Стресс — состояние повышенного напряжения организма, возникающее при отсутствии адекватной адаптивной реакции на стимулы окружающей среды (стрессоры). В норме их воздействие вызывает мобилизацию адаптационных возможностей организма. Когда вследствие тех или иных причин сопротивляемость организма снижается, наступает так называемая стадия истощения (дистресс), затяжной период которого может вести к развитию различных хронических заболеваний [1].

Хронический стресс снижает жизнеспособность нейронов и ведет к нейродегенерации. Даже умеренный хронический стресс приводит к появлению таких признаков нейродегенерации, как нарушение синаптической передачи, накопление бета-амилоида и гиперфосфорилирование тау-белка [2—5]. Эти эффекты реализуются на фоне избыточной активации глутаматных NMDA-рецепторов, что приводит к эксайтотоксической гибели нейронов [6].

Одним из факторов, способствующих развитию стресса, является недостаточность микронутриентов, в частности лития. Литий — эссенциальный микроэлемент, необходимый для нормального функционирования нервной системы. Результаты экспериментальных исследований свидетельствуют о его нейротрофических и нейропротективных эффектах. Применение препаратов лития повышает синтез нейротрофических факторов, препятствует гибели нейронов через модуляцию каскада апоптоза PI3K/Akt/GSK3. В очень малых дозах (мкг и мг) литий крайне важен как ион специфически (незаменимо) обеспечивающий активность молекулярных каскадов, которые способствуют ускорению роста нейронов и повышению их устойчивости к окислительному стрессу [7], улучшению пространственной памяти, предотвращению негативного влияния на нее хронического стресса [8]. Применение лития в безопасных малых дозах вызывает увеличение объема серого вещества мозга [9—11]. По нашим данным, аскорбат лития в 8,4 раза менее токсичен, чем неорганическая соль карбоната лития. Аскорбат лития характеризуется наилучшими параметрами острой токсичности: так, LD50 аскорбата лития для крыс Вистар составляет — 6334 мг/кг, что позволяет отнести субстанцию аскорбата лития к 5 классу «практически нетоксичных» веществ с LD50 ≥ 5000 мг/кг.

Цель исследования — изучение нейропротективных свойств аскорбата лития (АЛ) в моделях стресса in vivo и in vitro.

Защитные свойства АЛ иссследованы in vivo на двухмесячных крысах линии Вистар в условиях транспортного и иммобилизационного стресса и in vitro в культуре зернистых нейронов мозжечка, подвергнутых цитотоксическому действию глутамата.

Задачей исследования являлась оценка защитных свойств парентерального введениия АЛ в различных дозах на моделях стресса. Было сформировано 5 групп по 36 животных в каждой, подобранных по принципу парных аналогов. За 7 сут до начала эксперимента животных выдерживали на карантине. Крысы всех групп содержались в стандартных условиях вивария в клетках по 18 животных. Корм — премикс ПЛЖ (в соответствии с ГОСТ Р 50258−92), подстилка — мелкая сухая стружка. 1-я группа — контроль (крысы получают воду); 2-я группа — АЛ вводился в дозе 120 мг/кг от массы тела; 3-я группа — АЛ вводился в дозе 60 мг/кг; 4-я группа — АЛ вводился в дозе 30 мг/кг; 5-я группа — интактные крысы (без модели стресса). АЛ в группах 2—4 вводили в одно и то же время, через 2 ч после утреннего кормления в виде раствора через зонд, в качестве растворителя использовали воду для инъекций («Буфус» Новосибхимфарм), объем введения — 1,5 мл. В группах 2−4 АЛ вводили в течение 3 нед. Еженедельно для определения защитного эффекта проводили тесты на подвешивание и имитацию транспортного стресса.

Тест подвешивания. Животное подвешивали на 24 ч, после завершения эксперимента из подъязычных сосудов в пробирку забирали цельную кровь. Для определения числа эозинофилов в цельной капиллярной крови по методу Дункера забор проводили после отсечения кончика хвоста. Метод основан на сохранении эозинофилов в растворе ацетона, при котором все остальные клетки крови разрушаются. Подсчет клеток проводили в камере Горяева не позднее чем через 30 мин после забора крови. Количество эозинофилов подсчитывали в 100 больших квадратах и умножали на 50, что соответствует их количеству в 1 мкл. В сыворотке крови определяли содержание адреналина и норадреналина, которые являются специфическими маркерами воздействия на стресс. По 6 отобранных животных из каждой группы помещали в эксикатор с диэтиловым эфиром и проводили спинальную декапитацию для обследования брюшной полости и подсчета количества язв на слизистой желудка.

Тест имитации транспортного стресса. Проводили на универсальном вращающемся шейкере Unimax-1010. На его площадке закрепляли клетку, в которую помещали 5 животных, находящихся в свободном состоянии. Последовательно проводили три эксперимента с интервалами в 7 сут, по 240 мин каждый, при скорости вращения 120 об/мин. По окончанию теста на основании описанных выше методик осуществляли изучение состояния организма животных. В сыворотке крови определяли содержание аланинаминотрансферазы (АЛТ), аспартатаминотрансферазы (АСТ), креатинина (автоматический биохимический анализатор Konelab-20i, Финляндия—США).

Тест открытое поле (ТОП). Регистрировали горизонтальную и вертикальную двигательную активность, груминг, обнюхивание отверстий, дефекацию. Кроме того, наблюдали за такими моторными отклонениями, как шаткость походки, тремор и др.

Использованы 7—8-суточные культуры, полученные методом ферментно-механической диссоциации клеток мозжечка 7-дневных крыс по ранее описанной методике [12]. Животных умерщвляли летальной дозой эфирного наркоза, после чего 5 мин стерилизовали 70% этанолом, извлекали мозжечок и переносили его в пластиковую чашку Петри с фосфатным буфером, лишенным ионов кальция и магния. Фрагменты ткани инкубировали 15 мин при 37 ^оС в фосфатном буфере, содержащем 0,05% трипсина, 0,02% ЭДТА и 0,8% глюкозы. После инкубации ткань промывали в двух сменах фосфатного буфера и один раз — в питательной среде культивирования, в которой затем подвергали механической диссоциации. В ее состав входило 90% среды «Игла», 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мМ глутамина, 5 мМ KCl и 10 мМ буфера Нереs, pH 7,2—7,4.

Суспензию клеток центрифугировали 1 мин при 1000 об/мин, супернатант удаляли, а осадок ресуспендировали в питательной среде. Культивирование проводили в 96-луночных пластиковых планшетах, покрытых полиэтиленимином или полилизином, где уровень хлорида калия был доведен до 25 мМ. В каждую ячейку планшета добавляли по 0,1 мл суспензии клеток.

Культивирование проводили 7—8 сут в инкубаторе, заполненном газовой смесью (95% воздуха и 5% СО₂), при температуре 35,5 ^оС и относительной влажности 98%. К этому сроку культивированные зернистые нейроны (КЗН) достигают своей морфологической и нейрохимической зрелости. Состояние культур контролировали ежедневно путем визуального просмотра в инвертированном микроскопе при фазовом контрасте.

Раствор АЛ готовили из нового сухого вещества непосредственно перед внесением в среду культивирования. Раствор стерилизовали фильтрацией и добавляли в питательную среду на 2-е сутки in vitro на весь срок культивирования (до 7 сут). В части экспериментов АЛ добавляли в среду на 7 сутки in vitro, за 3 ч до воздействия глутамата. Были выбраны следующие его концентрации: 0,1, 0,2, 0,5 и 1,0 мМ. Поскольку КЗН имеют рецепторы глутамата, а к 7-му дню in vitro происходит их созревание, их гиперстимуляция с помощью экзогенного глутамата вызывает гибель КЗН, что является удобной моделью нейродегенации [13, 14]. Глутамат (Sigma, USA, N. G-1626) при добавлении к культурам на 7-е сутки оказывал дозозависимый токсический эффект (рис. 1). Выбор концентрации проводили в каждом опыте таким образом, чтобы выживаемость КЗН составляла 30—80% от контроля. Такая выживаемость позволяет выявить действие различных веществ на процесс гибели клеток. При выживаемости менее 30% или более 80% нейропротективные эффекты могут не обнаружиться. Использовали подсчет клеток при действии потенциальных нейропротекторов, добавляя в питательную среду подобранные токсические концентрации глутамата (50—250 мкМ).

На каждую точку брали по 3 культуры, в каждой из которых фотографировали и просчитывали последовательно по 5 полей зрения (45 полей из 9 культур в 3 независимых экспериментах), распределение переменных носило нормальный характер. Количество нейронов с неизмененной морфологией в контрольных культурах принимали за 100% выживаемости.

Для статистического анализа использовали тест ANOVA с поправками Бонферрони/Даннетта и непараметрический тест Колмогорова—Смирнова, который отличается высокой чувствительностью и применим для анализа выборок вне зависимости от условия нормальности распределения. Различия между группами считали достоверными при p<0,05. Результаты представлены в виде M±SD.

В тесте подвешивания количество язв желудка, которое прямо коррелировало со степенью выраженности стресса, под влиянием АЛ заметно снижалось. Более длительный прием препарата приводил к более выраженному снижению числа язв (табл. 1). Отличия между 1-й и контрольной группами в соответствии с t-критерием оказались статистически достоверными (р<0,05).

Число эозинофилов в цельной крови и концентрации адреналина и норадреналина являются специфическими маркерами воздействия различных стресс-факторов. С возрастанием дистресса число эозинофилов падает (эозинопения — характерный биомаркер стресса), а адреналина и норадреналина — возрастает (стресс стимулирует секрецию катехоламинов симпатическими ядрами и корой надпочечников). Применение А.Л. приводило к сохранению пула эозинофилов (табл. 2) и снижению концентраций адреналина и норадреналина (табл. 3).

Модель транспортного стресса. Применение А.Л. оказалось эффективным в условиях транспортного стресса, неестественного для животных и поэтому вызывающего у них выраженную поведенческую реакцию. При назначении препарата животные более активно стремились снизить неблагоприятные воздействия стресса и адаптироваться к меняющимся условиям: пытались найти место, наименее подверженное колебаниям, тесно группировались, чтобы колебания группы компенсировали колебания платформы аппарата.

Данные анализа крови и биохимические показатели подтвердили поведенческие критерии адаптогенной активности А.Л. Препарат способствовал сохранению пула эозинофилов в крови (табл. 4) и нормализации концентраций АЛТ и креатинина, что указывает на снижение степени отрицательного воздействия стресса на печень (табл. 5).

Таким образом, экспериментальные данные свидетельствуют, что при пероральном введении АЛ происходит быстрая, в течение первых 7 суток, адаптация организма к использованным моделям стресса. Минимальная доза препарата (30 мг/кг) существенно не уступает по эффективности более высоким дозам (60—120 мг/кг).

Для определения степени возбуждения крыс при дистрессе использовался ТОП. Непосредственно перед исследованием животные в течение 5 дней получали А.Л. Оказалось, что препарат дозозависимо улучшает показатели двигательной и исследовательской активности и снижает выраженность дистресса (табл. 6).

Как показал анализ эмпирических функций распределения средних чисел с использованием теста Колмогорова—Смирнова, АЛ (без добавления глутамата) в диапазоне концентраций от 0,1 до 1,0 мМ нетоксичен для КЗН (рис. 2).

При цитотоксическом действии глутамата (100 мкМ) АЛ в указанном диапазоне концентраций оказывал выраженный нейропротективный эффект. Анализ функций распределения средних чисел выживших нейронов при всех концентрациях АЛ показал достоверное отличие от результатов, полученных при действии только глутамата (рис. 3). Результаты применения АЛ даже в минимальной концентрации (0,1 мМ) приводили к достоверным отличиям (D=0,19; р=0,049). При повышении концентрации выраженность отличий увеличивалась (значения максимального уклонения D возрастали, а значения р — снижались), а при самой высокой концентрации (1,0 мМ) отличия между глутаматной токсичностью и контролем были на грани статистической значимости (D=0,17; р=0,059). Таким образом, АЛ во всем изученном диапазоне концентраций (0,1—1,0 мМ) повышал выживаемость нейронов при глутаматном стрессе.

Анализ данных с использованием теста ANOVA показал, что выживаемость нейронов при цитотоксическом действии глутамата в присутствии АЛ в диапазоне концентраций от 0,1 до 1 мМ, начиная с концентрации 0,2 мМ, достоверно дозозависимо повышалась в среднем на 12% (рис. 4). При подсчете числа выживших КЗН на окрашенных препаратах (рис. 5) хорошо заметно, что присутствие в питательной среде АЛ препятствует их деструкции под воздействием глутамата.

Полученные нами данные свидетельствуют о выраженных адаптогенных свойствах нетоксичной стандартизированной субстанции органической соли лития — аскорбата лития в условиях стресса, моделируемого in vivo и in vitro, и о тесной связи между стрессом и нейродеструктивными процессами на клеточном уровне. В экспериментах in vivo препарат способствовал сохранению пула эозинофилов и снижению уровня адреналина и норадреналина в крови, улучшал показатели адаптации животных в тесте подвешивании и ТОП в модели транспортного стресса. При цитотоксическом действии глутамата in vitro аскорбат лития во всем исследованном диапазоне концентраций (0,1—1,0 мМ) оказывал защитный эффект. Таким образом, результаты наших исследований расширяют представления о нейропротективном потенциале малых доз препаратов лития, показанном ранее в экспериментах на культурах клеток стриатума [15], гиппокампа [16, 17], неокортекса [17—19], мозжечка [20], а также при черепно-мозговой травме [21].