Хирургические вмешательства в условиях общей анестезии могут сопровождаться активацией нейровоспалительных реакций, которые, в свою очередь, определяют развитие послеоперационных осложнений, связанных с появлением дополнительного неврологического дефицита [1, 2]. Таким образом, нейровоспаление является важным патологическим фактором, однако многие детали возникновения этого процесса до сих пор неясны [3].

Циркулирующие в физиологических жидкостях нуклеиновые кислоты — ядерная ДНК (яДНК) и митохондриальная ДНК (мтДНК) могут быть индукторами асептической воспалительной реакции [4, 5]. Ранее нами было показано, что в ходе хирургического вмешательства по удалению менингиом в условиях общей ингаляционной анестезии севофлураном происходит запуск нейровоспалительного ответа, однако при этом уровни ни яДНК, ни мтДНК в ликворе не повышаются [6].

В эксперименте с использованием животных моделей показано, что активация нейровоспалительных реакций может быть обусловлена развитием системного воспалительного ответа [7, 8]. Поэтому в настоящей работе для поиска возможных регуляторов нейровоспаления у пациентов с менингиомами произведен анализ интраоперационных изменений уровней провоспалительных цитокинов и ДНК, циркулирующих в плазме.

Цель исследования — оценить развитие системной воспалительной реакции, а также определить уровни яДНК и мтДНК в плазме у пациентов с внутричерепными менингиомами в процессе нейрохирургического вмешательства, выполняемого в условиях общей ингаляционной анестезии севофлураном в сочетании с фентанилом.

В проспективное пилотное обсервационное одноцентровое исследование включены 14 пациентов (5 мужчин и 9 женщин) в возрасте от 39 до 65 лет с внутричерепными менингиомами. Все пациенты прооперированы одной нейрохирургической бригадой в период с июня по ноябрь 2017 г. на базе нейрохирургического отделения № 5 ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр им. В.А. Алмазова» Минздрава России. Критерии включения следующие: 1) наличие внутричерепной менингиомы с гистологическим подтверждением на постоянных препаратах; 2) возраст пациентов от 39 до 65 лет; 3) наличие информированного согласия. Критерии исключения: пациенты, страдающие аутоиммунными, нейродегенеративными заболеваниями, злокачественными новообразованиями, беременные. Группу контроля составили 5 здоровых взрослых добровольцев. Внутричерепные менингиомы крыльев и площадки клиновидной кости (7 пациентов), парасагиттальная менингиома верхнего сагиттального синуса (3 пациента), птериональная менингиома (1 пациент), менингиома бугорка турецкого седла (2 пациента), менингиома намета мозжечка (1 пациент) со степенью радикальности удаления опухоли Simpson I—IV имели гистологическое подтверждение менингиомы (WHO Grade I). Длительность операции составила от 120 до 210 (158±16,7) мин.

Всех пациентов при наличии в истории болезни заключения нейрохирургического диагностического комплекса перед операцией осматривал анестезиолог. Больные с внутричерепной гипертензией в исследуемую группу не входили. Все пациенты оперированы в плановом порядке. Риск анестезии и операции определен как для пациентов с III степенью тяжести состояния по классификации ASA. Хронические заболевания, имевшиеся у некоторых включенных в исследование пациентов, были вне обострения по клиническим и лабораторным данным, представленным в истории болезни. Оперативное вмешательство проводили на 2—4-е сутки от даты госпитализации. Ни у одного пациента не было послеоперационных осложнений.

Премедикация включала бензодиазепиновый анксиолитик фенорелаксан 1,0 мл внутримышечно вечером накануне операции и утром в день операции. При поступлении в операционную гемодинамический мониторинг включал неинвазивное измерение артериального давления (систолического, диастолического, среднего), частоты сердечных сокращений, уровня насыщения крови кислородом (монитор пациента IntelliVuе MX 800 «Philips», Нидерланды), периферической температуры и нейромышечной проводимости (TOF). После установки периферической венозной линии и инфузии 0,9% раствора натрия хлорида в периферическую вену начинали индукцию анестезии севофлураном через маску наркозно-дыхательного аппарата MAQUET FLOW-i, «Maquet», Швеция 8,0 об.% до достижения 1 МАК. По достижении 1 МАК внутривенно болюсно вводили фентанил 5,0 мкг на 1 кг массы тела. Во всех случаях без использования миорелаксантов и без технических трудностей при показателях TOF «0» выполняли интубацию трахеи ортотрахеальной методикой. Поддержание анестезии осуществляли методом низкопоточной ингаляционной анестезии севофлураном 3,6—4,2 об.% (1 МАК) в сочетании с микроструйным введением фентанила 2,5—4 мкг на 1 кг массы тела в час. Миорелаксанты не использовали. Анестезиологическая бригада была одна и та же во всех описываемых наблюдениях.

Цельную кровь собирали в пробирки с этилендиаминтетрауксусной кислотой (ЭДТА). У пациентов с менингиомами забор крови осуществляли на следующих этапах:

1) точка 1 (т1) — через 30 мин после вводного наркоза до хирургического разреза;

2) точка 2 (т2) — после вскрытия твердой мозговой оболочки (ТМО) на этапе доступа до начала удаления опухоли (примерно через 40 мин после т1);

3) точка 3 (т3) — после удаления опухоли и ушивания раны (примерно через 90 мин после т2).

Для получения плазмы образцы дважды последовательно центрифугировали при 1600 g в течение 10 мин. Супернатант после второго центрифугирования разделяли на аликвоты по 200 мкл и помещали на хранение при –80 °С. Аликвотированные пробы плазмы перед исследованием размораживали при комнатной температуре.

Концентрацию интерлейкинов IL-6 и IL-8 в плазме определяли на иммунохемилюминесцентном анализаторе Immulite 1000 («Diagnostics Products Corporation Cirrus Inc», США) с помощью наборов производителя «Siemens Healthcare Diagnostics Products Ltd» (Великобритания) согласно прилагаемым инструкциям. Нижний порог чувствительности метода детекции IL-6 и IL-8 составляет 2 и 5 пг/мл соответственно.

Перед выделением ДНК размороженную аликвоту плазмы центрифугировали при 3000 g 10 мин. В дальнейшей работе использовали супернатант. Общую ДНК выделяли из 100 мкл плазмы с помощью набора QIAamp DNA Mini Kit («Qiagen», США), согласно рекомендациям производителя по описанной ранее методике [9]. Полученные растворы ДНК хранили при температуре –80 °C.

Анализ уровней ДНК проводили с помощью количественной ПЦР в реальном времени по описанной ранее методике [9]. Для детекции яДНК использовали праймеры к высококопийному повтору Alu: Alu_F 5’-GTGGCTCACGCCTGTAATC-3’, Alu_R 5’-CAGGCTGGAGTGCAGTGG-3’. Для детекции мтДНК использовали праймеры к гену субъединицы цитохромоксидазы 3: CO3_F5 5’-CTTCTGGCCACAGCACTTAAAC-3’, CO3_R5 5’-GCTGGTGTTAGGGTTCTTTGTTTT-3’. Отсутствие ингибирования ферментативных реакций контролировали посредством детекции добавочной последовательностей ДНК mw2060 с помощью праймеров mw2060_F 5’-GTGCTGACCATCCGAG-3’, mw2060_R 5’-GCTTGTCCGGTATAACT-3’. Для амплификации мишеней использовали реактив qPCRmix-HS SYBR+ROX master mix («Evrogen», Россия). Препараты ДНК разбавляли в 10 раз водным раствором тРНК E. coli (10 нг/мкл). В реакцию ПЦР объемом 25 мкл вносили 5 мкл разбавленного раствора ДНК. Относительные количества исследуемых ДНК мишеней определяли как 2^{(Cq_max – Cq)}, где Cq — значение цикла квантификации исследуемой мишени в конкретном образце, Cq_max — максимальное значение цикла квантификации исследуемой мишени во всех образцах.

Статистический анализ результатов и визуализацию данных выполняли с помощью программы GraphPad Prism 5. Для анализа различий уровней исследуемых мишеней между группами образцов использовали непараметрический парный критерий Вилкоксона. Значение р<0,05 считали статистически значимым.

Для оценки развития системного воспалительного ответа уровни провоспалительных цитокинов IL-6 и IL-8 определены в плазме 12 пациентов с менингиомами в точках т1 и т3. В точке т1 уровень IL-6 был ниже предела детекции тест-системы во всех образцах, а уровень IL-8 — в 8 из 12 образцов. В точке т3 наблюдалось повышение уровня IL-6 в 2 образцах, а уровня IL-8 — в 3 образцах (см. таблицу).

Не обнаружено различий в уровнях ни яДНК, ни мтДНК между здоровыми взрослыми и пациентами с менингиомами до начала действия общей анестезии и хирургического вмешательства (см. рисунок, а, б). Таким образом, наличие менингиом не влияет на количество циркулирующих в системе кровообращения нуклеиновых кислот. У пациентов с менингиомами в точке т2 по сравнению с точкой т1, т. е. на этапе действия общей анестезии (но до начала основного этапа операции), уровень яДНК не изменялся (р=0,251). В точке т3 по сравнению с точкой т1, т. е. после хирургического вмешательства с удалением опухоли, наблюдалось повышение уровней яДНК (в 9,2 раза; p=0,043) (см. рисунок, а). Не обнаружено статистически значимых изменений уровня мтДНК ни на этапе действия общей анестезии (р=0,151), ни после хирургического вмешательства с удалением опухоли (р=0,224) (см. рисунок, б).

В настоящей работе проведен анализ изменения уровней провоспалительных цитокинов и циркулирующих ДНК в плазме у пациентов с внутричерепными менингиомами в процессе нейрохирургического вмешательства, выполняемого в условиях общей анестезии севофлураном в сочетании с фентанилом.

Отсутствие изменений уровней цитокинов IL-6 и IL-8 в плазме свидетельствует о том, что совместное действие общей анестезии севофлураном в сочетании с фентанилом и нейрохирургического вмешательства, направленного на удаление менингиомы, демонстрируют удовлетворительные результаты в отношении предупреждения развития системного воспалительного ответа по ходу операции. Это согласуется с данными литературы о неизменности уровней провоспалительних цитокинов в плазме во время малоинвазивных хирургических вмешательств в условиях общей анестезии, в частности, оториноларингологических [10] и краниотомии [11].

Результаты экспериментальных исследований на животных свидетельствуют, что для развития нейровоспаления в условиях общей анестезии необходимо хирургическое воздействие [12—14]. Ранее нами показано, что у пациентов с внутричерепными менингиомами развитие нейровоспаления также начинается на этапе хирургического вмешательства, причем оно происходит на фоне неизменности уровней циркулирующих в ликворе ДНК [6].

В настоящей работе установлено, что воздействие общей анестезии севофлураном в сочетании с фентанилом в течение примерно 30 мин не оказывает влияния на циркулирующие в плазме яДНК и мтДНК, что следует из отсутствия изменений их уровней при сравнении показателей в т1 и т2. При этом в т3, т. е. после нейрохирургического вмешательства, в плазме наблюдается повышение уровня яДНК, но не мтДНК. В данном случае причиной повышения уровня яДНК может быть ее дополнительный выход в систему циркуляции из поврежденных в результате удаления опухолевых клеток.

Ряд компонентов хроматина, включая двухнитевую ДНК и гистоны, а также взаимодействующий с нуклеосомами белок HMGB1, обладают провоспалительной активностью [5]. В эксперименте с использованием животных моделей показано, что при хирургических вмешательствах происходит повышение уровня циркулирующего HMGB1, который способствует повышению проницаемости гематоэнцефалического барьера и развитию нейровоспаления [15, 16]. Учитывая полученные нами результаты и данные литературы, можно предположить, что одной из причин развивающегося у пациентов с менингиомами интраоперационного нейровоспаления является появление в системе циркуляции содержимого ядер клеток, поврежденных на этапе хирургического вмешательства.

Следует отметить, что общие анестетики обладают способностью модулировать работу иммунной системы и поэтому могут регулировать развитие различных звеньев послеоперационных воспалительных реакций [17]. Так, в эксперименте с лабораторными крысами установлено, что севофлуран в отличие от пропофола способствует подавлению системного воспаления, но не нейровоспаления [18]. Учитывая эти данные, наблюдаемое отсутствие выраженной системной воспалительной реакции в процессе операций по удалению менингиом может быть связано с антивоспалительным действием севофлурана.

Дальнейшему прояснению роли общей анестезии в регуляции иммунного ответа будут способствовать сравнительные исследования групп пациентов, получающих разные анестетики, а также пациентов, которые подвергаются действию общей анестезии для диагностических целей в отсутствие хирургических вмешательств.

Уровни провоспалительных цитокинов — интерлейкинов 6 и 8, а также митохондриальной ДНК не меняются в плазме в ходе нейрохирургического вмешательства по удалению менингиомы в условиях общей ингаляционной анестезии севофлураном в сочетании с фентанилом. При этом на этапе удаления менингиомы происходит повышение уровня циркулирующей в плазме ядерной ДНК.

Финансирование. Исследование выполнено при поддержке гранта Российского научного фонда (проект № 19−75−20076).

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — И.С., А.К.

Сбор и обработка материала — Д.П., К.К., А.Ф., Д.Р., Т.К., Р.Р., А.П., Д.Г., Н.Д.

Статистическая обработка данных — К.К., А.Ф., Н.Д.

Написание текста — Д.П., К.К., А.Ф., А.К., И.С.

Редактирование — А.К., И.С.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts interest.