Агонист дофаминовых рецепторов второго подтипа (D2R) каберголин в настоящее время используется в неврологии и нейроэндокринологии, главным образом в терапии болезни Паркинсона (БП) [1], синдрома беспокойных ног [2], болезни Кушинга [3], гиперпролактинемии различного генеза [4]. Каберголин относится к группе производных эрготамина — эрголиновых агонистов D2R, в которую также входят бромокриптин, лизурид, перголид [5]. Уникальное свойство каберголина, отличающее его от других представителей этой группы, — длительный период полувыведения (63—109 ч) [1], и, соответственно, более продолжительный терапевтический эффект после однократного введения. Экспериментальные исследования показали, что каберголин при системном введении снижает потребление алкоголя у хронически алкоголизированных животных [6, 7].
Интересной находкой было экспериментальное обнаружение антидепрессивных и анксиолитических свойств каберголина в классических тестах на тревожность у грызунов («принудительное плавание», «открытое поле», «приподнятый лабиринт», модели нарушения пищевого поведения) [8]. Ранее не известные свойства каберголина, а также высокая коморбидность болезней зависимости и тревожных и депрессивных расстройств [9, 10] позволяют предполагать наличие общей мишени каберголина для реализации его эффектов. Нормализация поведения животных в моделях экспериментальной депрессии при введении каберголина сопровождалась усилением экспрессии мозгового нейротрофического фактора (brain derived neurotrophic factor, BDNF) в гиппокампе [8]. Известно, что клинически используемые ингибиторы обратного захвата серотонина, или трициклические антидепрессанты, оказывают модулирующее действие на экстраклеточный уровень моноаминов [11], однако в основе стойкого терапевтического эффекта, как полагают, лежит их способность усиливать экспрессию BDNF — необходимое ключевое звено в механизмах нейрональной пластичности [12, 13]. Эти представления были подтверждены экспериментальными исследованиями, установившими увеличение уровня мРНК BDNF и его рецептора TrkB в гиппокампе и коре мозга животных при введении антидепрессантов, а также антидепрессивном эффекте внутригиппокампальной инъекции BDNF [14]. Было показано, что антидепрессанты неэффективны у нок-аутных мышей с избирательной блокадой экспрессии BDNF в переднем мозге или зубчатой извилине гиппокампа [15]. При этом модулирующий эффект антидепрессантов на экстраклеточный уровень моноаминов играет, по-видимому, важную, пусковую роль в BDNF-зависимых механизмах активации внутриклеточных сигнальных путей, так как нарушение норадреналиновой нейротрансмиссии у мышей приводит к потере способности антидепрессантов активировать TrkB [16].
Если для гиппокампа и префронтальной коры роль BDNF как возможного медиатора антидепрессивных и анксиолитических свойств препаратов экспериментально подтверждена, то для других областей мозга получены противоречивые результаты [17]. Наименее исследованы в этом плане структуры среднего мозга, в которых локализованы тела дофаминовых нейронов — вентральная покрышка (ventral tegmental area, VTA) и черная субстанция (substantia nigra, SN) [18, 19]. Эти области мозга характеризуются высокой плотностью D2-ауторецепторов как на телах, так и на пресинаптических окончаниях дофаминовых нейронов [20], представляющих основную мишень каберголина. Считают, что BDNF-зависимые механизмы в этой области мозга обеспечивают процессы долговременной нейрональной и поведенческой пластичности, лежащие в основе адаптивного поведения в условиях стресса [21]. Так, было показано, что подавление социального поведения в результате длительного опыта поражений в социальных контактах у мышей не наблюдается при нок-дауне гена BDNF в этой области мозга [19]. Высокий уровень экспрессии BDNF в среднем мозге и его рецептора TrkB в областях-мишенях — стриатуме, префронтальной коре и миндалине, а также данные о нарушении функций BDNF алкоголем позволяют предполагать важную модулирующую роль BDNF в механизмах формирования феномена зависимости [22].
В настоящем исследовании была проверена гипотеза о возможном влиянии каберголина на содержание катехоламинов и экспрессию мРНК BDNF в среднем мозге и гипоталамусе — областях локализации тел дофамин-синтезирующих нейронов мезокортиколимбической и тубероинфундибулярной систем мозга, играющих ключевую роль в регуляции адаптивного поведения в норме и патологии, в том числе при формировании зависимости от психоактивных веществ.
Материал и методы
Эксперимент проводился на 20 половозрелых крысах-самцах линии Wistar (питомник лабораторных животных Филиал «Столбовая» ФГБУ «Научный центр биомедицинских технологий» Федерального медико-биологического агентства) в соответствии с требованиями этического комитета ФГБУ «ФМИЦ ПН им. В.П. Сербского». Животных содержали по 8 крыс в клетке (тип: Т/4В Код: 555/4), в условиях естественной освещенности при температуре 22±2 °C и свободном доступе к пище и воде. В качестве пищевого рациона использовали гранулированный корм, произведенный в соответствии с нормативными документами (ГОСТ Р 50258-92).
Животным опытной группы (n=10) вводили каберголин (Tocris bioscience), который растворяли в смеси дистиллированной воды и этанола (3,3%) в соответствии с рекомендациями производителя, внутрибрюшинно в дозе 0,5 мг/кг. Контрольным животным (n=10) вводили эквивалентный объем растворителя.
Животных декапитировали через 24 ч после введения. У крыс на холоде выделяли исследуемые структуры — средний мозг и гипоталамус. Ткань мозга хранили при –70 °C. Содержание дофамина и норадреналина определяли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с электрохимической детекцией [23]. После гомогенизации в 0,1 М HClO4 образцы центрифугировали в течение 20 мин при 4 °C и 10000 g (Eppendorf 580R), полученный супернатант фильтровали центрифугированием (10 мин при комнатной температуре, 3000 g). Фильтрат наносили на аналитическую колонку методом прямой инъекции. Для фракционирования норадреналина и дофамина использовали хроматографическую колонку Spherisorb ODS-2 («Waters», США). Элюцию анализируемых растворов осуществляли в натрий-фосфатной буферной системе при pH=5,2 и U=0,65 v, со скоростью 1,6 мл/мин с помощью насоса высокого давления Gilson 302 («Gilson Inc.», США). Количественное определение содержания норадреналина и дофамина проводили с помощью электрохимического детектора (BAS LC-4b CC-4, США), рассчитывали относительно стандартов и выражали в нг на 1 г ткани.
Относительный уровень мРНК анализировали методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени после обратной транскрипции (ОТ-ПЦР). Тотальную РНК выделяли из структур мозга животных с помощью набора «RNeasy Lipid Tissue MiniKit» (QIAGEN). 1 мкг тотальной РНК использовали в реакции обратной транскрипции для синтеза кДНК с помощью набора «RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit» (Fermentas). Полученную кДНК использовали для количественной ПЦР в режиме реального времени на амплификаторе Multicolor Real-Time PCR Detection System iQTW5 («BioRad, Германия»). В качестве референсного был выбран ген β-актина. При проведении ПЦР использовали опубликованные последовательности олигонуклеотидных праймеров (ДНК-синтез, Россия) (табл. 1).
Таблица 1. Последовательности олигонуклеотидных праймеров, использованных для проведения количественной ОТ-ПЦР
| Ген | Праймер | |
| прямой | обратный | |
| BDNF | 5’-agctgagcgtgtgtgacagt-3’ | 5’-acccatgggattacacttgg-3’ |
| β-Актин | 5’-cactgccgcatcctcttcct-3’ | 5’-aaccgctcattgccgatagtg-3’ |
Амплификацию проводили в 25 мкл смеси (25 нг кДНК, праймеры 0,4 мкМ и 5 мкл 5х реакционной смеси qPCRmix-HS SYBR («Евроген», Россия). Условия проведения ПЦР: 95 °C — 3 мин; 50 циклов: 95 °C, 15 с, 60 °C, 15 с, 72 °C, 30 с с последующим анализом кривых плавления полученных продуктов амплификации. Измерения проводили не менее чем в 3 параллельных образцах. Для наблюдения за ходом реакции и регистрации данных использовали компьютерную программу Opticon Monitor 3.1. Расчет относительной экспрессии проводили на основании сравнительной оценки величин Ct (threshold cycle), получаемых после проведения ПЦР. Для сравнения уровней экспрессии интересующих генов в опыте и контроле использовали метод 2–ΔΔCt [24].
Статистические расчеты проводили с помощью программного пакета Statistica 10 («Stat Soft», США). Для проверки нормальности распределения количественных данных использовали критерий Колмогорова—Смирнова. Результаты представлены в виде значений среднего ± ошибка среднего. Для оценки межгрупповых различий содержания катехоламинов и уровня мРНК использовали t-критерий Стьюдента. Достоверными считали различия при уровне значимости p<0,05.
Результаты и обсуждение
Определение содержания дофамина и норадреналина в среднем мозге крыс после однократного внутрибрюшинного введения каберголина выявило достоверно значимое повышение уровня норадреналина у подопытных животных по сравнению с контрольной группой (табл. 2). Достоверных различий между группами в содержании дофамина обнаружено не было. Каберголин не изменял уровень норадреналина и дофамина в гипоталамусе.
Таблица 2. Влияние каберголина на уровень норадреналина и дофамина в среднем мозге и гипоталамусе крыс
| Группа | Средний мозг | Гипоталамус | ||
| норадреналин, нг/г | дофамин, нг/г | норадреналин, нг/г | дофамин, нг/г | |
| Опытная (n=10) | 639,15±64,53* | 211,4±16,26 | 686,27±93,28 | 527,91±32,42 |
| Контрольная (n=10) | 398,04±65,97 | 169,69±54,58 | 578,8±54,58 | 459,57±41,98 |
Примечание. *— p<0,05 (относительно группы «контроль», t-критерий Стьюдента).
Уровень мРНК BDNF в среднем мозге увеличился в 2 раза через 24 ч после введения каберголина (2,29±0,56) по сравнению с показателем в группе контрольных животных (1,08±0,16), t-критерий Стьюдента p<0,05. При этом каберголин не вызывал достоверных изменений уровня мРНК BDNF в гипоталамусе: 0,97±0,15; 1,12±0,11 — контрольная и опытная группы соответственно.
Таким образом, однократное введение агониста D2R каберголина приводило к увеличению содержания норадреналина и экспрессии мРНК BDNF в среднем мозге животных. Механизм активирующего эффекта каберголина на норадреналиновые нейроны не вполне понятен. По-видимому, он не может быть связан со взаимодействием каберголина с альфа-аутоадренорецепторами, локализованными на телах норадреналин-синтезирующих нейронов голубого пятна (locus coeruleus, LC), так как его аффинность по отношению к этим рецепторам крайне низка (α1A (Ki=288 nM), α2A (Ki=12 nM), α2B (Ki=72.4 nM), α1D (Ki=166 nM)). Использование метода микродиализа на бодрствующих свободноподвижных крысах показало, что подкожное введение селективного агониста D2R LY171555 вызывает дозозависимое снижение уровня норадреналина во фронтальной коре животных [25], не блокируемое антагонистом альфа-2-адренорецепторов иохимбином. Известно, что D2-ауторецепторы могут быть локализованы не только на окончаниях дофамин-синтезирующих, но и норадреналин-синтезирующих нейронов [26], тела которых локализованы в LC, расположенном под покрышкой среднего мозга, в задней области ростральной части моста. D2-ауторецепторы также были обнаружены в области проекций норадреналиновых нейронов LC во фронтальной коре и гипоталамусе. A.M. Galzin и соавт. [26], используя срезы гипоталамуса кролика, показали, что агонисты дофаминовых рецепторов перголид и апоморфин ингибируют вызванное электростимуляцией освобождение норадреналина, и этот эффект блокируется антагонистом D2R сульпиридом. Однако согласно данным Y.Misu и соавт. [27] это взаимодействие имеет более сложный характер. Так, дофамин и апоморфин оказывали двухфазный эффект на освобождение норадреналина — ингибирование при низких и обратный эффект — облегчение (стимуляцию) при высоких концентрациях агонистов [27]. Эти данные говорят в пользу постоянной D2-опосредованной тонической регуляции дофамином освобождения норадреналина в областях-мишенях. Нейроны LC проецируются в том числе в средний мозг и оканчиваются на телах дофаминовых нейронов VTA и SN [28]. Связываясь с альфа-адренорецепторами на телах дофаминовых нейронов, норадреналин осуществляет регуляцию их активности [29]. В литературе существуют достаточно противоречивые данные о направленности этого взаимодействия. Так, было показано, что разрушение LC приводит к увеличению усредненной импульсной (на 70%) и пачечной (на 50%) активности нейронов VTA [30], что говорит о тормозном норадреналиновом контроле дофаминовых нейронов VTA. С другой стороны, системное введение селективного ингибитора обратного захвата норадреналина ребоксетина усиливало пачечную импульсную активность дофаминовых нейронов VTA [31]. Изменение содержания норадреналина в среднем мозге может быть связано с непосредственным влиянием каберголина на импульсную активность нейронов LC, так как показано, что дофамин изменяет нейрональную активность норадреналиновых нейронов [32], активируя D2-рецепторы на телах нейронов LC [30, 33].
Дисфункция норадренергической нейротрансмиссии в LC, как показано в последние годы, имеет огромное значение в патогенезе когнитивных нарушений при БП [34—36]. При БП патологические включения (тельца Леви) появляются прежде всего именно в LC, раньше, чем в SN, приводя в дальнейшем к потере нейронов и нарушению норадренергической регуляции ядер шва и структур среднего мозга [34]. Таким образом, очевидно значение фармакологической терапии, направленной на стимуляцию норадренергической трансмиссии в LC и обладающей в то же время нейропротекторным потенциалом.
В настоящее время механизмы антидепрессивного, анксиолитического и прокогнитивного действия каберголина практически не изучены. По-видимому, важную роль в обеспечении этих эффектов играют нейротрофические факторы, прежде всего BDNF. Ранее было показано, что каберголин оказывает нейропротективное действие и предотвращает гибель нейронов, связанную с окислительным стрессом [37] — одним из наиболее значимых факторов повреждения нервной ткани при нейродегенеративных заболеваниях, депрессии, тревожных расстройствах, болезнях зависимости [38, 39]. В настоящей работе впервые показано, что каберголин при однократном введении вызывает достоверное повышение уровня мРНК BDNF в среднем мозге.
Обнаруженное свойство каберголина повышать уровень норадреналина и экспрессию мРНК BDNF в среднем мозге важно учитывать при изучении патогенеза и терапии заболеваний, сопровождающихся такими симптомами, как нарушения позы, походки, снижение настроения, сонливость, депрессия, когнитивные расстройства, которые обусловлены, как считают, прежде всего дефицитом норадреналина [40]. Так как блокада норадреналин-транспортного белка и повышение уровня экстраклеточного норадреналина в среднем мозге мышей предотвращает гибель дофаминовых нейронов, вызванную введением нейротоксина 1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридина (MPTP) [41] можно предположить, что в норме норадреналиновые нейроны LC оказывают нейропротективный эффект на дофаминовые нейроны среднего мозга.
Полученные в работе данные ставят перед исследователями несколько важных вопросов. Имеется ли прямая причинно-следственная связь между эффектами активации каберголином норадреналиновой нейротрансмиссии и экспрессии BDNF в среднем мозге? Какие рецепторные и внутриклеточные сигнальные механизмы опосредуют данные эффекты? Обладают ли другие агонисты дофаминовых D2-рецепторов эрголиновой и неэрголиновой группы аналогичным действием? Решение этих проблем позволит расширить наши представления о спектре фармакологической активности этого класса препаратов, активно используемых в неврологической практике.
Заключение
В настоящей работе показано, что селективный агонист дофаминовых D2-рецепторов каберголин, используемый в неврологии и нейроэндокринологии, повышает уровень норадреналина и экспрессию мРНК BDNF в среднем мозге экспериментальных животных. Эти свойства каберголина могут лежать в основе его антидепрессивной, анксиолитической и нейропротективной активности. Полученные данные расширяют имеющиеся представления о возможных областях применения этого класса препаратов. Вместе с тем необходимо дальнейшее экспериментальное изучение эффектов и механизмов действия каберголина и других агонистов D2-рецепторов, в том числе при их длительном применении.
Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда (проект №17-75-10190).
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.