В настоящий момент проблема развития мозга человека является одним из наиболее актуальных, но, к сожалению, далеких от окончательного разрешения вопросов. До сих пор остаются неисследованными многие аспекты формирования важнейших структур головного мозга (ГМ) в норме и в условиях патологии. Учитывая, что процессы развития мозга являются крайне чувствительными к воздействию экзогенных факторов, в том числе к этанолу, изучение данного вопроса является приоритетным.

Алкоголь — одно из наиболее используемых психоактивных веществ во всем мире [1]. Потребителями являются все группы населения независимо от пола и возраста, в том числе женщины в период фертильности. Наиболее опасно в этой ситуации потребление алкоголя во время беременности или грудного вскармливания. Этанол является одним из самых распространенных и легкодоступных тератогенов [2] и способен оказывать ряд неблагоприятных эффектов на развитие центральной нервной системы (ЦНС) эмбриона и плода [3].

Влияние алкоголя на развитие ЦНС характеризуется как макро-, так и микроскопическими изменениями. К макроскопическим относится развитие ряда различных дисгенезий [4], а также уменьшение общей массы ГМ в целом [5], и коры за счет снижения индекса гирификации в частности [6]. Для характеристики реакции ткани на микроскопическом уровне необходимо охарактеризовать реакцию всех основных ее компонентов в отдельности.

В настоящий момент нет единого мнения о том, к каким изменениям микроциркуляторного русла (МЦР) приводит хроническая пренатальная алкоголизация. Однозначно, что данное воздействие проявляется изменением ангиогенеза. Тем не менее характер этих нарушений является предметом дискуссии. Часть исследований свидетельствует, что такие изменения, как снижение плотности расположения сосудов в ткани мозга, возникают только после 30 нед развития [7]. Однако, согласно проведенным нами ранее исследованиям, происходит увеличение плотности микрососудистого русла коры больших полушарий уже на 8—12-й неделе развития [8].

Наибольшими неблагоприятными последствиями характеризуется воздействие алкоголя на клетки радиальной глии, астроциты, олигодендроциты и микроглию, что приводит к нарушению миграции, а впоследствии — к снижению количества клеток в популяциях нейронов и вызывает аномальную пластичность мозга [9], что подтверждается другими исследованиями [10, 11].

Ряд работ подтверждает снижение количества олигодендроцитов [12], что в свою очередь приводит к нарушениям миелинизации [13]. Кроме того, имеется тенденция к снижению количества микроглиальных клеток, что было продемонстрировано на модели грызунов [14]. Относительно реакции астроцитов в настоящий момент в литературе также нет единого мнения о происходящих изменениях в связи с тем, что алкоголь воздействует на астроциты не напрямую, а вторично, например через повышенное повреждение нейронов, нарушение созревания клеток-предшественников, высвобождение провоспалительных цитокинов микроглией или повреждение сосудистого русла головного мозга [9].

Влияние алкоголя непосредственно на нервные клетки неоднородно, результаты подобных исследований зависят от протокола исследования и изучаемой клеточной популяции. К общим нарушениям может быть отнесено нарушение миграции [15, 16], вследствие чего возникают аномалии расположения нейронных популяций в слоях коры ГМ [17]. Кроме того, отмечается общая тенденция к апоптозу. Большинство авторов сходятся во мнении, что пренатальная алкоголизация приводит к снижению количества клеточных элементов в ткани [18].

Цель исследования — оценка степени влияния пренатальной алкоголизации на формирование нейробласты, глиобласты и сосуды МЦР ГМ эмбрионов и плодов человека на разных сроках внутриутробного развития.

Материал и методы

В исследовании приняли участие женщины в возрасте от 25 лет до 41 года (средний — 37 лет), разделенные на две группы. Первая группа включала участниц без соматической или психической патологии, не имевших контакта с токсическими веществами, радиоактивным излучением и другими тератогенными факторами на производстве или в быту и не употреблявших алкоголь до (в период равный 1 мес до зачатия) и во время беременности. Вторую группу составили женщины, страдавшие алкоголизмом I—II стадии (стаж от 3 до 13 лет). Все участницы исследования ранее проходили курсы лечения от алкоголизма (от 1 до 10 раз), но в период, предшествующий забору материала для исследования, никто их них дисульфирам не принимал.

В ходе операций было получено 26 образцов эмбрионального материала от 8 до 11 нед внутриутробного развития. На основании срока развития и факта употребления алкоголя пациентками были сформированы две группы, разделенные на подгруппы. Группа Алкоголь (А) была сформирована из материала, полученного от женщин, страдавших алкогольной зависимостью, и включала две подгруппы: А1 — эмбрионы 8—9 нед развития и А2 — 10—11 нед развития. Обе подгруппы включали по 6 образцов. Группа Контроль (К) была составлена аналогичным образом из психически здоровых женщин: К1 — 9 нед и К2 — 10—11 нед, по 7 образцов в каждой.

Материал был получен в ходе операций по искусственному прерыванию беременности в родильных домах и гинекологических отделениях больниц Томска. Все участницы эксперимента были подробно информированы и подтвердили свое согласие в письменной форме. Все процедуры были выполнены согласно требованиям и рекомендациям Этического комитета и не противоречили Хельсинкской декларации 1975 г. и положениям пересмотра 2000 г.

Исследование образцов проводили с использованием светового микроскопа AxioScope A1 («Carl Zeiss», Германия) с предварительной подготовкой материала: изначальной фиксацией в 0,5% растворе глютарового альдегида на 0,1 М натрий-фосфатном буфере с pH 7,3—7,4 и дополнительным дофиксированием в 1% растворе оксида осмия. Последующая обработка состояла в обезвоживании в спиртах восходящих концентраций и заливке в эпоксидные смолы (Araldite). С полученных образцов изготавливали полутонкие срезы (0,5—1 мкм) при помощи ультратома Ultracut-E» («Reichert», Австрия) и окрашивали толуидиновым синим (краситель Ниссля) согласно общепринятой методике. При последующей фотосъемке применяли цифровую камеру Canon G10.

Нейробласты на препарате идентифицировались как округлые клетки с центрально расположенным ядром. Ядро имело светлый матрикс, занимающий основной объем перикариона, и включало от 1 до 3 ядрышек. Клетки располагались группами, размеры которых отличались вариабельностью. Идентификация глиобластов проводилась на основании выявления округлых клеток с высоким ядерно-цитоплазматическим соотношением, располагающихся группами между нервными клетками. Характерной особенностью ядер и в целом глиобластов являлась более интенсивная окраска по сравнению с нейробластами. В ядрах были заметны интенсивно окрашенные ядрышки, занимающие околоцентральное или центральное положение. В ходе исследования выявлялись клеточные контакты глиобласт-нейробласт и группировки глиобластов, окружающих нервные клетки (рис. 1—4 на цв. вклейке).

Рис. 1. Головной мозг эмбриона человека 8—9 нед развития, норма (группа К1).

Здесь и на рис. 2—4: окраска толуидиновым синим. На фото представлены сосуды МЦР (белые стрелки), глиобласты (красные стрелки), нейробласты (черные стрелки). Ув. 400.

Рис. 2. Головной мозг эмбриона человека 8—9 нед развития, пренатальная алкогольная интоксикация (группа А1).

Рис. 3. Головной мозг плода человека 10—11 нед развития, норма (группа К2).

Рис. 4. Головной мозг плода человека 10—11 нед развития, пренатальная алкогольная интоксикация (группа А2).

Для морфометрического анализа использовали программное обеспечение AxioVision 4.8. Работа была направлена на выявление количественных изменений нейробластов, глиобластов и сосудов МЦР сенсомоторной коры головного мозга человека на разных этапах внутриутробного развития. Проводили определение диаметра и площади каждого отдельного элемента ткани, а также определение удельной площади (отношение суммарной площади изучаемой структуры к площади всего среза) и подсчет среднего количества указанных структур на единицу площади среза.

Для статистической достоверности различий исследуемых выборок применяли программу Statistica 10 с анализом критерия Манна—Уитни (значимые различия при p<0,05).

Результаты

Анализ ткани головного мозга эмбрионов человека на 8—12-й неделях развития позволил сделать вывод о достаточной дифференцировке представленных клеточных и сосудистых элементов.

МЦР на данном этапе развития было представлено дифференцированными венулами и артериолами, а также широкой сетью капилляров. Для ГМ было характерно наличие венул безмышечного типа, стенка которых была представлена эндотелиоцитами с рыхлой соединительнотканной оболочкой. В стенках артериол, напротив, отмечалось наличие циркулярных гладкомышечных клеток. Капилляры были представлены сосудами соматического типа и имели сформированную стенку, состоящую из эндотелиоцитов, базальной мембраны, находящихся в ее структуре перицитов, а также расположенных снаружи адвентициальных клеток. Средний диаметр сосудов варьировал в пределах от 6 до 11 мкм. В просветах части сосудов отмечали наличие форменных элементов крови.

При морфометрическом исследовании было выявлено, что с увеличением срока развития происходит достоверное уменьшение средней и удельной площадей сосудов МЦР, а также увеличение их среднего и удельного количества по сравнению с подгруппами контроля (табл. 1). Ткань головного мозга, развивавшаяся в условиях хронической алкоголизации, на более поздних сроках характеризовалась меньшими по размеру сосудами с большей их плотностью на срезе. Данное состояние может являться причиной ишемии, приводящей к функциональным нарушениям в процессе последующего развития.

Таблица 1. Динамика количественных показателей сосудов в исследуемых группах

Примечание. ¹ — достоверные различия по сравнению с К2 (p<0,05); ² — достоверные различия по сравнению с А1 (p<0,05).

Полученные результаты изменения размеров сосудов МЦР соотносятся с данными, описанными в литературе [19, 20]. Согласно современным представлениям, уменьшение диаметров сосудов может являться результатом снижения уровня энергии перицитов. Указанное состояние приводит к стойкому увеличению внутриклеточного кальция и, как следствие, к сужению сосудов [20].

Как было отмечено ранее, влияние алкоголя на изменение плотности расположения сосудов МЦР на срезе является предметом дискуссии. Несмотря на то что в настоящем исследовании были подтверждены полученные нашими коллегами ранее [8] данные о том, что происходит достоверное увеличение плотности сосудов в ткани, в литературе присутствуют исследования с противоположными результатами — в них отмечалось уменьшение общей плотности распределения сосудов в ткани ГМ [4]. Причиной такого несоответствия результатов может являться тот факт, что исследуемые изменения зависят от дозы, чувствительности исследуемой области к воздействию этанола, а также протокола эксперимента.

В ходе изучения морфометрических показателей глиобластов были установлены достоверные различия размеров клеток на более ранних сроках, что характеризовалось преобладанием размеров глиобластов в подгруппе К1 над таковыми в подгруппе А1. При этом параметры образцов 10—11 нед развития достоверных различий не имели. Также в данном случае было отмечено увеличение среднего количества глиобластов в алкогольных подгруппах на всех изученных сроках (табл. 2). Несмотря на то что в работе не рассматривались отдельные популяции глиальных клеток, было выявлено общее увеличение количества глиобластов.

Таблица 2. Динамика количественных показателей глиобластов в исследуемых группах

Примечание. ¹ — достоверные различия по сравнению с К1 (p<0,05); ² — достоверные различия по сравнению с А1 (p<0,05).

В мировой литературе представлено много работ, свидетельствующих, что пренатальное влияние этанола приводит к уменьшению клеточного пула почти во всех популяциях глиальных клеток. Тем не менее большинство авторов отмечают, что не во всех областях мозга реакции одних и тех же клеточных популяций являются схожими [12]. Данный феномен может быть связан с опосредованностью воздействия этанола на клетки и нарушением их миграции и созревания. Кроме того, причиной увеличения количества клеточных элементов может являться развитие астроглиоза вследствие ускоренной трансформации клеток радиальной глии [21].

Как среди глиобластов, так и нейробластов в ходе исследования были отмечены реактивные изменения, представленные появлением гиперхромных сморщенных и несморщенных клеток. В этих случаях характерной чертой было выраженное расширение периваскулярного и перицеллюлярного пространств.

В ходе морфометрического анализа нейробластов для клеток, развивавшихся в условиях хронической алкоголизации, была выявлена отрицательная динамика темпов дифференцировки, что проявлялось преобладанием средних площадей нейробластов подгруппы А2 над соответствующими параметрами в К2. Изменение показателей плотности распределения клеток на срезе носило следующий характер: на ранних сроках внутриутробного развития отмечалось значительное преобладание количества нейробластов в ткани, подвергавшейся воздействию этанола. Количество клеток на 1 мм² в подгруппе А1 было на 40% больше такового в подгруппе К1. Тем не менее с увеличением срока развития произошел перекос исследуемого показателя в сторону ткани, развивавшейся в нормальных условиях, — отмечалось увеличение на 6% среднего количества нейробластов в группе К2 по сравнению с А2 (табл. 3).

Таблица 3. Динамика количественных показателей нейробластов в исследуемых группах

Примечание. ¹ — достоверные различия по сравнению с К1 (p<0,05); ² — достоверные различия по сравнению с К2 (p<0,05); ³ — достоверные различия по сравнению с А1 (p<0,05).

Несмотря на то что в литературе в настоящий момент отмечается недостаток данных, описывающих изменения размеров нейробластов в норме с увеличением срока развития, а также вследствие пренатального воздействия этанола, мы подтвердили полученные в предыдущих исследованиях [8] данные о том, что внутриутробная алкоголизация проводит к уменьшению размеров нейробластов. Результаты изменения количественного показателя нейробластов сопоставимы с данными литературы. Большинство авторов отмечают тенденцию к нарушению миграции и апоптозу [12, 18]. Преобладание количества клеток в А1 и последующее отставание этого показателя в А2 может быть результатом того, что первыми поражаются подкорковые структуры и только потом — различные отделы коры ГМ [18].

Заключение

Таким образом, в ходе исследования было установлено, что алкоголь оказывает значительное влияние на формирование ткани головного мозга эмбрионов. Данное влияние проявляется изменениями размеров и количества нейробластов, глиобластов и сосудов МЦР, что приводит к диспропорциональности развития всей ткани ГМ, прогрессирующей со сроком развития.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.