Рассеянный склероз (РС) — аутоиммунное демиелинизирующее заболевание ЦНС. В основе патогенеза лежит воспалительное повреждение миелиновых оболочек нервных волокон ЦНС [1]. Первый эпизод демиелинизации, проявляющийся характерной клинической картиной, называется клинически изолированным синдромом (КИС). Согласно современным критериям диагностики РС по McDonald 2010, установить переход из КИС в достоверный РС (ДРС) можно на основании развития второго обострения, а также при выявления новых или контрастируемых гадолинием очагов при МРТ [2]. Время до второго обострения сильно варьирует у разных пациентов [3]. У части больных КИС не трансформируется в ДРС, и предшествующий эпизод неврологического дефицита остается единственным за всю жизнь [4]. В ряде исследований было показано улучшение прогноза течения РС и удлинение времени до второго обострения при начале терапии на этапе КИС [5]. Поиск биомаркеров, предсказывающих конверсию КИС в РС, поможет не только в дифференциальной диагностике данного заболевания, но и в оценке риска перехода в ДРС, а также в определении терапевтической тактики.

Главным иммунологическим маркером РС является повышенная интратекальная продукция иммуноглобулинов (IgG), а также их клональная рестрикция, которая характеризуется появлениям олигоклональных полос (ОКП) IgG при проведении изоэлектрофокусирования цереброспинальной жидкости (ЦСЖ) [6—9]. Определение ОКП IgG считается «золотым стандартом» лабораторной диагностики РС [6]. Было показано, что обнаружение ОКП IgG во время КИС предсказывает будущую трансформацию КИС в ДРС [10]. Однако поскольку результаты методики являются качественными, а не количественными, это определяет ее субъективный характер [11].

Другим маркером интратекальной активации В-лимфоцитов при РС является повышение концентрации свободных легких цепей каппа и лямбда (k-СЛЦ, λ-СЛЦ) в ЦСЖ [12, 13]. СЛЦ представляют собой фрагменты IgG различных фракций, синтезирующихся параллельно ОКП. Было показано, что СЛЦ играют роль медиаторов в воспалительных реакциях, могут связываться с поверхностными рецепторами ряда клеток, а также обладают антигенной специфичностью [14]. В отличие от ОКП, у пациентов с КИС или РС возможно проводить количественную оценку СЛЦ в ЦСЖ, используя высокочувствительную и специфичную методику иммуноферментного анализа (ИФА). Цель работы — оценка диагностической значимости определения СЛЦ IgG в дебюте РС.

В исследовании приняли участие 226 пациентов Городского центра РС (ГЦРС) Санкт-Петербурга. Исследование было одобрено Локальным этическим комитетом ГКБ № 31. Все пациенты подписали добровольное информированное согласие на участие в исследовании. Проведен ретроспективный анализ данных, полученных за период с 2012 по 2016 г. В исследование были включены четыре группы пациентов. В 1-ю группу вошли пациенты с КИС, у которых переход в достоверный рецидивирующее-ремиттирующий РС (РРРС) был подтвержден в течение 2 лет в соответствии с критериями McDonald 2005 и 2010 г. (n=111). Во 2-ю группу вошли пациенты с КИС, у которых в течение первых 2 лет с момента КИС диагноз РРРС не был подтвержден (n=49). В 3-ю группу вошли пациенты с воспалительными заболеваниями ЦНС (3-я группа, n=20). Группа сравнения (4-я) состояла из пациентов с невоспалительными заболеваниями ЦНС (n=46). Всем пациентам с КИС люмбальная пункция выполнялась в течение первого года с момента первых симптомов до конверсии в достоверный РРРС. Пациенты из 3-й и 4-й групп обращались в Центр для консультации в связи с подозрением на РС. У всех из них на МРТ головного мозга имелись гиперинтенсивные очаги, схожие с таковыми при демиелинизирующем заболевании. По результатам дообследования диагноз РРРС был исключен, и было установлено другое заболевание воспалительного или невоспалительного генеза. Характеристики групп пациентов представлены в табл. 1.

Концентрация k-СЛЦ, λ-СЛЦ определялась в ЦСЖ (kл-СЛЦ и λл-СЛЦ) и сыворотке с помощью иммуноферментного анализа (ИФА) с анти-k- и анти-λ-моноклональными антителами против скрытых эпитопов СЛЦ (ООО «Полигност», Санкт-Петербург, Россия). Для оценки влияния сывороточной концентрации СЛЦ нами дополнительно оценивался коэффициент (Q) концентрации k-СЛЦ и λ-СЛЦ, определяемый по формуле (Q-k и Q-λ соответственно): Q-СЛЦ=СЛЦ_ЦСЖ/СЛЦ_{СЫВОРОТКА}. Для учета проницаемости гематоэнцефалического барьера (ГЭБ) использовался коэффициент альбумина: Q_АЛЬБ=АЛЬБ_ЦСЖ/АЛЬБ_{СЫВОРОТКА}. Для интерпретации содержания СЛЦ в ЦСЖ с учетом проницаемости ГЭБ использовались индексы k- и λ-цепей (I-k и I-λ соответственно): I_СЛЦ=Q_СЛЦ/Q_АЛЬБ.

Образцы ЦСЖ и сыворотки крови после забора хранились при температуре –80 °С. Определение ОКП проводилось методом изоэлектрофокусирования в агарозном геле с последующим имуноблоттингом. Анализ результатов осуществлялся на основании международных рекомендаций [15, 16].

Анализ данных был проведен при помощи программы для статистической обработки данных GraphPadPrism 7 («Graph Pad Software Inc., CA», USA). Проверка на нормальность проводилась тестом Колмогорова—Смирнова. В зависимости от типа распределения нами использовались параметрические (t-тест Стьюдента) или непараметрические (U-тест Манна—Уитни) методы оценки выборок. Для сравнения групп качественных признаков применялся тест χ². Числовые данные в результатах представлены как медиана и межквартильный диапазон. Уровень статистической значимости для всех тестов принимался при p<0,05.

Количество ОКП-позитивных пациентов во 2-й группе (43%) было значимо меньше, чем в 1-й (88%; p<0,0001) и 3-й (75%; p=0,0340).

Концентрации kл-СЛЦ, λл-СЛЦ, Q-λ и Q-λ были значимо выше в 1-й и 2-й группах, чем в 4-й группе. Сывороточные показатели СЛЦ не превышали норму во всех четырех группах (данные не представлены). В 1-й группе все показатели СЛЦ были значимо выше, чем во 2-й. При сравнении концентраций во 2-й и 4-й группах, оказалось, что только концентрация kл-СЛЦ и Q-k значимо отличались от показателей 4-й группы. В 3-й группе также наблюдалось значимое повышение всех показателей СЛЦ в сравнении с 4-й группой. Показатели синтеза СЛЦ в 3-й группе значимо не отличались от показателей в 1-й группе, однако были значимо выше, чем во 2-й группе (табл. 2).

Поскольку продукция ОКП и СЛЦ при РС является следствием интратекальной активации В-лимфоцитов, нами была оценена связь между продукцией ОКП и концентрациями СЛЦ. Концентрации СЛЦ и их коэффициенты были значимо выше у ОКП-позитивных пациентов (рис. 1).

Концентрации СЛЦ в 1-й и 2-й группах были оценены отдельно для ОКП-позитивных и ОКП-негативных пациентов. Выявлена значимая разница в концентрациях kл-СЛЦ, но не λл-СЛЦ между ОКП-позитивными пациентами в 1-й и 2-й группах (p=0,02 для kл-СЛЦ; p=0,1031 для λл-СЛЦ). При анализе результатов обследования ОКП-негативных пациентов также была установлена значимая разница в концентрациях kл-СЛЦ, а также в концентрациях λл-СЛЦ между 1-й и 2-й группами (р=0,0016 для kл-СЛЦ; р=0,0344 для λл-СЛЦ) (рис. 2).

По данным ROC-анализа наилучшими диагностическими характеристиками чувствительности и специфичности обладали kл-СЛЦ и Q-k (табл. 3, рис. 3).

В 1-й группе среди ОКП-негативных пациентов повышенная концентрация (>0,103 мкг/мл) kл-СЛЦ наблюдалась у 50% (n=6/12), что не встречалось ни у одного пациента из 2-й группы. Учитывая наличие повышенного синтеза СЛЦ при отсутствии синтеза ОКП, мы сравнили чувствительность определения ОКП и СЛЦ отдельно и при наличии хотя бы одного из этих показателей методом χ². Чувствительность определения ОКП составила 88%, значимо не отличалась от чувствительности при использовании обоих методов (94%; p=0,0934) (или ОКП-позитивный статус, или повышение СЛЦ). Чувствительность определения kл-СЛЦ составляла 88% и также значимо не отличалась от показателя при использовании обоих методов (94%; p=0,001).

Поиск и определение значимости клинических, лабораторных и инструментальных диагностических маркеров на сегодняшний день является одним из приоритетов в исследованиях Р.С. Анализ распространенности ОКП в нашей популяции показал, что у 88% пациентов 1-й группы имел место интратекальный синтез ОКП, что соответствует данным других авторов о чувствительности данного маркера [9, 10].

Уровень интратекальной продукции СЛЦ в 1-й и 2-й группах был значительно выше, чем в 4-й, что отражает наличие интратекального воспаления у пациентов с КИС и Р.С. Данные, полученные нами, также сопоставимы с результатами других исследований диагностической значимости СЛЦ при КИС и РС [17, 18]. Также было обнаружено, что уровень СЛЦ значительно выше у пациентов 1-й группы, чем 2-й. Возможно, это объясняется более выраженными воспалительными изменениями в случае предшествующей трансформации в РС. В представленном исследовании мы также сравнили уровень синтеза СЛЦ у пациентов с КИС и у пациентов с различными воспалительными заболеваниями ЦНС, которые в основном были ОКП-положительными. Концентрациия СЛЦ при воспалительных заболеваниях значительно варьировала, однако значимой разницы с 1-й группой получено не было. Это соответствует данным других исследований, хотя в некоторых из них концентрация k-СЛЦ при РС оказалась выше при вирусных и бактериальных инфекциях ЦНС [17]. Нами также показано, что концентрация kл-СЛЦ у ОКП-положительных пациентов в 1-й группе оказалась значительно выше, чем у ОКП-положительных пациентов во 2-й группе.

В данном исследовании концентрации λл-СЛЦ в 1-й группе не превышали показатели во 2-й группе, что отражает свойственную для РС тенденцию к интратекальному синтезу преимущественно k-СЛЦ. СЛЦ могут также быть независимым от ОКП показателем уровня интратекальной воспалительной активности заболевания. Нами обнаружена статистически значимая разница концентрации kл-СЛЦ и λл-СЛЦ между 1-й и 2-й группами у ОКП-отрицательных пациентов. Возможно, этот факт отражает стадийность развития РС, когда у пациентов с КИС олигоклональный синтез Ig еще не обнаруживается, но присутствует значительное интратекальное воспаление. Обнаруженный феномен требует дальнейших исследований.

Анализ ROC-кривой показателей синтеза СЛЦ продемонстрировал, что наиболее высокой диагностической информативностью обладают kл-СЛЦ и Q-k, что также сопоставимо с данными других исследований [11]. Чувствительность kл-СЛЦ оказалась сопоставима с чувствительностью ОКП. Использование индексов I-k, I-λ, учитывающих уровень проницаемости ГЭБ, оцениваемого с помощью Q_альб, не привело к увеличению чувствительности показателей. Нужно отметить, что некоторыми авторами отмечено значительное улучшение диагностических показателей СЛЦ при учете уровня проницаемости ГЭБ [17]. Кроме этого, нами показано, что в группе использование kл-СЛЦ в качестве дополнительного маркера позволяет на 50% уменьшить количество ложноотрицательных результатов анализа на ОКП.

В ходе исследования нами было показано, что kл-СЛЦ и Q-k обладают достаточно высокой чувствительностью и специфичностью для диагностики КИС, использование СЛЦ как лабораторного маркера может повышать точность диагностики РС для ОКП-негативных пациентов, а также дает возможность косвенно оценить риск перехода КИС в ДРС в течение последующих 2 лет.

Работа выполнена на средства гранта Российского Научного Фонда, номер заявки 16−15−10203.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.