Мексидол (этилметилгидроксипиридина сукцинат — ЭМГПС) обладает широким фармакологическим спектром и оказывает антиоксидантное [1], антигипоксантное [2], анксиолитическое [3], антистрессовое [4], противосудорожное, нейропротективное [5], ноотропное [6], антиамнестическое [7], противотревожное [8], кардиопротективное [9], противосклеротическое [10], антиагрегантное [11], противопаркинсоническое [12, 13], вегетотропное действие [14], повышает физическую работоспособность [15].

Клинические исследования показали высокий терапевтический эффект мексидола при лечении пациентов с различными неврологическими, психическими и сердечно-сосудистыми заболеваниями [16]. Препарат проявил эффективность при лечении невротических и неврозоподобных расстройств [17], осложнениях алкоголизма, в том числе абстинентного синдрома [18], при лечении острых и хронических нарушений мозгового кровообращения [5, 19], вегетативной дисфункции [20], при нарушениях функций головного мозга при старении [21]. Мексидол является препаратом с большим терапевтическим диапазоном и высоким профилем безопасности [22—24].

В проведенном ранее хемореактомном исследовании [25] молекулы ЭМГПС показано, что препарат оказывает комплексный нейропротективный эффект, обусловленный как прямым воздействием на нейроны (активация ацетилхолиновых и ГАМК-A-рецепторов, противовоспалительный и антиоксидантный эффекты), так и опосредованно (за счет нормализации свертывающей системы крови, антидиабетического и антиатерогенного действия). Было показано, что ЭМГПС является агонистом ацетилхолиновых рецепторов и ГАМК-рецепторов. Активация M3-мускариновых рецепторов приводит к стимуляции пути выживания нейронов (молекулярный каскад ERK½). Активация каскада ERK½ тормозит апоптоз нейронов, [26]. Активация никотиновых рецепторов ацетилхолина типа α4β2 нормализует процессы пре- и постсинаптического возбуждения холинергических синапсов, что также способствует нейропротекции [27]. Ингибирование М4-мускариновых рецепторов способствует активации ГАМК-ергической трансмиссии [28].

Таким образом, хемореактомное моделирование эффектов ЭМГПС позволило охарактеризовать его основные эффекты: активацию мускариновых и никотиновых рецепторов ацетилхолина, ГАМК-А-рецепторов, ингибирование ЦОГ-2 и 5-липоксигеназы, угнетение биосинтеза простагландина E2 и др. Препарат участвует в следующих процессах: регенерации тканей (активация деления клеток, рост клеток, торможение апоптоза); формировании структур нейронов (нейрон, аксон, оконечность аксона, синаптический мембранный везикул, дендрит, нейрит); клеточном дыхании, энергетическом метаболизме (ответ на гипоксию, метаболизм глюкозы и липидов, связывание гема, ответ на инсулин); синаптической передаче сигнала, регулировании цикла сон—бодрствование; антиоксидантном действии (ответ клеток на окислительный стресс, на гипероксию).

Имеющиеся данные позволяют предположить, что препарат способен не только предохранять нейроны как антиоксидант и антигипоксант, но может оказывать и более специфические действия на сигнальные каскады выживания нейронов в условиях стресса. Оценка действия препарата возможна методами нейроцитологии, изучающими влияние веществ непосредственно на нейроны [29—31]. Нейроцитологические исследования составляют важный компонент изучения механизмов действия нейропротекторов, поскольку позволяют оценивать вклад разных факторов в повреждение нейронов. При ишемии головного мозга повреждающими факторами являются: энергетический дефицит, глутаматная эксайтотоксичность, окислительный стресс, повышение уровня оксида азота, кальциевый дисбаланс, ацидоз [32].

В экспериментах in vivo можно моделировать как глобальную, так и фокальную ишемию [33]. Однако эксперименты in vivo вызывают реакцию всего организма на ишемию, гипоксию или гипогликемию со всеми вторичными реакциями повреждения или защиты и поэтому не дают возможности точно контролировать и быстро изменять окружающую среду клетки (например, ионный состав) или вносить разные ингибиторы рецепторов и стимуляторы физиологических процессов. Эти задачи вполне можно решить, используя культуры клеток и ткани различных структур головного мозга in vitro или нейроцитологические исследования. Важность нейроцитологического исследования как метода исследования нейропротективных свойств различных веществ состоит в том, что оно позволяет, во-первых, точно стандартизировать условия эксперимента и, во-вторых, оценивать непосредственное действие исследуемых препаратов на выживание нейронов, а не на все системы организма. Путем изменения состава среды культивирования можно моделировать как саму кислородо-глюкозную недостаточность, так и ее отдельные важнейшие повреждающие факторы (глутаматная токсичность, окислительный стресс, ацидоз и т. п.), изучая их непосредственное действие на выживание нейронов [34].

Цель исследования — изучение нейропротективных свойств мексидола на клеточной модели глутаматного стресса.

В работе использовались 7—8-суточные культуры зернистых нейронов, полученные методом ферментно-механической диссоциации мозжечка 7-дневных крыс по ранее описанной методике [29]. Культивирование производили в 96-луночных пластиковых планшетах в течение 7 дней в инкубаторе, заполненном газовой смесью (95% воздух + 5% СО₂), при температуре 35,5 °С и относительной влажности 98%. К этому сроку культивированные зернистые нейроны (КЗН) достигали морфологической и нейрохимической зрелости. Состояние культур контролировали ежедневно и на каждом этапе эксперимента путем визуального просмотра в инвертированном микроскопе при фазовом контрасте [31].

Было проведено две серии экспериментов: профилактическое применение мексидола и острый эксперимент. В обоих случаях мексидол разводили в деионизированной воде в концентрации 10 мМ и стерилизовали фильтрацией; конечные концентрации мексидола в среде культивирования составили 0,1—0,25—0,5—1 ммоль/л. При исследовании нейропротективных свойств профилактического применения мексидола препарат вносили в среду культивирования на 2-е сутки in vitro и оставляли до 7 сут [29], затем осуществляли обработку клеток глутаматом. При проведении острого эксперимента мексидол вводили в среду культивирования за 30 мин до внесения глутамата и оставляли до окончания эксперимента.

Глутамат (L-Glutamic acid monosodium salt 99—100%, «Sigma», США, №G1626) добавляли к культурам в 3 различных концентрациях (50, 100 и 150 мкМ) для подбора оптимальной концентрации глутамата при проведении последующих экспериментов. Выживаемость КЗН при токсическом действии глутамата должна составлять 30—70% от контроля, принимаемого за 100% [30], что достигается при концентрации глутамата, равной 100 мкМ. Все дальнейшие эксперименты проводились именно при этой концентрации глутамата.

Количественную оценку выживаемости клеток производили с помощью прямого подсчета нейронов с неизмененной морфологией в 5 полях зрения [30, 34]. Такой подсчет дает наиболее адекватную оценку выживаемости нейронов по всей площади 96-луночного планшета. И в профилактическом, и в остром эксперименте для каждой концентрации мексидола было выполнено 5 экспериментов, при этом для каждой точки брали не менее 3 культур. Количество нейронов с неизмененной морфологией в контрольных культурах принимали за 100% выживаемости. Для статистического анализа использовали тест ANOVA с поправкой Бонферрони. Результаты выражали как среднее и ощибка среднего (M±m), различия считали достоверными при p<0,05.

Выживаемость КЗН при воздействии глутамата (100 мкМ, 4 ч) составила 31,0±1,6%, а при введении глутамата в профилактическом эксперименте с 1 мМ мексидола в течение 5 сут — 42,0±1,8% (p<0,05) (рис. 1—3),

В условиях глутаматного стресса мексидол дозозависимо повышал выживаемость нейронов. Регрессионный анализ концентраций и значений выживаемости показал, что при увеличении концентрации мексидола в среде на 0,1 мМ, выживаемость клеток в среднем повышалась на 1,74% (R²=0,94) (см. рис. 3).

Проведенные эксперименты также показали достоверный нейропротективный эффект мексидола и в остром эксперименте при введении мексидола за 30 мин до воздействия глутамата. В остром эксперименте в течение 4 ч воздействия мексидола без добавления глутамата выживаемость нейронов не снижалась (рис. 4, а),

Регрессионный анализ дозозависимых эффектов мексидола на выживаемость нейронов в остром эксперименте показал, что без добавления глутамата мексидол не оказывал токсического влияния на выживание нейронов в течение 4 ч во всем исследованном диапазоне концентраций (рис. 5).

В условиях более выраженной глутаматной токсичности в остром эксперименте (т.е. в условиях, когда выживало всего 20% нейронов в контрольной группе) мексидол (1мМ) по сравнению с контролем (деионизированная вода) показал свои нейропротективные свойства (выживаемость нейронов повышалась на 7,7% (рис. 7).

Ранее проведенные исследования мексидола показали возможность прямого нейропротективного действия на нейроны в условиях стресса (в частности, при воздействии высоких концентраций глутамата). Результаты настоящей работы подтвердили достоверное нейропротективное действие мексидола на модели глутаматного стресса на КЗН. Нейропротективный эффект наблюдался при применении мексидола на стадии выращивания культуры нейронов в течение 5 сут, выживаемость нейронов повышалась в среднем на 20%. При добавлении мексидола за 30 мин до создания модели глутаматного стресса отмечено повышение выживаемости нейронов на 8—10%. Результаты исследования подтвердили непосредственное нейропротективное действие мексидола в КЗН.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ 17−07−00935

*e-mail: unesco.gromova@gmail.com