Инсульт является второй по частоте причиной смертности среди населения в Российской Федерации [1, 2] и ведущей причиной инвалидизации в мире [3]. В России ежегодная смертность от инсульта составляет 39% от всех болезней системы кровообращения и 23,4% от общей смертности населения [1], в стране насчитывается более 1 млн пациентов, перенесших ишемический инсульт (ИИ) [1, 4]. Летальность в остром периоде инсульта составляет в среднем 30—35% и возрастает к концу первого года после заболевания еще на 12—15% [2]. Лишь у 20% пациентов после ИИ полностью восстанавливается работоспособность [5]. Постинсультная инвалидизация занимает первое место среди всех причин инвалидизации и составляет 3,2 на 10 000 населения. Вследствие значительных затрат, связанных с проведением лечебных и реабилитационных мероприятий среди пациентов с ИИ, проблема цереброваскулярной патологии имеет не только медицинскую, но и социальную значимость [6].

Несмотря на большое число исследований, посвященных нарушениям мозгового кровообращения, патогенез инсультов остается еще во многом не ясным, а результаты лечения и профилактики не всегда удовлетворительными [7, 8]. Чаще всего инсульты протекают по типу ишемии и сопровождаются образованием артериальных тромбов в 34% случаев [9], что указывает на важную патогенетическую роль изменений в системе гемостаза [10]. Одним из центральных механизмов патогенеза ИИ является системное увеличение коагуляционного потенциала и изменение реологических свойств крови в сочетании с локальной дисфункцией и/или деструкцией эндотелия, что в совокупности приводит к ИИ [11, 12]. Наряду с нарушениями плазменного и сосудистого компонентов гемостаза при ИИ происходит активация тромбоцитов. Так, у 57% больных с ИИ наблюдается гиперагрегация тромбоцитов, которая влечет за собой выброс мощного проагреганта — тромбоксана А2 [13] и других веществ, стимулирующих гемокоагуляционный каскад и вторичную активацию тромбоцитов.

Одним из наиболее сильных физиологических активаторов тромбоцитов является фермент тромбин, образующийся в крови при любых вариантах внутрисосудистой активации системы свертывания крови. Одновременно с активацией тромбоцитов тромбин расщепляет белок плазмы крови фибриноген, который превращается в полимерный нерастворимый фибрин. Активированные тромбоциты прилипают к нитям фибрина через интегриновый рецептор αIIbβ3, образуя фибрино-тромбоцитарную сеть — структурную основу гемостатического сгустка или обтурационного тромба [14—16]. В пробирке после формирования фибрино-тромбоцитарного сгустка наблюдается его спонтанное сжатие (уменьшение в объеме до ¹/10 от исходного) с отделением сыворотки крови [14] — процесс, получивший название контракции (или ретракции) кровяного сгустка [17]. Контракция сгустка крови происходит не только in vitro, но и внутри кровеносных сосудов, если там образовался сгусток или тромб [18]. Значение контракции in vivo состоит в том, что активное сжатие сгустка восстанавливает кровоток в обход сгустка или тромба, обтурирующего просвет сосуда [17, 18].

Несмотря на потенциальную клиническую значимость контракции сгустка, ее систематическое изучение раньше не проводилось, прежде всего из-за несовершенства существующих методов регистрации и оценки этого процесса. Степень контракции в подавляющем большинстве сравнительно немногочисленных исследований рассчитывалась приблизительно, по отношению объема выделившейся сыворотки к объему забранной крови. Не удивительно, что при этом нормальные показатели степени контракции были плохо сопоставимы, очень разнородны и колебались от 20 до 80%. В данной работе использован оригинальный аппаратный метод [19], который позволяет дать количественную оценку кинетики контракции сгустка крови in vitro в норме и при патологии.

Цель настоящей работы — определение возможной патогенетической и клинической роли нарушений контракции сгустка крови в острой фазе ИИ.

В исследование были включены 85 пациентов с ИИ, 42 (49%) мужчины и 43 (51%) женщины, в возрасте от 45 до 86 лет, средний возраст — 67,6 года, поступивших в неврологическое отделение Межрегионального клинико-диагностического центра (МКДЦ) Казани. При поступлении пациента в специализированное приемное отделение, приближенное к блоку лучевой диагностики, проводились клинический осмотр с оценкой неврологического статуса с использованием шкалы инсульта Национального института здоровья США (NIHSS) и забор крови для лабораторных исследований. При выявлении клинических признаков ИИ осуществлялись рентгеновская компьютерная томография (КТ) и магнитно-резонансная томография (МРТ) головного мозга для подтверждения диагноза, уточнения типа и локализации инсульта, вычисления размера очага [20, 21]. Патогенетический подтип инсульта определялся согласно критериям TOAST (Trial Of Org 10172 in Acute Stroke Treatment) [3]. Исход инсульта (степень инвалидизации) определялся в день выписки из стационара по модифицированной шкале Рэнкина (mRs).

Среди включенных в исследование пациентов в 64 (75%) наблюдениях ИИ развился в системе внутренней сонной артерии, в 21 (25%) — в вертебрально-базилярной системе. Согласно критериям TOAST, у 33 (39%) пациентов выявлен кардиоэмболический инсульт, у 46 (54%) — атеротромботический и у 6 (7%) — лакунарный. Неврологический дефицит по шкале NIHSS составил от 1 до 25 баллов, среднее значение — 9,2 балла, среди обследованных с легким инсультом были 46 (54%) пациентов (NIHSS 1—7 баллов), с инсультом средней степени тяжести — 24 (28%) (NIHSS 8—16 баллов), с тяжелым инсультом — 15 (18%) больных (NIHSS более 16 баллов). Степень инвализидации по mRs в день выписки из стационара у 3 (4%) больных составила 0 баллов, у 18 (21%) — 1 балл, у 17 (20%) — 2 балла, у 12 (14%) — 3 балла, у 21 (25%) — 4 балла, у 8 (9%) — 5 баллов. Умерли 6 (7%) пациентов.

В качестве группы контроля исследовали кровь 80 условно здоровых, обратившихся в Центр переливания крови МКДЦ, из них 47 (59%) мужчин и 33 (41%) женщины в возрасте от 18 до 57 лет, средний возраст — 35 лет.

Забор венозной крови проводили при поступлении пациентов, но не позднее 6 ч от манифестации ИИ, при условии исключения приема препаратов, влияющих на свертывание крови и активность тромбоцитов. Первые две пробы крови брали в вакуйтенеры с 3,2% цитратом натрия BD Vacutainer («Becton, Dickinson and Co.», США) в соотношении 9:1 по объему. Первый образец цитратной крови использовали непосредственно для изучения контракции кровяного сгустка. Второй — центрифугировали при 1500 g в течение 10 мин для получения бедной тромбоцитами плазмы и использовали для оценки состояния гемостаза. Третий — стабилизировали K3ЭДТА (1,6 мг/мл конечная концентрация) в BD Vacutainer и использовали для гематологических анализов. Образец с нестабилизированной цельной кровью смешивали с силикатным активатором свертывания BD Vacutainer и оставляли сворачиваться на 20—30 мин, затем центрифугировали при 2000 g 10 мин, чтобы получить сыворотку для биохимических исследований. Образцы крови хранили и обрабатывали при комнатной температуре, исследовали не позднее 4 ч после взятия.

Определение кинетики и степени контракции кровяного сгустка проводили с помощью метода, основанного на оптической регистрации размера сгустка крови во времени, с использованием прибора «Регистратор тромбодинамики» производства компании «ГемаКор» (Москва) [19]. Перед определением двухканальную пластиковую измерительную кювету размером 12×7×1 мм, прилагаемую к прибору, ополаскивали 4% раствором тритона Х-100 на 150 мМ NaCl, чтобы предотвратить прилипание фибрина к стенкам кюветы и сделать возможным спонтанное, не ограниченное в пространстве сжатие сгустка крови.

Сначала к цитратной крови добавляли CaCl2 2 мМ (конечная концентрация) и инкубировали при 37 ^○С в течение 3 мин. Затем добавляли 1 U/мл тромбина (конечная концентрация) для инициации свертывания крови и активации тромбоцитов. После этого быстро переносили 80 мкл образца в прозрачную кювету, предварительно прогретую до 37 ^○С в термостатируемой камере прибора «Регистратор тромбодинамики». Фоторегистрацию размеров сгустка крови проводили автоматически каждые 15 с в течение 20 мин после добавления тромбина.

Обработку результатов и построение кинетической кривой осуществляли с помощью специальной программы, которая определяет такие параметры, как конечная степень контракции — величина, отражающая разницу между начальным и конечным (через 20 мин) размером сгустка в процентах; лаг-период — время, необходимое для уменьшения размера сгустка менее 95% от исходного, т. е. время, необходимое для инициации процесса контракции (с); средняя скорость контракции — изменение размера сгустка (%) на единицу времени.

Состояние системы гемостаза оценивали с помощью автоматизированного коагулометра Sysmex CA-1500 («Sysmex», Канада). Определяли параметры коагулограммы: активированное частичное тромбопластиновое время (АЧТВ), протромбиновое время в единицах международного нормализованного отношения (МНО), протромбиновое время, концентрацию фибриногена по Клауссу, с помощью хромогенного метода концентрацию антитромбина III (АТIII), уровень плазминогена, уровень протеина С. Турбидиметрический иммунноанализ использовали для определения концентрации D-димера.

Анализ клеток проводили в цельной крови, стабилизированной ЭДТА, с помощью гематологического анализатора ABX Pentra 60 («Horiba», Япония) по следующим параметрам: количество эритроцитов, средний объем эритроцитов, гематокрит, уровень гемоглобина, среднее содержание гемоглобина в эритроците, цветовой показатель, общее количество лейкоцитов, содержание моноцитов, нейтрофилов, лимфоцитов, эозинофилов, базофилов, тромбоцитов, средний объем тромбоцитов.

Биохимические анализы крови проводили с помощью прибора RX Imola («Randox», Великобритания) и Advia 1200 («Siemens», Германия). Концентрации сывороточного альбумина, общего белка, общего билирубина, глюкозы, активности аланинаминотрансферазы (АЛТ), аспартатаминотрансферазы (AСТ), уровни креатинина, мочевины, ионов магния, натрия и калия были измерены на анализаторе RX Imola. Содержание холестерина, триглицеридов, липопротеинов низкой плотности (ЛПНП), липопротеинов высокой плотности (ЛПВП) осуществляли на приборе ADVIA 1200. Концентрацию белка сыворотки S-100 определяли с помощью анализатора Cobas E411 («Roche», Швейцария).

Статистический анализ полученных данных осуществляли с использованием программных пакетов GraphPad Prism 5, Statsoft Statistica 10. Для подтверждения гипотезы нормальности распределения статистических признаков использовали критерий нормальности Колмогорова—Смирнова. Различия между двумя независимыми выборками оценивали с помощью критериев Манна—Уитни и Стьюдента; корреляционный анализ проводили на основе вычисления коэффициента корреляции Пирсона, при ненормальном распределении признака использовали коэффициент ранговой корреляции Спирмена. При оценке достоверности использовали уровень статистической значимости 95% (p<0,05). Данные в таблицах представлены в виде среднего арифметического±стандартная ошибка среднего.

Кластерный анализ проводили с использованием методов иерархической кластеризации и k-средних [22]. Первые (метод полной связи, метод средней связи и метод Уорда) применяли преимущественно для определения объективно существующего числа групп пациентов (величины k). На основе метода k-средних для имеющейся совокупности статистических признаков проводили разбиение заданной выборки пациентов на внутренне однородные k-группы (кластеры).

Анализ параметров контракции кровяного сгустка показывает, что интенсивность этого процесса в крови пациентов в остром периоде ИИ достоверно снижена по сравнению с контролем (табл. 1). Об этом свидетельствуют более чем 2-кратное снижение средней степени и скорости контракции, а также более чем 3-кратное увеличение продолжительности лаг-периода при И.И. Эти данные показывают, что в крови пациентов тормозятся все стадии процесса контракции сгустка крови, несмотря на высокую концентрацию экзогенного активатора (тромбина), добавляемого при постановке теста. Для выявления возможных механизмов уменьшения контракции при ИИ параметры контракции были сопоставлены с результатами других исследований.

Лабораторные исследования показали, что у больных с ИИ наблюдаются разнонаправленные изменения коагулограммы как в сторону снижения коагуляционного потенциала крови (гипокоагулемия), так и в сторону его повышения (гиперкоагулемия) (табл. 2). Гипокоагулемия проявляется удлинением АЧТВ, увеличением уровня антитромбина III, а также снижением амплитуды и скорости АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов в сочетании с уменьшением концентрации тромбоцитов в крови. В пользу гиперкоагуляции свидетельствуют увеличение протромбинового индекса, повышение уровня фибриногена и существенное увеличение концентрации в крови D-димера — маркера внутрисосудистого отложения фибрина. Такие внешне противоречивые лабораторные данные характерны для патологических состояний, сопровождающихся внутрисосудистым свертыванием крови по типу подострого ДВС-синдрома или тромбоза. Особый интерес представляют обнаруженные нами данные о снижении количества тромбоцитов, уменьшении их среднего объема и агрегационной активности при ИИ, которые могут прежде всего объяснять уменьшение контракции сгустка крови, зависимого от функционального состояния и количества тромбоцитов.

Корреляционный анализ показателей контракции кровяного сгустка и гемокоагуляции выявил две достоверные взаимосвязи (табл. 3). Первая — слабая отрицательная корреляция уровня фибриногена со степенью и скоростью контракции, указывающая на возможное ингибирующее действие фибриногена на контракцию. Вторая — высокая положительная корреляция активности антитромбина III с лаг-периодом, свидетельствующая о возможности частичной нейтрализации тромбина и замедлении процессов клеточной активации и образования фибрина. Эти результаты могут указывать на общность механизмов контракции сгустка и свертывания крови и на вклад, который гиперфибриногенемия и повышенный уровень антитромбина III могут вносить в снижение скорости и полноты контракции при ИИ.

Чтобы установить возможные причины снижения контракции сгустка при ИИ, мы проанализировали связь контракции с лабораторными показателями, которые представлены в табл. 4. Было обнаружено несколько достоверных изменений клеточного и биохимического состава крови при ИИ, которые могут быть связаны с контракцией сгустков. Во-первых, это изменения красной крови, включающие относительное увеличение гематокрита, содержания гемоглобина и среднего объема эритроцитов при одновременном уменьшении среднего содержания гемоглобина в эритроците. Во-вторых, это изменения белой крови, которые проявляются относительным лейкоцитозом, прежде всего за счет увеличения содержания моноцитов и нейтрофилов. Эти клеточные изменения сочетаются с повышенной СОЭ, которая вместе с лейкоцитозом отражает воспалительную реакцию организма на инсульт. В-третьих, это относительное снижение уровня концентрации белка в крови, прежде всего альбумина, при одновременном увеличении уровня билирубина, мочевины, креатинина, активности АСТ и гипергликемии, указывающих в совокупности на изменение функции печени как метаболической реакции на инсульт. Кроме названных показателей у больных с ИИ выявлены изменения ионного состава крови, более высокий уровень триглицеридов и высокий атерогенный индекс. Все описанные сдвиги могут прямо или косвенно влиять на активность ферментов свертывания крови и генерацию эндогенного тромбина, а также на функциональное состояние тромбоцитов и биомеханические свойства сгустков крови, от которых в конечном счете зависит контракция.

Особого внимания заслуживает сопоставление параметров контракции сгустков с содержанием в крови больных с ИИ белка S-100, который является маркером повреждения нервной ткани и концентрация которого прямо пропорциональна объему фокального повреждения мозга [23]. Из параметров контракции была обнаружено слабая, но достоверная положительная корреляция длительности лаг-периода с концентрацией белка S-100 у больных с ИИ (r=0,28, p<0,05).

В результате проведенного статистического сравнительного анализа какой-либо достоверной связи степени и скорости контракции сгустка с патогенетическим подтипом инсульта, диаметром окклюзированного сосуда, сосудистым бассейном выявлено не было. Однако кластерный анализ показал, что исследуемая когорта пациентов с ИИ по основным показателям контракции кровяного сгустка разделяется на две группы. Анализ различий между этими группами (кластерами) пациентов с острым ИИ выявил статистически значимые (p<0,05) межгрупповые различия по уровню фибриногена (p=0,0017), гемоглобина (p=0,012), общего белка (p=0,032) и содержанию эритроцитов (p=0,03), что подтверждает объективный характер существования этих кластеров.

Параметры контракции сгустка и статистически значимые клинические показатели объединены в табл. 5. Видно, что в 1-й группе степень и скорость контракции были выше, чем во 2-й группе, т. е. были ближе к норме, что совпадает с меньшим сроком от начала инсульта до исследования контракции, но с большей тяжестью инсульта при поступлении по шкале NIHSS. Во 2-й группе, где степень и скорость контракции были существенно снижены, т. е. больше отклонялись от нормы, имели место больший срок от начала инсульта до исследования, но меньшая степень тяжести инсульта. Таким образом, можно предположить, что именно временной фактор от момента развития инсульта определяет трансформацию гемостаза и является одним из критериев успешности тромболитической терапии именно в период терапевтического окна. Следует отметить, что лаг-период обнаружил обратную зависимость от степени и скорости контракции: он был длиннее в 1-й группе и сочетался с большей тяжестью инсульта, но менее длительным сроком от появления симптомов заболевания до исследования. Корреляционный анализ по Спирмену показал, что из параметров контракции сгустка крови только анализ лаг-периода обнаружил положительную умеренную связь с объемом повреждения головного мозга (r=0,287, p<0,05) по данным нейровизуализации. Более длительный лаг-период сочетался с бо́льшим объемом повреждения, что согласуется с результатами кластерного анализа.

Изменения гемостатаза в сочетании с нарушениями макро- и микроциркуляции составляют важнейшее звено патогенеза ишемических поражений головного мозга [2]. Известно, что развитие ИИ сопровождается нарушением всех компонентов гемостаза, включая повреждение сосудистой стенки, сдвиги в тромбоцитарном и плазменном звеньях [11]. Непосредственной причиной поражения головного мозга является острая гипоперфузия, связанная с тромбозом или тромбоэмболией мозговых сосудов, от локализации и размеров которых прежде всего зависит обширность и тяжесть повреждения. Нередко тромбоз сосудов головного мозга сочетается с геморрагической трансформацией, что осложняет диагностику и ухудшает прогноз [24].

Очаги распада ткани мозга в результате ишемии являются дополнительными источниками поступления в кровь тканевого фактора и других веществ, обладающих прокоагулянтными свойствами. Все это усугубляет гиперкоагуляцию и тромбофилию, ведет к нарушению гемостатического баланса, в том числе к декомпенсации противосвертывающих механизмов [24], поэтому выявление и устранение гемостатических нарушений в остром периоде ИИ является важной лечебной задачей.

Процесс контракции кровяного сгустка остается одной из наименее изученных стадий свертывания крови. Особенно мало известно о контракции сгустков крови и обтурационных тромбов in vivo. Настоящая работа является первым исследованием контракции сгустка крови при инсульте. Результат состоит в том, что в крови пациентов с острым ИИ способность к контракции сгустка крови оказалась достоверно снижена по сравнению с нормой (см. табл. 1). Полученные нами данные позволяют объяснить этот феномен сочетанием нескольких механизмов.

Возможно, главной причиной сниженной контракции сгустков крови при ИИ является обнаруженное уменьшение функциональной активности и количества тромбоцитов. Известно, что движущей силой контракции сгустка являются активированные тромбоциты, прилипшие к волокнам фибрина. Одно из последствий активации тромбоцитов — взаимодействие внутриклеточных белков актина и миозина, которое приводит к сокращению клеток по механизму, похожему на сокращение мышечных волокон. Независимо от причин, по которым ИИ сопровождается нарушениями тромбоцитарного компонента гемостаза, это может повлечь снижение контрактильной активности тромбоцитов [25].

В то же время замедление контракции сгустка на начальной стадии объясняется повышением уровня антитромбина III (см. табл. 2), который подавляет активность тромбина и других сериновых протеаз — факторов Xa, IXa, XIa, и XIIa [26], что проявляется удлинением АЧТВ и лаг-периода контракции. Тромбин не только превращает фибриноген в фибрин, но и служит мощным активатором тромбоцитов. Нами было показано, что уменьшение активности эндогенного тромбина, несмотря на добавление экзогенного фермента, проявляется сниженной контракцией сгустков крови [19].

Недавно обнаружилось, что эритроциты также участвуют в контракции сгустка крови. Сократительная сила, генерируемая тромбоцитарно-фибриновым комплексом, плотно упаковывает и сжимает эритроциты, делая ядро сгустка плотным и непроницаемым для белков, включая ферменты фибринолиза [18], что объясняет неэффективность тромболитической терапии «старых» тромбов. Деформированные в результате контракции сгустка эритроциты приобретают форму многогранника (полиэдра), поэтому они получили название полиэдроцитов [18]. Полиэдроциты были обнаружены в составе коронарных тромбов у пациентов с инфарктом миокарда [27], что подтверждает контракцию сгустка крови in vivo. Выявленное в работе повышение гематокрита и уровня гемоглобина при ИИ полностью согласуется с данными об ингибирующем влиянии эритроцитов на контракцию сгустка.

Гиперфибриногенемия, установленная в данном исследовании у больных с ИИ, также может подавлять контракцию. Повышение концентрации фибриногена вскоре после появления неврологических симптомов описано у большинства больных с ИИ [28]. Известно, что при повышении концентрации фибриногена и образующегося из него фибрина, большее количество волокон не соприкасается с тромбоцитами и образует пассивную сеть, которая механически тормозит процесс контракции сгустка [14].

Обнаруженный нами феномен снижения контракции сгустка крови при остром ИИ может быть обусловлен целым рядом нарушений клеточного и биохимического состава крови. Независимо от механизма, нарушение контракции внутрисосудистого сгустка или тромба может играть важную роль в патогенезе И.И. На это косвенно указывает обнаруженная в работе статистически значимая прямая связь между объемом фокального повреждения головного мозга (по уровню белка S-100) и замедлением контракции (по длительности лаг-периода). Патофизиологичское значение контракции состоит в сохранении кровотока в обход обтурационного тромба, что может определять течение и исход тромбоза [17, 18]. В то же время плотный тромб, подвергшийся контракции, становится непроницаемым и может быть персистирующим из-за резистентности к действию фибринолитических ферментов, в первую очередь тканевого активатора плазминогена — тромболитика, используемого в клинической практике. Таким образом, последствия контракции могут быть противоречивыми, усугубляя или облегчая тромботическое состояние.

Этот вывод подтверждается сопоставлением параметров контракции сгустков с клиническими показателями тяжести и длительности заболевания у больных с острым ИИ (см. табл. 5). С одной стороны, изменение параметров контракции сочетается с большей длительностью заболевания, что указывает на прогрессирующий характер контракционной дисфункции. С другой стороны, ослабленная контракция сочетается с меньшей тяжестью инсульта при поступлении, что может говорить о положительном эффекте, например о сохранении проницаемости несжатого тромба для белков крови, включая фибринолитические ферменты, что открывает большие возможности для реканализирующей медикаментозной тромболитической терапии. Данный результат, а также тот факт, что замедление лаг-периода сочетается с большей тяжестью инсульта по шкале NIHSS и большим объемом повреждения по данным визуализации, наводит на мысль о возможности включения теста на контракцию сгустка крови в перечень лабораторных методов обследования больных с острым ИИ.

Все сказанное указывает на важность дальнейшего изучения контракции сгустка крови и как нового патогенетического механизма, и с точки зрения использования параметров контракции в качестве нового диагностического и прогностического метода при ИИ.