Сепсис является жизнеугрожающим состоянием и характеризуется системным ответом организма на бактериальную инфекцию [1—3]. Реакция системы гемостаза на генерализацию инфекции сопровождается повсеместным образованием микротромбов, которые нарушают микроциркуляцию и служат причиной мультиорганной дисфункции [4—6]. Коагулопатия при сепсисе возникает вследствие активации системы коагуляции, отложения депозитов фибрина в сосудах мелкого и среднего диаметра и развития ишемического повреждения капиллярного русла с возникновением органной недостаточности (чаще всего почечной и дыхательной). Коагулопатия в ответ на инфекцию имеет свои особенности — характерны активация коагуляции, супрессия фибринолиза и высокая частота развития органной дисфункции [2, 3]. В настоящее время разные авторы приходят к мнению, что существует разновидность синдрома диссеминированного внутрисосудистого свертывания (ДВС-синдром) — септическая коагулопатия [1, 3, 7].

Сложность диагностики этого состояния заключается в том, что клинические проявления широко варьируют от умеренных изменений коагулограммы без клинических проявлений до развития фульминантных форм с тромбозами и массивными кровотечениями. Следовательно, для диагностики септической коагулопатии необходимо применение специальных методов, позволяющих выявить активацию системы гемокоагуляции на ранних стадиях [8, 9]. Эти методы должны быть легко выполнимыми, доступными в повседневной практике, простыми в применении и иметь прогностическую ценность. Тромбоцитарный ответ на инфекцию может быть вызван контактом с патогеном или возникнуть при взаимодействии с иммунокомпетентными клетками [10, 11]. У пациентов с сепсисом в крови часто обнаруживаются циркулирующие тромбоцитарно-лейкоцитарные агрегаты, служащие платформой для генерации тромбина и формирования тромбов, которые нарушают кровоток и вызывают повреждение тканей.

В условиях развития системного воспаления тромбоциты взаимодействуют с лейкоцитами и меняют их активность. Тромбоциты экспрессируют различные рецепторы иммунных клеток, такие как толл-подобные рецепторы (Toll-like receptor, TLRs), которые распознают структуры микроорганизмов (патоген-ассоциированные молекулярные паттерны, ПАМП) и множество других молекул адгезии, что обеспечивает взаимодействие тромбоцитов с разными иммунными клетками [12]. Сообщается о способности тромбоцитов напрямую влиять на активность лейкоцитов, повышая экспрессию молекул адгезии, запускать дегрануляцию нейтрофилов и усиливать фагоцитоз [13]. Кроме того, тромбоциты являются основным источником растворимого CD4L (sCD4L), молекулы, отражающей продукцию активных форм кислорода, активацию макрофагов и опосредующей оптимальную активацию Т- и В-лимфоцитов. Многочисленные молекулы адгезии на поверхности тромбоцита обеспечивают связывание активированных тромбоцитов и лейкоцитов, усиливая передачу сигнала активации и привлекая лейкоциты, лишенные типичных молекул адгезии или характеризующиеся значительным снижением их числа, к месту воспаления. Это позволяет существенно усиливать иммунный ответ на воспаление [12, 13].

Прокоагулянтное состояние при сепсисе, приводящее к микротромбообразованию, связано с повышением экспрессии тканевого фактора (TF) различными клетками крови и резким снижением активности ингибитора пути TF (Tissue factor pathway inhibitor — TFPI). Инициация свертывания по внешнему пути требует присутствия TF. В экспериментальных моделях сепсиса на мышах K. Okamoto и соавт. [13] в 2016 г. показали, что макрофаги, нейтрофилы и моноциты являются источником TF и участвуют в непосредственной активации коагуляционного каскада на ранних этапах септического процесса.

Цель исследования — выявить наличие клеточной (тромбоцитарной) активации у пациентов с сепсисом с помощью модифицированной методики тромбоэластографии (ТЭГ) и оценить влияние активации системы гемостаза на частоту развития органной дисфункции.

Обследованы 60 пациентов, которые разделены на двегруппы по признаку наличия или отсутствия органной дисфункции. В 1-ю группу включены 36 пациентов с сепсисом, поступивших в реанимационное отделение городского септического центра ГБУ «Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт скорой помощи им. И.И. Джанелидзе» в 2017—2018 гг.

Источником сепсиса являлись интраабдоминальные инфекции у 13 (38%) пациентов, респираторные инфекции — у 12 (32%), инфекции кожи и мягких тканей — у 8 (21%), инфекции центральной нервной системы — у 3 (9%). Оценку тяжести органной дисфункции проводили по шкале SOFA (Sepsis-related Organ Failure), среднее значение составило 6,5 балла. Исследование образцов крови проводили в 1-е сутки с момента диагностики сепсиса тяжелой степени. Средний возраст пациентов 46 лет (от 31 года до 62 лет).

Во 2-ю группу включены 24 пациента с неосложненными формами интраабдоминальной инфекции без явлений огранной дисфункции. Всем пациентам этой группы установлен диагноз «острый аппендицит», по поводу которого проведено оперативное вмешательство в объеме лапароскопической аппендэктомии. В послеоперационном периоде осложнений не было. Средний возраст пациентов составил 34 года (от 23 до 47 лет). Лабораторные тесты выполнены в 1-е сутки после оперативного лечения.

Для оценки системы гемокоагуляции выполняли классические коагуляционные тесты (протромбиновый тест по Квику, определение активированного парциального тромбопластинового времени (АПТВ), плазменной концентрации фибриногена, количества тромбоцитов на гематологическом анализаторе Sysmex XS-1000i («Sysmex», Япония) и проводили ТЭГ (тромбоэластограф ТЕG 5000, «Haemonetics S.A.», США). Одновременно выполняли 2 пробы: исследовали образцы цельной крови и обедненной тромбоцитами плазмы (Platelet-Poor Plasma, PPP), стабилизированные цитратом натрия без использования индукторов агрегации. На гематологическом анализаторе проведен контроль содержания тромбоцитов в 10 образцах PPP — количество тромбоцитов не превышало 2·10⁹/л.

Кровь в объеме 340 мкл рекальцифицировали путем добавления 20 мкл 0,2 М раствора хлористого кальция, к образцу PPP в объеме 330 мкл добавляли 30 мкл 0,2 М раствора хлористого кальция согласно методике, предложенной производителем тромбоэластографа. С помощью данной методики создается возможность раздельной оценки плазменного и тромбоцитарного звеньев свертывающей системы [14]. Оценка показателей ТЭГ в пробе с PPP дает возможность оценить плазменное звено гемостаза, а сравнительная оценка 2 проб позволяет выявить активность тромбоцитарного (клеточного) звена системы гемокоагуляции. После получения результатов ТЭГ рассчитывали разницу основных показателей — ∆R, ∆M, ∆Angle (см. рисунок).

В ходе апробации методики определили границы нормальных величин показателей ТЭГ для образцов обедненной PPP у 30 здоровых добровольцев. Установлены референсные значения, которые приведены в табл. 1.

Статистический анализ проведен с помощью программ SPSS Statistic 17.0 и Microsoft Excel 2010. Учитывая ненормальный характер распределения, данные представили в виде медианы (квартиль 1—квартиль 3) — Me (Q1—Q3). Различия между группами оценивали с применением непараметрического критерия Манна—Уитни. Критическим уровнем статистической значимости считали р<0,05.

При анализе полученных данных обнаружены статистически значимые различия: параметры ТЭГ пациентов с сепсисом и наличием органной дисфункции характеризуют развитие гиперкоагулянтного состояния и отражают активацию гемостаза. В табл. 1 представлены результаты ТЭГ, выполненной по модифицированной методике. Отмечены различия показателей образцов цельной крови и образцов PPP. Для пациентов 2-й группы характерно состояние нормокоагуляции; активации системы гемостаза не наблюдается. Частота развития гиперкоагуляционного состояния, выявляемого методом ТЭГ, значительно выше у пациентов 1-й группы. При анализе ТЭГ пациентов 1-й группы на основании коагуляционного индекса (CI) гипокоагуляция выявлена у 5 (14%) пациентов, нормокоагуляция — у 17 (46%), гиперкоагуляция — у 14 (40%). Геморрагические осложнения отмечены у 4 (11,1%) пациентов с сепсисом (геморрагическая сыпь у 3 пациентов с тромбоцитопенией тяжелой степени, эрозивная гастропатия — у 1) при дальнейшем наблюдении вне сроков проведения исследования (на финальных стадиях заболевания).

При сравнении параметров цельной крови и PPP (показатели обозначены знаком Δ) появляется возможность раздельно оценить звенья гемостаза. Темп образования сгустка (К, ΔК) характеризует процессы агрегации и активации тромбоцитов, скорость образования фибрина. Показатель М.А. отражает плотность сгустка; в образцах цельной крови МА зависит от количества тромбоцитов и концентрации фибриногена, а в образцах обедненной тромбоцитами плазмы — только от концентрации фибриногена.

Значение МА больше у пациентов 1-й группы, чем у пациентов 2-й группы как в образцах цельной крови — 72 (66,4—78) мм и 61,5 (58,4—62,1), так и в образцах PPP — 58 (54,7—63,2) мм и 37,4 (35,2—39,6). На основании полученных данных можно предположить, что у пациентов 1-й группы происходит активация свертывающей системы за счет активации плазменного звена. Отсутствие статистически значимых различий показателя ΔМА у пациентов 1-й и 2-й групп объясняется, возможно, тем, что количество тромбоцитов у пациентов обеих групп и уровень плазменной концентрации фибриногена сопоставимы, а также тем, что у пациентов 1-й группы повышено значение МА в образцах РРР, чего не наблюдается у пациентов 2-й группы.

При сравнении результатов классических коагуляционных тестов различий между группами не получено (табл. 2).

Проанализирована частота развития огранной дисфункции у пациентов 1-й группы согласно критериям шкалы SOFA (табл. 3).

Определение клеточной активации представляет собой сложную задачу и требует применения наукоемких методик, таких как определение экспрессии мембранных маркеров активации, концентрации в плазме крови компонентов гранул тромбоцитов, пролиферации стимулированных клеток и других [15—20]. Получено много данных о том, что в патогенезе сепсиса и септической коагулопатии участвуют активированные клетки крови, отвечающие за иммунные процессы и свертывание крови. Активация свертывающей системы и тромбоцитов позволяет отграничить распространение инфекционного процесса. На протяжении многих лет для оценки функции тромбоцитов при решении различных задач в клинической практике применяется метод агрегометрии с использованием индукторов агрегации [21]. Ограничивает применение методики зависимость результата от количества тромбоцитов и уровня гематокрита.

ТЭГ позволяет выявить ранние признаки субклинической активации свертывания, предшествующей тромбозу. С помощью этой методики можно распознать различные состояния системы гемостаза — гипер- и гипокоагуляцию, нарушения агрегации тромбоцитов, гиперфибринолиз, а также оценить эффективность проводимой антикоагулянтной и антиагрегантной терапии.

Методика позволяет проследить три основные фазы свертывания крови — инициирование, усиление (амплификация) и распространение. После проведения исследований с использованием электронной микроскопии установлено, что показатель R — время начала реакции — соответствует фазе инициации, тогда как показатель K (время от начала формирования сгустка до достижения амплитуды кривой 20 мм) — отражает фазу усиления.

S. Zhong и соавт. [22] в 2016 г. привели данные об изменении параметров ТЭГ в зависимости от тяжести течения сепсиса. Показано, что для сепсиса характерно состояние гиперкоагуляции, установленное при уменьшении значений R и К, увеличении МА и коагуляционного индекса, а при развитии септического шока возможно развитие гипокоагуляции (соответственно увеличение R и К, уменьшение МА). Высокая максимальная амплитуда свидетельствует о возможной гиперфункции тромбоцитов или гиперфибриногенемии. Авторы отмечают, что при прогрессировании септического процесса снижается количество тромбоцитов.

G. Luckner и соавт. [23] в 2008 г. обследовали пациентов с сепсисом, которым планировалось провести экстренную лапаротомию. Стандартные коагуляционные тесты этих пациентов указывали на наличие гипокоагуляции и повышенного риска кровотечения. В то же время данные ТЭГ свидетельствовали о наличии гиперкоагуляционного состояния, и проведенные оперативные вмешательства сопровождались минимальной кровопотерей [23].

Существует методика определения функционального фибриногена с помощью ТЭГ с использованием цитратной крови, которая заключается в регистрации МА после добавления ингибитора тромбоцитарного гликопротеина IIb/IIIa (абциксимаба) и активатора внешнего пути свертывания (тканевого фактора). Формирование М.А. в пробе осуществляется только за счет фибриногена. При выполнении этого метода не всегда удается полностью ингибировать тромбоциты [24].

Предложенная модификация ТЭГ позволяет определить активацию коагуляции за счет плазменного звена системы гемостаза и развитие гиперкоагуляции у пациентов в критическом состоянии. Отмечается увеличение максимальной амплитуды ТЭГ при наличии сепсиса, что может быть связано с активацией тромбоцитов. Для определения диагностической ценности метода требуется проведение дополнительных исследований.

Модифицированная методика тромбоэластографии позволяет раздельно оценить клеточное и плазменное звенья свертывающей системы крови. При развитии сепсиса характерно гиперкоагуляционное состояние, обусловленное активацией плазменного звена системы гемокоагуляции. Увеличение показателя максимальной плотности тромба у пациентов с сепсисом может быть обусловлено активацией тромбоцитов либо повышенным уровнем фибриногена. Результаты исследования подтвердили, что развитие коагулопатии при сепсисе является закономерным звеном патологического процесса. Отсутствие различий при сравнении результатов классических коагуляционных тестов указывает на их низкую чувствительность для диагностики септической коагулопатии. В то же время применение глобальных коагуляционных тестов позволяет выявлять признаки гиперкоагуляции и активации плазменного звена системы гемостаза.

Благодарность. Авторы выражают благодарность Г.А. Пичугиной за консультацию в подготовке исследования и ценные замечания в процессе подготовки материала.

Финансирование. Исследование не имело финансовой поддержки.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflict of interest.

Сведения об авторах

Василицына А.В. — https://orcid.org/0000-0002-8275-5583; e-mail: an.v.mikheeva@gmail.com

Афончиков В.С. — https://orcid.org/0000-0003-4851-0619; e-mail: shwalbe262@mail.ru

Волчков В.А. — https: //orcid.org/0000-0002-5664-7386; e-mail:volchkovva@mail.ru

Автор, ответственный за переписку: Василицына А.В. — e-mail: an.v.mikheeva@gmail.com

КАК ЦИТИРОВАТЬ:

Василицына А.В., Афончиков В.С., Волчков В.А. Определение функциональной активности тромбоцитов при сепсисе с помощью модифицированной методики тромбоэластографии. Анестезиология и реаниматология. 2019;3:56-61. doi: 10.17116/anaesthesiology201903156