За последнее десятилетие достигнут существенный прогресс в понимании молекулярных основ и патофизиологических процессов, происходящих в условиях экспериментальной ишемии спинного мозга (ИСМ) [1]. Однако, несмотря на успехи фундаментальной медицины, сосудистая миелопатия остается тяжелым заболеванием с неблагоприятным реабилитационным прогнозом [2].
Сравнительно небольшая распространенность заболевания, составляющая 1,2% от общего количества острых нарушений мозгового кровообращения и 5—8% от всех острых миелопатий, обусловливает гиподиагностику ишемической миелопатии и не позволяет провести крупные эпидемиологические и клинические исследования. Негативным следствием этого является отсутствие отечественных и зарубежных четких критериев и руководств по диагностике и лечению ИСМ [3].
Если магнитно-резонансная томография (МРТ) в различных модальностях (Т1, Т2, Т2 STIR, FLAIR, МР-спинальная ангиография) клинически признана золотым стандартом диагностики сосудистой миелопатии, то вопросы так называемого адекватного лечения остаются противоречивыми, а сама терапия остается в основном симптоматической [4].
Поэтому изучение новых терапевтических методик лечения ИСМ в экспериментальных условиях является актуальным направлением спинальной ангионеврологии [5, 6].
ИСМ, подобно церебральной ишемии и травме мозга, сопровождается как острыми (выброс провоспалительных цитокинов, оксидативный стресс, глутаматергическая эксайтотоксичность), так и вторично-опосредованными нейропатохимическими реакциями (кавитация, демиелинизация, апоптоз) [7]. В связи с этим является актуальным применение лекарственных препаратов, обеспечивающих непосредственную защиту нейронов спинного мозга от первичного и вторичного повреждения.
Поэтому особый интерес представляет исследование широко распространенного в неврологической практике лекарственного препарата кортексин, который показал свою эффективность при различных заболеваниях нервной системы [8]. Пептиды препарата содержат комплекс физиологически значимых водорастворимых полипептидов, амино- и рибонуклеиновых кислот, которые регулируют рост и дифференцировку нейронов, их функциональную стабильность и пластичность синаптических процессов. Являясь нейротрофическими и ростовыми факторами, эти соединения способны селективно связываться с нейротрофическими p75NTR- и Trk-рецепторами, реализуя элементы нейротрофической активности. Благодаря определенному набору активных L-аминокислот (глутаминовая и аспарагиновая, орнитин), обладающих высокой энергетической активностью, субстанции кортексина воздействует на разные мембранные и клеточные мишени в нейронах, корригируя определенные звенья патологического процесса в мозге. Таким образом, кортексин препятствует оксидативной деструкции клеток, корригирует синаптическую дезинтеграцию, защищает нейроны от разрушения, ограничивает воспалительный очаг за счет нивелирования провоспалительных цитокинов, нормализует поведенческие и когнитивные стереотипы [8]. Также показано, что препарат участвует в сохранении митохондриального потенциала, регуляции функции глутаматных рецепторов и концентрации внутриклеточного Са2+ [9].
Учитывая направленность предшествовавших доклинических и клинических исследований кортексина на церебральную патологию, актуально изучение эффективности препарата в условиях экспериментальной ИСМ. Поэтому целью настоящего исследования стало изучение влияния лекарственного препарата кортексин на функциональное восстановление и морфологическую картину спинного мозга белых крыс с моделированной ИСМ.
Материал и методы
Исследование выполнено на 16 самцах крыс стока Wistar массой 300 г. Эксперимент проводился в соответствии с «Руководством по уходу и использованию лабораторных животных» (публикация Национального института здоровья № 85−23, США) и «Руководством по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ» [10]. Оперативные вмешательства проводились под общей анестезией хлоралгидратом (300 мг/кг), вводившимся внутрибрюшинно. Модель ИСМ осуществляли по описанной методике окклюзии кровотока в нижнем артериальном бассейне спинного мозга [11]: у анестезированных животных выполняли лапаротомию, выделяли и перевязывали инфраренальный отдел брюшной аорты (рис. 1). Операционную рану ушивали. Животных помещали в отдельные клетки.
Все экспериментальные животные были разделены на две группы: контрольную (n=8) и опытную (n=8). Крысам опытной группы вводили внутрибрюшинно кортексин в дозе 0,15 мг/кг за 30 мин до окклюзии инфраренального отдела аорты, исходя из суточной дозировки препарата для взрослых 10 мг 2 раза в день.
Двигательную функцию задних конечностей животных оценивали через 48 ч по шкале Тарлова. После оценки неврологического дефицита повторно наркотизировали животное, проводили перфузионную фиксацию тканей 4% раствором параформальдегида на фосфатном буфере. Затем послойно препарировали мягкие ткани спины и выделяли пояснично-крестцовый отдел позвоночника на уровне L2—S4. После ламинэктомии и пересечения спинномозговых корешков спинной мозг извлекали из позвоночного канала. Препарат подвергался стандартной гистологической обработке, после чего срезы толщиной 5 мкм окрашивали тионином по методу Ниссля. Подсчет нейронов, попавших в срез, проводили методом прямой микроскопии (Leica DM750) при увеличении 100 и 400. Отмечали количество нормохромных, гиперхромных, гипохромных, сморщенных нейронов и клеток-теней в основных клеточных группах передних рогов спинного мозга: передних и задних медиальных, передних и задних латеральных, а также в вентральных с обеих сторон [11].
Статистическая обработка результатов исследования проводилась путем сравнения двух независимых выборок с использованием непараметрического теста Манна—Уитни. Различия считались значимыми при р<0,01. Результаты представлены в виде диаграмм размахов.
Результаты
Перед проведением эксперимента у крыс в обеих экспериментальных группах не выявлялось признаков неврологического дефицита. При перевязке инфраренального отдела аорты у крыс контрольной группы через 2 сут отчетливо наблюдалась неврологическая симптоматика, соответствующая низкому количеству баллов по шкале Тарлова (от 2) и проявляющаяся глубоким или умеренным задним парапарезом, анестезией задних конечностей и хвоста и нарушением функции тазовых органов в виде недержания мочи и кала. У крыс опытной группы, которым препарат кортексин вводился внутрибрюшинно в дозе 0,15 мг/кг, неврологический дефицит был выражен значимо меньше (p=0,0095). В этой группе оценка двигательной активности по шкале Тарлова варьировала от 4 до 5 баллов, у большинства животных признаков неврологического дефицита не наблюдалось.
При гистологическом изучении срезов пояснично-крестцовых сегментов спинного мозга крыс контрольной группы выявлялись выраженные ишемические изменения в нейронах всех клеточных групп передних рогов. Патологические изменения характеризовались перицеллюлярным отеком серого вещества, развитием в нейронах тотальной гиперхромии (в некоторых случаях — хроматолиза), появлением начальных некротических изменений в виде разрыва мембранных компонентов клеток (лизис), уменьшением размера клеток, их сморщиванием и появлением клеток-теней. Вблизи лизирующихся нейронов наблюдались реактивные скопления глиоцитов (рис. 2).
У крыс опытной группы, предварительно получивших кортексин, в пояснично-крестцовых сегментах отмечались легкие ишемические изменения в виде появления (в основном) гиперхромных нейронов на фоне преобладания нормохромных, без выраженных явлений отека и лизиса клеток. Визуальное морфологическое сравнение срезов спинного мозга контрольной и опытной групп представлено на рис. 3.
Сравнение цитоархитектоники срезов пояснично-крестцовых сегментов крыс обеих экспериментальных групп с использованием критерия Манна—Уитни показало, что в контрольной группе наблюдалось значимо большее количество гиперхромных сморщенных нейронов (р=0,0001) и клеток-теней (р=0,0003). В опытной группе животных, получивших кортексин, наблюдались преимущественно нормохромные нейроны (р=0,01) (рис. 4).
Обсуждение
Ишемические изменения в спинном мозге могут быть вызваны широким спектром патологических состояний, основными из которых являются: сосудистые факторы риска (атеросклероз, артериальная гипертензия, сахарный диабет), компрессионные факторы (дискогенная миелопатия), диссекция позвоночных артерий, сосудистые мальформации (в первую очередь спинальная дуральная артериовенозная фистула), фиброзно-хрящевая эмболия [5, 12]. Особое место среди причин сосудистой миелопатии занимает патология аорты и хирургические вмешательства на ней. По данным зарубежных исследователей [13], частота развития нижнего парапареза или плегии при операциях на аорте и ее крупных ветвях достигает 60%. Поэтому окклюзия аорты была взята за основу в экспериментальной модели ИСМ в настоящем исследовании.
За последние годы в условиях экспериментальной миелоишемии был доказан положительный эффект агонистов аденозиновых А2а-рецепторов, ингибиторов NMDA-рецепторов, эритропоэтина и его производных [14], факторов роста нервной ткани [15] и стволовых мезенхимальных клеток [14—16]. Миелопротективный эффект наблюдался в условиях умеренной гипотермии [16, 17] и гипербарической оксигенации [18].
Предложенные методы лечения, безусловно, имеют патогенетическую составляющую и способны оказывать нейропротективный эффект, однако использование большинства из них по-прежнему возможно исключительно в экспериментальных условиях и недоступно для клинической неврологии. Таким образом, актуальным в лечении сосудистой миелопатии и ее последствий представляется использование доступных средств, обладающих широким спектром патогенетических воздействий, каким является лекарственный препарат кортексин.
В настоящем экспериментальном исследовании с моделированием ИСМ у крыс путем окклюзии инфраренального отдела аорты миелопротективный эффект кортексина подтвержден как с функциональной, так и с морфологической точек зрения. В опытной группе животных, которым предварительно внутрибрюшинно вводился кортексин, отмечалась полная функциональная активность либо минимальная неврологическая симптоматика, соответствующая 4—4,5 балла по шкале Тарлова. При проведении гистологического исследования у крыс этой же группы в пуле клеток пояснично-крестцовых срезов спинного мозга преобладали нормохромные и гиперхромные нейроны, свидетельствующие о минимальных ишемических изменениях на фоне перевязки брюшной аорты. Полученные результаты статистически значимо отличались от показателей контрольной группы животных, в которой преобладали ишемически-опосредованные двигательные нарушения в виде глубоких задних парезов и изменения цитоархитектоники (появление гиперхромных сморщенных, гипохромных нейронов и клеток-теней).
Полученные в исследовании данные позволяют предполагать потенциальный миелопротективный эффект кортексина, связанный с его нейротрофическими свойствами, и рассматривать этот лекарственный препарат в контексте лечения сосудистой миелопатии.
Авторы выражают благодарность к.б.н., доценту Галине Юрьевне Юкиной, д.вет.н., доценту Марии Николаевне Мальцевой за помощь в проведении исследования.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.