Неотложная фармакотерапия ишемического инсульта (ИИ) направлена на восстановление кровотока, чтобы ограничить повреждение головного мозга и снизить осложнения после инсульта, и действие нейропротекторных препаратов направлено на поддержку таких эффектов. Нейротрофические препараты на основе гидролизатов головного мозга (ГГМ) используются для терапии ИИ, хронической ишемии мозга, нейродегенеративных заболеваний и черепно-мозговых травм [1]. Терапия ГГМ является одним из важных направлений так называемой тканевой терапии, предложенной проф. В.П. Филатовым в 1930-х годах [2]. Впоследствии технологии приготовления фармакологических препаратов на основе ГГМ коров, свиней и др. были значительно усовершенствованы.

Однако препараты ГГМ, имеющиеся в настоящее время в арсенале врача-невролога, производятся по принципиально разным технологиям. Несмотря на то что при приготовлении любого из препаратов ГГМ природное сырье подвергается гидролизу, условия выращивания животных, хранения исходного сырья, проведения гидролиза, фильтрации, очистки, стандартизации по рН и составу уникальны для каждого препарата.

Как же сравнивать препараты ГГМ? Технологии приготовления каждого из препаратов являются коммерческими тайнами фирм-производителей и, следовательно, не могут быть сравнены друг с другом. Поэтому важнейшими объективными характеристиками препаратов ГГМ являются их состав и фармакологическое действие.

Исследования состава препаратов ГГМ

Состав препаратов ГГМ весьма сложный, так как ГГМ включают не только пептиды [3—6], но и жировую [3], аминокислотную [7], витаминную [8] и микроэлементную [9, 10] фракции. В результате данные по фармакокинетике препаратов ГГМ не могут быть получены в принципе (дословно инструкция по применению: «…сложный состав Церебролизина, активная фракция которого состоит из сбалансированной и стабильной смеси биологически активных олигопептидов, обладающих суммарным полифункциональным действием, не позволяет провести обычный фармакокинетический анализ отдельных компонентов» [11]). Заметим, что анализ пептидного состава был проведен только для Л.П. Церебролизин.

Сравнительные исследования элементного состава препаратов ГГМ являются важным инструментом оценки фармацевтического качества ГГМ. Исследование элементного состава Л.П. Церебролизат и Церебролизин указало на значительные отличия: в составе Л.П. Церебролизат были найдены достоверно более высокие уровни натрия (4800±376 мкг/мл, Церебролизин — 2043±144 мкг/мл), калия (2600±82 мкг/мл, Церебролизин — 152±27 мкг/мл) и фосфора (860±54 мкг/мл, Церебролизин — 92,69±39,00 мкг/мл) [9]. Эти различия, по всей вероятности, зависят не только от состава сырья, используемого для изготовления препарата, но и от технологии производства лекарства [9]. Например, более высокое содержание натрия может указывать на использование поваренной соли для консервации исходного сырья или же на использование щелочи (NaOH) для стандартизации рН препарата. Наличие фосфора является косвенным указанием на наличие в составе Л.П. Церебролизат значительного количества фосфолипидов и др. Для более точных выводов необходимо сравнительное исследование содержания всех элементов таблицы Д.И. Менделеева в составе препаратов.

Сравнительное исследование элементного состава Л.П. Церебролизин и Церегин было проведено посредством сравнения профилей более 80 химических элементов, измеренных методом масс-спектрометрии. Анализ показал наличие в Л.П. Церегин значительных количеств натрия и хлора, что соответствует высокой концентрации NaCl в данном препарате. В Л.П. Церебролизин уровни хлорид-ионов были в 50 раз меньше, а ионов натрия — в 10 000 раз меньше, чем в другом препарате. В Л.П. Церегин обнаружено присутствие следовых количеств более 30 токсических и условно-токсических микроэлементов, а в Л.П. Церебролизин найдены следовые количества всего лишь 3 из 30 условно-токсических элементов. Наличие брома в совокупности со значительными количествами натрия и хлора в Л.П. Церегин позволяет предположить, что в него добавляется поваренная соль, не очищенная от бромидов. Наличие в составе Л.П. Церегин следовых количеств тория и урана указывает, предположительно, на особенности экологии пастбищ, источников питьевой воды и др. [10].

Подчеркнем, что именно сравнительных исследований фармакологических свойств препаратов ГГМ крайне мало. В подавляющем большинстве экспериментальных и клинических исследований изучали эффекты только одного препарата, и лишь в единичных исследованиях сравнивали эффекты хотя бы двух препаратов ГГМ. Более того, в этих единичных исследованиях изучали иммунопротекторные, психостимулирующие, но не нейропротекторные эффекты препаратов ГГМ.

Например, сравнивали цитопротекторные свойства Л.П. Церебролизин и Кортексин по отношению к Т- и В-лимфоцитам in vitro. Церебролизин стимулировал деление В-клеток иммунной памяти, а Л.П. Кортексин оказывал цитотоксическое и антипролиферативное действие на Т-лимфоциты [12]. Сравнительное исследование Л.П. Кортексин и Церебролизин на крысах Вистар после введения в желудочки головного мозга показало умеренное психостимулирующее действие обоих препаратов [13]. Экспериментальное исследование пептидных препаратов у крыс в тесте «открытое поле» показало, что нейромодулирующий эффект уменьшался в ряду Церебролизин > Тималин > Тимоген > Т-Активин > Кортексин [14].

Наиболее полным сравнительным исследованием нейропротекторных эффектов препаратов ГГМ является работа L. Zhang и соавт. [15], в которой исследовались эффекты четырех препаратов (Когнистар, Церебролизат, Кортексин, Церебролизин) на модели ИИ у крыс. Результаты этого проспективного двойного слепого, сравнительного фармакологического исследования показали, что значительное улучшение неврологического исхода по сравнению с физиологическим раствором отмечено только при использовании Л.П. Церебролизин.

В исследовании [15] воспроизводили модель окклюзии правой средней мозговой артерии (ОСМА) у крыс. Была проведена рандомизация групп животных с последующим применением Л.П. Когнистар (2,5 мл/кг), Церебролизат (2,5 мл/кг), Кортексин (1,7 мг/кг) и Церебролизин (2,5 мл/кг) или физиологического раствора (1 мл) в качестве плацебо. Дозы пересчитывали в соответствии с листком-вкладышем инструкции по применению соответствующего препарата. Препараты вводили внутрибрюшинно 1 раз в сутки 10 дней подряд. Первое введение препаратов проводили через 4 ч после воспроизведения ОСМА.

В течение 4 нед после воспроизведения ОСМА у животных 1 раз в неделю оценивали неврологическое состояние посредством модифицированной шкалы оценки тяжести неврологических симптомов (mNSS), теста на отрыв липкой ленты и теста на нарушение постановки передних лапок при движении (так называемый foot fault test). По шкале mNSS оценивали двигательную функцию, чувствительность и рефлекс балансировки по 18-балльной шкале (0 — норма; 18 — максимальный неврологический дефицит). В ходе теста на отрыв липкой ленты оценивали соматосенсорные нарушения посредством измерения среднего времени, затраченного каждой крысой на устранение раздражителей от контралатеральной (т.е. левой) передней конечности. В ходе теста на нарушение постановки передних лапок при движении оценивали общее количество шагов, которое делает крыса по решетчатой поверхности, и количество падений или соскальзываний с решетки для левой передней лапки, которое представляли в процентах от общего количества шагов.

Объем инфаркта измеряли через 4 нед после окклюзии на основании исследования семи коронарных срезов, окрашенных гематоксилином и эозином. Данные представлялись в процентах ипсилатерального непрямого поражения от объема контралатерального (т.е. неповрежденного) полушария.

Результаты исследования показали, что при применении физиологического раствора, Л.П. Когнистар, Церебролизат и Кортексин не отмечено достоверных отличий в степени неврологического дефицита. Напротив, при использовании Л.П. Церебролизин наблюдали значительное улучшение неврологического исхода по сравнению с физиологическим раствором (p<0,002) (рис. 1).

Относительный объем инфаркта на 28-й день после воспроизведения ОСМА составил 26,5±2,3% при применении Л.П. Церебролизин, 28,5±2,4% при применении Л.П. Церебролизат, 30,8±2,1% при применении плацебо, 33,5±1,9% при применении Л.П. Кортексин и 34,7±2,0% при применении Л.П. Когнистар. Хотя не было найдено достоверных отличий по сравнению с плацебо, у крыс, получавших Л.П. Церебролизин, объемы поражения были достоверно меньше, чем у крыс, получавших Л.П. Когнистар (на 30%, p=0,004 по F-тесту) или Л.П. Кортексин (на 26%, р=0,018) (рис. 2).

Таким образом, среди исследованных в работе L. Zhang и соавт. [15] препаратов ГГМ только Л.П. Церебролизин достоверно улучшал неврологическое состояние по сравнению с плацебо. Это согласуется с результатами клинических исследований, в которых оценивали влияние Л.П. Церебролизин на функциональное восстановление после ИИ [16, 17]. В этих исследованиях терапию Л.П. Церебролизин осуществляли в дозе 30 мл/сут в течение 21 сут подряд [16].

Церебролизин представляет собой нейропептидный препарат, который имитирует действие эндогенных нейротрофических факторов. В доклинических исследованиях было показано положительное влияние Л.П. Церебролизин на нейропластичность, синаптическое ремоделирование, рост нейритов, нейротрофический [18], нейропротекторный [15, 19], ноотропный [20, 21], противоболевой и противовоспалительный [22], антиконвульсантный [19] и противоопухолевый [23] эффекты препарата.

Более выраженное нейропротекторное и нейротрофическое действие Л.П. Церебролизин обусловлено, по всей видимости, более высоким качеством фармацевтической стандартизации, более высокой антиоксидантной активностью и, самое главное, наличием активных фрагментов нейропептидов (фактора роста нервов, энкефалинов, орексина, галанина) в составе Л.П. Церебролизин [14]. На более высокое качество фармацевтической стандартизации Л.П. Церебролизин указывают особенности его элементного состава. При сравнительном исследовании Л.П. Церебролизин, Церебролизат, Актовегин на активность супероксиддисмутазы наибольшую активность проявлял Л.П. Церебролизин — 556,8±42,0 Ед/мл (ЛП Церебролизат — 20,9±3 Ед/мл, Л.П. Актовегин — 72,8±7,1 Ед/мл). Примечательно, что именно в составе Л.П. Церебролизин были найдены значительные количества микроэлементов, являющихся кофакторами разных типов супероксиддисмутаз, — меди, цинка и марганца [9].

Среди исследованных препаратов в работе L. Zhang и соавт. [15] Л.П. Церебролизин является единственным ГГМ, для которого были проведены систематические исследования пептидного состава. Полученный масс-спектр Л.П. Церебролизин указал на наличие в его составе десятков тысяч пептидов в диапазоне молекулярных масс 200—6000 Да с максимальным количеством пептидов в так называемой легкой пептидной фракции (молекулярные массы до 1500 Да) [3]. Анализы пептидного состава препарата, проведенные ранее с использованием стандартных процедур секвенирования белков, указали на наличие в составе Л.П. Церебролизин пептидных фрагментов энкефалинов [3], фактора роста нервов, орексина, галанина и др. [4, 5].

Был проведен комплексный анализ пептидного состава Л.П. Церебролизин методом гибридной масс-спектрометрии (МС) с орбитальными ловушками ионов с последующим использованием современных алгоритмов de novo МС-секвенирования [6]. В ходе этого исследования был изучен состав образцов пептидной фракции Л.П. Церебролизин трех различных серий (серия B4RF1A, дата выпуска 06.2018; серия PB2298, дата выпуска 06.2014; серия A4AB1A, дата выпуска 02.2015), приобретенных в государственных аптеках ГБУЗ «ЦЛО ДЗМ».

В результате были установлены аминокислотные последовательности 14 635 пептидов, соответствующих 1643 нейрональным белкам протеома свиньи. Анализ аннотации протеома человека показал, что выявленные пептиды Л.П. Церебролизин могут являться пептидами-миметиками соответствующих пептидов человека. Идентифицированным 14 635 пептидам соответствовало 13 997 аннотаций пептидов, которые являются пептидами-миметиками протеома человека. Эти пептиды-миметики могут ингибировать 275 киназ человека, в том числе CDK1, CDK2, TGFBR2, ABL1, GSK3-beta, MTOR. Ингибирование киназ GSK3-beta и MTOR соответствует нейротрофическому и нейропротекторному действию Л.П. Церебролизин, а ингибирование киназ CDK1, CDK2, TGFBR2, ABL1 — противоопухолевому действию препарата. Дополнительно 5657 найденных аннотаций соответствовали 405 пептидным фрагментам 300 биологически активных пептидов (в том числе нейротрофических нейропептидов). Еще 1967 аннотаций соответствовали пептидам-миметикам, потенциально ингибирующим проапоптотические ферменты-каспазы CASP1, CASP3 и CASP6. Ингибирование Л.П. Церебролизин каспазы-3 (CASP3) было продемонстрировано в многочисленных экспериментальных исследованиях [24—26].

Результаты исследования [6] подтвердили наличие в составе Л.П. Церебролизин пептидных фрагментов энкефалинов (YGGFL, GGFLR, YGGFM), фактора роста нервов (GEFSV, NSYCTTT), орексина (CCRQK), галанина (WWLNSAGY). Механизмы действия этих нейротрофических факторов были подробно рассмотрены в других работах [3—6]. Фактор роста нервов (ФРН) активирует рецепторы TrkA, LNGFR и необходим для восстановления сетей нейронов с повреждениями, возникающими вследствие ИИ или черепно-мозговой травмы. Пептиды Л.П. Церебролизин GEFSV и NSYCTTT могут взаимодействовать с рецептором TrkA, участвующим в осуществлении нейротрофических эффектов ФРН [5]. Энкефалины YGGFL и YGGFM— эндогенные опиоидные пептидные нейротрансмиттеры, поддерживающие регенерацию нейронов. Орексин увеличивает уровни экспрессии нейротрофина-3, поддерживает выживание и дифференциацию нейронов. Галанин модулирует секрецию ацетилхолина, серотонина и норадреналина и необходим для «спраутинга» (т.е. «прорастания») аксонов [4].

Помимо подтверждения результатов предыдущих исследований пептидного состава Л.П. Церебролизин, в работе [6] установлено наличие в его составе синэнкефалина, нейроэндокринного регуляторного пептида-1, галаниноподобного пептида, нейропептида глицин-глутаминовая кислота, нейропептида К, нейромедина В32 и нейромедина S. Синэнкефалин является синергистом энкефалинов, пептид PACAP — вазоактивный нейротрансмиттер и нейромодулятор. Нейроэндокринный регуляторный пептид-1 подавляет NaCl-индуцированную или ангиотезин-2-индуцированную секрецию вазопрессина в гипоталамусе и гипофизе [27]. Галаниноподобный пептид поддерживает эффекты галанина, а нейропептид-глицин-глутаминовая кислота — энергетический метаболизм нейронов. Нейропептид К проявляет гипотензивное и ноотропное действие, также регулируя энергетический метаболизм ЦНС [28]. Нейропептид нейромедин-В32 регулирует рост нейронов, уровни глюкозы, артериальное давление и посредством фактора CREB проявляет ноотропные эффекты [29]. Нейромедин-S поддерживает циркадианный ритм, регулирует синтез других пептидных гормонов и проявляет нейротрофическое действие [30].

Препараты на основе ГГМ активно изучаются в экспериментальных и клинических исследованиях. Дизайн подавляющего большинства этих исследований включает сравнение действия какого-то одного препарата ГГМ с плацебо. Единственным сравнительным исследованием нейропротекторных эффектов препаратов ГГМ является работа L. Zhang и соавт. [15], в которой представлены результаты воздействия Л.П. Когнистар, Церебролизат, Кортексин, Церебролизин на неврологический дефицит при воспроизведении модели ОСМА у крыс. Это исследование показало, что при использовании Л.П. Церебролизин достоверно улучшается неврологический исход по трем неврологическим тестам.

В некоторых исследованиях отмечена эффективность и безопасность использования Л.П. Церебролизин при остром ИИ [31], после черепно-мозговых травм и субарахноидальных кровоизлияний [32], при когнитивных нарушениях [33] и расстройствах аутистического спектра [34]. Предполагаются противовоспалительный и антиоксидантный эффекты препарата [35]. В некоторых метаанализах клинических исследований отмечена эффективность Л.П. Церебролизин в терапии острого ИИ [36], болезни Альцгеймера умеренной тяжести [37] и черепно-мозговой травмы [38]. Сравнительных рандомизированных клинических исследований нейротрофических препаратов на основе ГГМ не проводили.

Эффективность Л.П. Церебролизин, показанная в экспериментальных и клинических исследованиях, обусловлена особенностями состава этого препарата. В частности, более выраженное нейропротекторное действие Л.П. Церебролизин соответствует более высокому качеству фармацевтической стандартизации препарата, более высокой антиоксидантной активности и наличию активных фрагментов нейропептидов (фактор роста нервов, энкефалины, орексин, галанин, синэнкефалин, нейроэндокринный регуляторный пептид-1, галаниноподобный пептид, нейропептид глицин-глутаминовая кислота, нейропептид К, нейромедин В32 и нейромедин S).

Работа выполнена по грантам РФФИ 19−07−00356 18−07−01022 18−07−00944 и гос. заданию Минобрнауки Р.Ф. (4.1929.2018/4.6).

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.

Сведения об авторах

Громова О.А. — https://orcid.org/0000-0002-7663-710X; e-mail: unesco.gromova@gmail.com

Торшин И.Ю. — https://orcid.org/0000-0002-2659-7998; e-mail: tiy135@ccas.ru

Стаховская Л.В. — https://orcid.org/0000-0001-6325-9237; e-mail: rsmu@rsmu.ru

Майорова Л.А. — https://orcid.org/0000-0003-3172-5621; e-mail: maiorova.larissa@gmail.com

Остренко К.С. — https://orcid.org/0000-0003-2235-1701; e-mail: ostrenkoks@gmail.com

Как цитировать:

Громова О.А., Торшин И.Ю., Стаховская Л.В., Майорова Л.А., Остренко К.С. О сравнительных экспериментальных исследованиях нейротрофических препаратов на основе гидролизатов головного мозга. Журнал неврологии и психиатрии им. С.С. Корсакова. 2019;119(10):134-140. https://doi.org/10.17116/jnevro2019119101134

Автор, ответственный за переписку: Громова Ольга Алексеевна — e-mail: unesco.gromova@gmail.com