Черепно-мозговая травма (ЧМТ) в остром периоде сопровождается симптоматическими судорожными приступами, вызванными первичным и вторичным повреждением ткани головного мозга — клеточной гибелью, нарушением гемато-энцефалического барьера, нейровоспалением, измененным высвобождением нейромедиаторов и ионов. Известно, что острые судорожные приступы у пациентов с ЧМТ — значимый фактор риска возникновения посттравматической эпилепсии (ПТЭ) [1]. В позднем периоде после развития первого неспровоцированного судорожного приступа вероятность возникновения последующих крайне высока [2], что позволяет, согласно критериям ILAE, диагностировать у пациентов эпилепсию [3]. В большинстве случаев по клиническим, электроэнцефалографическим (ЭЭГ) данным и результатам магнитно-резонансной томографии (МРТ), у этих пациентов развивается медиальная височная эпилепсия [4]. Механизмы ПТЭ включают в себя отсроченную клеточную гибель, дисфункцию астроцитов и реорганизацию нейронных сетей в результате клеточной и синаптической пластичности. Ключевой анатомической структурой этих изменений является гиппокамп. Склероз гиппокампа сопровождающийся гибелью нейронов в полях гиппокампа CA1, CA3 и зубчатой извилине, а также астроцитарным глиозом, представляет собой наиболее частый патоморфологический субстрат заболевания [5]. В измененном гиппокампе формируются патологические сети со спонтанной синхронной активацией большого пула нейронов; клиническим проявлением такой гиперсинхронизации служат поздние неспровоцированные судорожные приступы [6]. В отдаленном периоде ЧМТ спонтанные судорожные приступы развиваются у 10—20% пациентов [1], однако до настоящего времени в клинической практике не существует ни достоверных маркеров развития ПТЭ, ни способов ее предотвращения [7]. Это связано в первую очередь с тем, что первичные механизмы запуска перечисленных изменений остаются недостаточно изученными.

Для исследования механизмов возникновения ПТЭ, а также поиска стратегии лечения пациентов используются различные модели на животных. Наиболее валидной (приближенной к характеристикам ЧМТ у человека) считается модель латерального гидродинамического удара (жидкостно-перкуссионной травмы головного мозга) на крысах [8, 9]. Для этой модели показано развитие ПТЭ в позднем периоде с возникновением неспровоцированных судорожных приступов и интериктальной эпилептиформной активности. Поздний период также характеризуется выраженными изменениями гиппокампа — спрутингом мшистых волокон, глиозом и гибелью нейронов [10]. При этом острый период ЧМТ, имеющий ключевое значение в запуске механизмов посттравматического эпилептогенеза, остается недостаточно изученным. В частности, до сих пор очень мало известно о возникновении и природе ранней эпилептиформной активности и ее потенциальной связи с ранними изменениями в гиппокампе.

Цель работы — выявление и анализ патологической электрофизиологической и поведенческой активности в остром периоде ЧМТ и поиск возможных морфологических коррелятов этой активности в коре и гиппокампе.

Работа выполнена на 18 самцах крыс линии Sprague-Dawley в возрасте около 6 мес (масса 450—550 г) из питомника Пущино (Московская область). В группу крыс с ЧМТ вошли 11 животных, в группу «ложная операция» (ЛО) — 7.

Ход эксперимента и хирургические операции. Все хирургические операции осуществляли под ингаляционным 2% изофлурановым наркозом. После скальпирования и удаления височных мышц эпидуральные электроды из нержавеющей стали вживляли в симметричные точки над фронтальной (AP=1, L=3) и затылочной корой (AP= –7, L=3) с сохранением области для последующей краниотомии. Референтный электрод вживляли в каудальную часть затылочной кости по средней линии. После операции крыс помещали в отдельные камеры со свободным доступом к воде и пище при естественном освещении, электрокортикограмму (ЭКоГ) регистрировали в течение 7 сут одновременно с непрерывной видеорегистрацией.

Для моделирования ЧМТ трепанацию черепа диаметром 3 мм в правой теменной кости (AP=3 мм, L=3 мм) осуществляли через 7 сут после вживления электродов. По краю трепанационного отверстия с помощью цианоакрилатного клея фиксировали головку инъекционной иглы типа Люэр. Через 1 ч после краниотомии и выхода из наркоза крысе в свободном поведении наносили латеральный гидродинамический удар (3,4±0,1 атм). Крысы группы ЛО отличались от крыс группы ЧМТ только отсутствием гидродинамического удара. После проведения ЧМТ животных помещали в домашние клетки. Регистрацию видео и ЭКоГ продолжали в течение 7 сут после травмы. Далее наркотизированных хлоралгидратом (450 мг/кг внутрибрюшинно) крыс выводили из эксперимента интракардиальной перфузией 4% раствора параформальдегида в 0,1 М фосфатном буфере (pH 7,4).

Анализ медленноволновой активности. В программе EDF browser 1.57 выбирали участки записи через 1, 6, 12, 18 и 24 ч после ЧМТ. Применяли фильтр Баттерворта с нижней границей 1 Гц и с верхней — 30 Гц. Спектральная плотность мощности сигнала ЭКоГ на низких частотах имела два максимума: 1,3—1,6 и 2,2—3,0 Гц. Спектральную плотность мощности измеряли в коре ипсилатерального и контралатерального полушария во время пассивного бодрствования крысы для каждого максимума отдельно. Для каждой временно́й точки измерения проводили на трех разных фрагментах длительностью 3—5 с, данные усредняли для каждой временно́й точки.

Анализ эпилептиформной активности. Анализировали 24-часовые фрагменты записи в фоне и на 6-е сутки после травмы. Записи разбивали на 20-секундные эпохи; для дальнейшего анализа выбирали эпохи, в которых присутствовала эпилептиформная активность (отобрано 1100 эпох из 78 000). Для каждой выбранной эпохи отмечали принадлежность к фазе цикла сон—бодрствование, а также поведение крысы в домашней камере.

Гистологические методы. Изготавливали вибротомные срезы головного мозга крысы толщиной 50 мкм. Для дальнейшего анализа выбирали срезы с расстоянием в 600 мкм с координатами между 2,1 и 5,8 мм от брегмы. Срезы окрашивали крезилвиолетом по методу Ниссля. Проводили иммуногистохимическое окрашивание на выявление глиального фибриллярного кислого протеина (Glial fibrillary acidic protein — GFAP), маркера астроглии (Polyclonal Rabbit-Anti GFAP, «Dako», Дания), разведение 1:500, вторичных антител (Goat Anti-Rabbit IgG, «Alexa Fluor», США), разведение 1:500. Кроме того, окрашивали на Isolectin B4 — маркер микроглии (Biotinylated Griffonia Simplicifolia Lectin I isolectin B4, «Vector Laboratories», США), разведение 1:100, проявление — Streptavidin 488 («Alexa Fluor», США), разведение 1:500. Микрофотографии срезов, окрашенных по методу Ниссля, просматривали на микроскопе Keyence BZ-X700 при помощи иммерсионной микроскопии (ув. 60). На выбранных четырех срезах подсчитывали общее число темных нейронов с ишемической морфологией (типичные признаки: темная цитоплазма, вогнутые контуры, зона перифокального отека, извитые отростки) в полиморфном слое зубчатой извилины гиппокампа с двух сторон, данные усредняли для каждого полушария. Микрофотографии (ув. 20) иммуногистохимически окрашенных срезов делали для дальнейших расчетов в программе ImageJ. По срезам определяли площадь повреждения в коре, а также число всех микроглиальных и астроглиальных клеток в полиморфном слое зубчатой извилины гиппокампа, площадь зубчатой извилины гиппокампа и далее рассчитывали плотность клеток как отношение этих двух параметров.

Эксперименты с животными выполнены в соответствии с требованиями Директивы 2010/63/EU Европейского парламента и совета от 22.09.10 и Приказа Минздрава России № 267 от 19.06.03 в области защиты и использования животных в экспериментальных исследованиях. Протокол эксперимента утвержден Этической комиссией ИВНД и НФ РАН. Были предприняты все меры для уменьшения числа используемых животных и минимизации их страданий.

Статистические методы. Все расчеты выполнены в программе Statistica 10 («StatSoft, Inc.», США). Для сравнения групп ЧМТ и ЛО в электрофизиологической и морфологической частях работы использовали критерий Манна—Уитни; сравнения в морфологической части работы между полушариями осуществляли с помощью критерия Вилкоксона. Данные представлены в виде среднего значения и стандартной ошибки среднего (M±SEM).

У 7 из 10 животных группы ЧМТ наблюдали немедленные тонико-клонические судороги продолжительностью 30 с (3 крысы были исключены из эксперимента), за которыми следовали 3—5-минутная потеря позы и отсутствие реакции на внешние стимулы. У остальных крыс наблюдали гипермоторное состояние, сменявшееся также 3—5-минутной потерей позы.

Замедление фоновой электрофизиологической активности. В фоновых записях, а также у крыс группы ЛО фокальных замедлений фоновой активности не отмечалось. У всех крыс после ЧМТ регистрировалось замедление фоновой активности в ипсилатеральном травме полушарии через 1 ч после травмы и у 70% животных — через 6 ч после травмы. Через 12, 18 и 24 ч после травмы замедление фоновой активности наблюдали только у 20% крыс.

При сравнении частот, на которые приходятся максимумы, достоверных различий между группами и временны́ми точками выявлено не было.

Спектральная плотность мощности выбранных участков сигнала ЭКоГ для ипсилатерального полушария была достоверно выше через 1 и 6 ч после травмы для обоих максимумов: на интервале частот 1,3—1,6 Гц значения через 1 ч после ЧМТ составляли в контралатеральном полушарии 730±180 мкВ²/Гц против 2840±590 мкВ²/Гц в ипсилатеральном (р<0,005), через 6 ч — 1050±260 мкВ²/Гц против 3230±750 мкВ²/Гц (р<0,05); на интервале частот 2,2—3,0 Гц — 450± 100 мкВ²/Гц против 2640±1070 мкВ²/Гц (р<0,005) и 910±230 мкВ²/Гц против 3760±1210 мкВ²/Гц (р<0,005) через 1 и 6 ч соответственно.

Эпилептиформная активность. Эпилептиформная активность была представлена высокоамплитудными ритмичными (около 7 Гц) вспышками, состоящими из нескольких спайков, в лобных областях билатерально. Периодически в структуре разряда перед отдельными спайками регистрировалась низкоамплитудная медленная волна. Эпилептиформная активность встречалась у всех крыс как в фоне, так и после ЧМТ или Л.О. Различий в структуре эпилептиформной активности между группами или временны́ми точками обнаружено не было.

Из 18 крыс, участвующих в эксперименте, у 3 (17%) в фоне среднее число эпох с эпилептиформной активностью было в 20 раз выше, чем у остальных, что привело к их исключению из исследования.

Число эпох с эпилептиформной активностью у крыс группы ЛО оставалось на одном и том же уровне до и после краниотомии. У 50% крыс после ЧМТ среднее число эпох с эпилептиформной активностью возросло в 20 раз по сравнению с фоном. По возрастанию числа эпох с эпилептиформной активностью крыс после ЧМТ разделили на две подгруппы: животные с увеличением эпилептиформной активности и без увеличения; это разделение было использовано для дальнейшего анализа.

В общей сложности было проанализировано 650 эпох с эпилептиформной активностью. Средняя продолжительность разряда составляла 2,2±0,2 с и не различалась у крыс разных подгрупп. Среднее число разрядов за сутки у крыс с увеличением эпилептиформной активности составляло 86,4±22,2, что было выше фонового показателя (9,0±2,5, p<0,01), а также выше, чем у крыс в подгруппе без увеличения эпилептиформной активности после ЧМТ (4,6±1,2, p<0,01), и у животных группы ЛО (14,4±6,4, p<0,01).

Сгруппированы были 70% всех разрядов (в среднем 2,8±0,1 разряда); число разрядов в такой группе не различалось между крысами ЛО и ЧМТ. Сгруппированные и одиночные разряды появлялись преимущественно во время перехода из бодрствования к NREM-сну, однако достоверное увеличение числа разрядов наблюдали по отдельности для каждой фазы цикла: во время бодрствования (p<0,05 при сравнении с подгруппой без увеличения эпилептиформной активности, крысами группы ЛО, а также при сравнении с фоном), перехода из бодрствования в NREM-сон (p<0,05) и во время NREM-сна (p<0,05). В течение REM-сна не было обнаружено ни одного разряда.

На протяжении всех проанализированных эпох животные не двигались. Были выбраны эпизоды во время бодрствования, которые сопровождались остановкой двигательной активности непосредственно перед возникновением разряда и возобновлением двигательной активности сразу после окончания разряда (или группы разрядов). Среднее число эпизодов таких замираний было достоверно выше у крыс с увеличением эпилептиформной активности после ЧМТ (10,4±3,0) в сравнении с показателями в фоне (0,2± 0,2, p<0,01) и крысами без увеличения эпилептиформной активности после ЧМТ (1,2±0,6, p<0,05).

Выявление эпилептиформной активности в раннем периоде ЧМТ и ее сравнение с фоновыми показателями является новым, поскольку такой экспериментальный подход использован впервые. Ранее в работах было показано наличие спайк-волновых разрядов у взрослых крыс линии Sprague-Dawley [11], частота возникновения разрядов зависела от возраста [12]. Ряд авторов [13] связывают эпилептиформную активность с движениями вибрисс, однако этот вопрос остается не до конца ясным, поскольку активность может и не сопровождаться движениями периоральных мышц у крысы [14].

В настоящей работе подобные разряды сопровождались замиранием животных, что может рассматриваться как аналог фокальных приступов у человека. При анализе посттравматических разрядов у крыс такой тип эпилептиформной активности исключается из анализа большинством авторов как не связанный с травмой [6, 15]. Регистрация ЭКоГ до ЧМТ в проведенном эксперименте позволяет точно определить динамику эпилептиформной активности в результате травмы. Кроме того, протокол эксперимента позволяет исключить животных (17%) с исходно высоким числом разрядов, что не может быть сделано в большинстве работ по изучению ПТЭ на крысах.

Таким образом, значение бифронтальных разрядов 7 Гц у крыс является предметом дискуссии, однако не известны работы, в которых было подробно описано увеличение числа разрядов в раннем периоде ЧМТ. Синхронизация работы нейрональных сетей, ответственных за формирование этой формы эпилептиформной активности, может являться важным, хотя пока подробно не изученным звеном ПТЭ у крыс.

Результаты гистологического анализа. Повреждения в неокортексе. Очаг в коре ипсилатерального полушария определяли по интенсивному окрашиванию на GFAP и Isolectin B4. Клетки микроглии имели округлую форму, в центре повреждения визуально отмечалось выраженное увеличение их числа. Астроциты имели утолщенные отростки, интенсивное окрашивание и располагались в центре и по периферии очага микроцитарного глиоза, превосходя его по площади: площадь астроцитарного глиоза в коре ипсилатерального полушария у крыс группы ЧМТ составила 2,00±0,32 мм²; площадь микроцитарного глиоза — 0,24±0,13 мм². У крыс группы ЛО отмечался только поверхностный астроцитарный глиоз в коре в области краниотомии.

Дистантное повреждение в гиппокампе. У крыс группы ЧМТ при сравнении с крысами группы ЛО в зубчатой извилине гиппокампа обоих полушарий наблюдали увеличение числа темных нейронов, обладающих ишемической морфологией. В ипсилатеральном полушарии увеличение числа темных нейронов было на уровне статистической тенденции (23±10 клеток против 41±7 клеток, p=0,08). Для контралатерального полушария различия являлись достоверными (22±7 клеток против 48±9 клеток, p<0,05).

Средняя площадь зубчатой извилины не различалась у крыс разных групп и при сравнении полушарий. Плотность микроглиальных клеток в зубчатой извилине гиппокампа была значимо выше в ипсилатеральном гиппокампе крыс группы ЧМТ (1364±118 клеток/мм) при сравнении с группой ЛО (919±73 клеток/мм, p<0,05). Значимые отличия также наблюдали при сравнении ипси- и контралатерального полушария в группе ЧМТ (p<0,05). Плотность астроглии в зубчатой фасции гиппокампа при этом не различалась между группами.

Сопоставление электрофизиологических и гистологических результатов. Не обнаружены корреляции числа эпох с эпилептиформной активностью через 6 сут после травмы с длительностью, частотой или спектральной плотностью мощности замедления фоновой активности в 1-е сутки после травмы. При сопоставлении данных, полученных в электрофизиологической и морфологической исследованиях работы, показано, что в группе крыс с ЧМТ наблюдалась положительная корреляция площади астроцитарного глиоза с числом эпох, содержащих эпилептиформную активность (r=0,70, p=0,04). Кроме того, была выявлена положительная корреляция числа темных нейронов в контралатеральной зубчатой извилине гиппокампа с числом эпох, содержащих эпилептиформную активность (r=0,77, p=0,001). Корреляция плотности микроглиальных клеток в зубчатой фасции ипсилатерального и контралатерального гиппокампа с числом эпох с эпилептиформной активностью не была достоверной.

В настоящем эксперименте впервые был проведен анализ возможных морфологических коррелятов выявленной активности. Обнаружена прямая зависимость между площадью астроцитарного глиоза в коре и числом разрядов. Формирование очага повреждения в коре, как известно, сопровождается активацией глии, экспрессией цитокинов, дисфункцией астроцитов, накоплением внеклеточного К⁺ — все это может приводить к гиперсинхронизации нейронов в коре [16] и возникновению эпилептиформной активности. Очевидно, что нейронные механизмы такой эпилептиформной активности требуют дальнейшего изучения.

Характерной для медиальной височной эпилепсии патологией является склероз гиппокампа [5]. К сожалению, в работах с участием человека невозможно проследить патоморфологические изменения в динамике — в частности, ничего не известно о ранних изменениях в гиппокампе после ЧМТ. В настоящей работе в гиппокампе наблюдалось увеличение числа темных нейронов, имеющих ишемическую морфологию. В ипсилатеральном полушарии эти различия выявлялись на уровне статистической тенденции, что может быть объяснено гибелью клеток в зубчатой извилине ипсилатерального гиппокампа [17, 18], что было показано в более раннем исследовании [19].

Интересным является тот факт, что у крыс с большим числом эпилептиформной активности количество ишемических нейронов в контралатеральном гиппокампе также больше. Возможно, эпилептиформная активность в коре является одним из факторов, запускающих механизмы гибели клеток в гиппокампе и принимающих участие в запуске механизмов эпилептогенеза.

Активация микроглии в зубчатой фасции ипсилатерального гиппокампа имеет важное значение в развитии посттравматической патологии, в том числе ПТЭ [10]. В проведенном эксперименте активация микроглии наблюдалась у всех крыс группы ЧМТ и не коррелировала с числом разрядов. Иными словами, у всех крыс независимо от уровня эпилептиформной активности в коре возникали процессы нейровоспаления в гиппокампе. Полученные результаты могут свидетельствовать о разных механизмах, лежащих в основе возникновения эпилептиформной активности и дистантного повреждения гиппокампа в остром периоде ЧМТ, и требуют дальнейшей экспериментальной проверки.

Таким образом, по результатам проведенного эксперимента можно сделать следующие выводы:

1) у всех крыс линии Sprague-Dawley регистрируется региональное замедление фоновой активности через 1 ч после ЧМТ, у 70% крыс — через 6 ч и лишь у 20% — через 18—24 ч. Спектральная плотность мощности сигнала ЭКоГ на низких частотах через 1 и 6 ч выше у крыс после ЧМТ в ипсилатеральном полушарии по сравнению с контралатеральным;

2) в ростральных отделах больших полушарий головного мозга билатерально регистрируется эпилептиформная активность, представленная ритмичными высокоамплитудными спайками в 7 Гц. У 17% животных число разрядов многократно превышает средние показатели остальных крыс. Эти животные с большим числом эпилептиформной активности в фоне были исключены из дальнейшего анализа;

3) через 1 нед после ЧМТ у ½ крыс наблюдается многократное увеличение числа разрядов как при сравнении с фоновыми показателями, так и при сравнении с остальными крысами после ЧМТ и ложнооперированными животными;

4) в ипсилатеральном полушарии у крыс группы ЧМТ через 1 нед после травмы в коре головного мозга наблюдается очаг повреждения с астроцитарной активацией и активацией микроглии; в полиморфном слое зубчатой извилины ипсилатерального гиппокампа определяется увеличение плотности микроглиальных клеток. Увеличение числа темных нейронов происходит в зубчатой извилине гиппокампа обоих полушарий;

5) выявляется положительная корреляция площади астроцитарного глиоза в коре ипсилатерального полушария и числа разрядов в группе крыс с ЧМТ. Кроме того, положительная корреляция наблюдается между числом темных нейронов в зубчатой извилине контралатерального полушария с числом разрядов через 1 нед после ЧМТ. Активация микроглии в зубчатой фасции ипсилатерального гиппокампа присутствует у всех крыс после ЧМТ и не коррелирует с появлением эпилептиформной активности.

Поддержано грантами РФФИ № 16−04−00855 (анализ ЭЭГ) и № 18−315−00146 (гистологический анализ).

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

*e-mail: komoltsev.ilia@gmail.com