВМД, ни при ПДР не обнаружено.

Обсуждение

Полученные результаты показали, что у пациентов с ВМД в слезной жидкости значительно (в среднем в 3,5 раза) увеличена активность α₂-МГ. Однако отмечен высокий разброс значений активности α₂-МГ: примерно в четверти глаз активность не была повышена, тогда как в остальных глазах ее значение многократно (а у отдельных больных — десятикратно) превышало уровень нормы. Такой разброс может быть связан как с различиями в патогенетических механизмах возникновения данной патологии, так и с проводимым лечением, что должно стать предметом дальнейших исследований. Так, все больные с влажной формой ВМД получают анти-VEGF-терапию, что может влиять на уровень α₂-МГ. Показано, что α₂-МГ как в нативной форме, так и после конформационных изменений при взаимодействии с протеазами способен связывать фактор роста эндотелия сосудов (vascular endothelial growth factor, VEGF) [15]. Этот комплекс распознается рецептором α₂-МГ — LRP1, путем эндоцитоза поступает в клетки и после расщепления лизосомальными ферментами выводится из организма. Поэтому α₂-МГ может служить для инактивации и удаления VEGF и расходоваться на этот процесс [16]. Не исключено, что увеличение содержания VEGF в хориоидее может увеличивать экспрессию α₂-МГ [17].

Выявленное нами небольшое различие в активности α₂-МГ в слезной жидкости между сухой и влажной формами ВМД пока не дает нам основания для выводов и требует проведения дальнейших исследований. Обнаруженный нами существенно более низкий уровень α₂-МГ в слезе на стадии субмакулярного фиброза по сравнению со стадией экссудации свидетельствует о завершении активного деструктивного процесса воспаления в этот период.

Обращает на себя внимание значительно большее повышение активности α₂-МГ в слезе при ВМД, чем при других заболеваниях глаз, которые также сопровождаются нейродегенеративными процессами в сетчатке. Так, активность α₂-МГ в слезе при ПДР и при глаукоме, по нашим данным, увеличивается в меньшей степени — в 1,5—1,6 раза. Повышение уровня α₂-МГ в биологических жидкостях выявлено при нейродегенеративных заболеваниях центральной нервной системы: в спинномозговой жидкости при болезни Альцгеймера и болезни Паркинсона [18, 19], а также в слезе при болезни Паркинсона [20]. Изменения уровня α₂-МГ рассматриваются в качестве биомаркера этих нейродегенеративных процессов. В патогенезе нейродегенеративных заболеваний глаза и центральной нервной системы участвуют одни и те же процессы: хронический окислительный стресс, воспаление, подавление аутофагии и внеклеточное отложение β-амилоида [21]. У больных ВМД чаще, чем в целом в популяции, развиваются нейродегенеративные заболевания центральной нервной системы [22].

В слезной жидкости больных ПДР также обнаружено меньшее, но статистически значимое повышение активности α₂-МГ, что согласуется с данными литературы об увеличении его местного синтеза при диабете [12].

Увеличение активности α₂-МГ в слезе отражает характер его локальной реакции на развитие нейродегенеративного процесса в сетчатке. Основные возможные механизмы участия полифункционального белка α₂-МГ в патогенезе нейродегенеративных процессов в глазу представлены на рис. 3. α₂-МГ и рецептор LRP1 присутствуют в сетчатке и участвуют в нейродегенеративных и пролиферативных процессах, протекающих в ней [7]. Содержание α₂-МГ в сетчатке увеличивается при глаукоме и ПДР [12, 23].

Рис. 3. Основные механизмы участия α₂-МГ в патогенезе ВМД.

Повышение активности α₂-МГ может происходить вследствие увеличения его синтеза в ответ на воспаление [2], а также при запуске реакции UPR, в которой он участвует в качестве шаперона [7]. На ранних стадиях дегенеративных процессов такая реакция является защитной, поскольку α₂-МГ предотвращает чрезмерную активацию протеолиза, ослабляет действие цитокинов, препятствует образованию неправильно свернутых белков и их агрегации, например образованию β-амилоида. При хроническом течении дегенеративных процессов, когда на протяжении длительного времени в клетках имеют место митохондриальная дисфункция и стресс эндоплазматического ретикулума, запускаются сигнальные пути, направленные на апоптоз этих клеток, и в этом процессе принимает участие α₂-МГ [24, 25].

Пациенты с ВМД и с ПДР, включенные в настоящее исследование, находились на стадии выраженных изменений в сетчатке, поэтому повышение активности α₂-МГ в данном случае может отражать процессы, приводящие к гибели его клеток.

Доказано, что в основе нейротоксического действия α₂-МГ, в том числе в сетчатке, помимо участия в UPR может лежать его способность подавлять активность фактора роста нервов (nerve growth factor, NGF) [26, 27], снижать клиренс провоспалительных цитокинов и амилоидных белков, а также усиливать эксайтотоксичность NMDA-рецепторов [7]. Доказательством участия α₂-МГ в индукции гибели ганглиозных клеток сетчатки при повышении внутриглазного давления является установленный факт уменьшения гибели этих клеток после нейтрализации α₂-МГ специфическими антителами [23].

Показана важная роль α₂-МГ и в запуске процессов неоваскуляризации в сетчатке. Установлено, что в сетчатке крыс с кислород-индуцированной ретинопатией, сопровождающейся неоваскуляризацией, в глиальных клетках Мюллера повышаются уровень α₂-МГ, активированного матриксными металлопротеиназами, и экспрессия рецептора LRP1 [9]. Аналогичные изменения были обнаружены в стекловидном теле и сетчатке пациентов с ПДР [23]. В глиальных клетках Мюллера взаимодействие α₂-МГ с LRP1 индуцирует миграцию клеток и восстановление межклеточного матрикса — процессы, тесно связанные с пролиферативными нарушениями [8]. Таким образом, и при ПДР, и при ВМД α₂-МГ может принимать участие в запуске неоваскуляризации. Кроме того, α₂-МГ может способствовать развитию субретинального фиброза как путем ингибирования металлопротеиназ и накопления белков межклеточного матрикса, так и посредством передачи профибротической сигнализации.

Выявленное нами повышение активности α₂-МГ в крови пациентов с ПДР согласуется с данными литературы о повышении его содержания при диабете и особенно при ПДР, что связывают с более высокими уровнями гликированного гемоглобина, обнаруженными у пациентов с ПДР [10]. Выявленное повышение активности α₂-МГ в общем кровотоке при ВМД указывает на системное вялотекущее воспаление, наличие которого было установлено на основании увеличения в крови уровня других маркеров воспаления — эндотелина-1, интерлейкина-8 и фактора роста опухолей-β2 [28], а также изменения клеточного состава крови [29].

Работ по исследованию α₂-МГ в слезной жидкости и крови при ВМД и ПДР в доступной литературе мы не обнаружили. Увеличение активности α₂-МГ в слезе свидетельствует о том, что состав слезы отражает изменения метаболизма в сетчатке при этих заболеваниях. Так, при протеомном анализе слезы пациентов с неоваскулярной ВМД было обнаружено повышение содержания белков, связанных с окислительным стрессом, регуляцией протеолиза, воспалением и неоваскуляризацией [30], а в слезе больных с ПДР выявлено высокое содержание эндотелиального фактора роста сосудов [31, 32].

Заключение

Полифункциональный белок α₂-МГ играет важную роль практически во всех звеньях патогенеза как ВМД, так и ПДР. Нами впервые установлено, что при этих заболеваниях происходит увеличение активности α₂-МГ не только в крови, но и в слезе. У большинства пациентов с ВМД активность α₂-МГ в слезе оказалась повышена существенно сильнее, чем при ПДР — заболевании, также сопровождающемся нейродегенеративными процессами в сетчатке. На стадии субмакулярного фиброза активность α₂-МГ в слезе снижается вследствие завершения активного деструктивного процесса. Небольшое, но статистически значимое повышение активности α₂-МГ в крови пациентов с ВМД и ПДР согласуется с данными литературы о наличии вялотекущего системного воспалительного процесса при данных глазных патологиях. Корреляции между активностью α₂-МГ в слезе и крови не обнаружено, что подтверждает местное происхождение α₂-МГ в слезной жидкости.

Полученные нами данные позволяют утверждать, что высокий уровень α₂-МГ в слезе отражает наличие активного деструктивного процесса в сетчатке. Это обосновывает целесообразность дальнейших исследований, направленных на выявление закономерностей динамики уровня α₂-МГ в слезе с целью прогнозирования течения ВМД и ПДР, контроля терапии и обоснования выбора методов лечения.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования: В.Н., Н.Ч.

Сбор и обработка материала: Н. Н., Т.О., О.У.

Статистическая обработка: О.Б., Т.П.

Написание текста: Н.Ч., Т.О.

Редактирование: Н.Ч., О.Б., Т.О.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.