Введение
Одним из наиболее тяжелых инфекционных осложнений в отделениях реанимации и интенсивной терапии (ОРИТ) является нозокомиальная пневмония (НП): среди всех инфекционных осложнений ее доля превышает 25% [1, 2]. Наиболее частой формой НП в ОРИТ является вентилятор-ассоциированная пневмония (ВАП), поскольку длительная искусственная вентиляция легких (ИВЛ) служит ключевым фактором развития инфекционных осложнений. Частота развития ВАП может достигать 27% среди пациентов, находящихся на продленной ИВЛ [3]. У хирургических больных среди всех случаев пневмонии доля ВАП, по некоторым данным, достигает 86% [4]. У пациентов нейрохирургического профиля ВАП может развиваться в 40—50% случаев после оперативного вмешательства [5]. Эффективность терапии ВАП напрямую коррелирует со скоростью диагностики и назначения адекватной антибактериальной терапии [6]. У пациентов неврологического и нейрохирургического профиля проблема ВАП стоит особенно остро из-за необходимости продленной ИВЛ [7]. Поскольку длительная ИВЛ сопряжена с высоким риском развития НП, у пациентов нейрохирургического и неврологического профиля можно прогнозировать развитие ассоциированных инфекций [8].
В качестве подходов к улучшению результатов лечения ВАП рассматривают раннее прогнозирование тяжести течения заболевания и своевременную оценку эффективности проводимой антибактериальной терапии [9]. Выявление пациентов с потенциально тяжелым течением пневмонии и неблагоприятным прогнозом позволяет своевременно назначить антибактериальные препараты в деэскалационном режиме и тем самым повысить шансы на благоприятный исход. Помимо этого, нельзя забывать об угрожающем характере развития полирезистетности возбудителей нозокомиальных инфекций к антибактериальным препаратам [10]. В настоящее время среди лабораторных признаков течения ВАП значительный интерес вызывают биомаркеры. В европейских рекомендациях по лечению НП и ВАП (2017) упоминаются С-реактивный белок (СРБ), прокальцитонин, копептин и среднерегионарный фрагмент прогормона активного предсердного натрийуретического пептида (MR-proANP), однако нет указаний об их рутинном применении [9]. Эти маркеры обычно применяют для оценки выраженности воспалительного процесса. Вместе с тем стадия иммунного ответа определяет изменение концентрации, по крайней мере, нескольких сотен цитокинов в крови и других биологических жидкостях организма. Баланс провоспалительных и противовоспалительных факторов может отражать эффективность протекающего иммунного ответа, выраженность аутоагрессии иммунных клеток и иммунотолерантность данных клеток к патогену. Цитокины могут указывать на состояние врожденного иммунитета, играющего ключевую роль в предотвращении развития инфекций дыхательных путей и тяжести их течения [11]. Специфичность ранее исследованных маркеров течения ВАП относительно невелика и недостаточна для эффективного клинического применения. Наряду с биомаркерами плазмы крови многообещающим представляется изучение иммунного статуса аспирата из трахеи и бронхов (ТБА), являющегося продуктом воспаления и содержащего в низкой концентрации все факторы, секретируемые в очаге пневмонии. Изучение цитокинового профиля ТБА у пациентов с различным течением пневмонии, возможно, позволит найти новые биомаркеры эффективности антибиотикотерапии и исходов ВАП у пациентов нейрохирургического и неврологического профиля.
Цель исследования — оценить изменения цитокинового профиля ТБА у пациентов нейрохирургического и неврологического профиля с ВАП и возможность использования показателей его динамики для прогнозирования клинического течения пневмонии.
Материал и методы
Двухцентровое обсервационное исследование проведено на базах ГКБ №1 им. Н.И. Пирогова и ФГАУ «НМИЦ ЛРЦ» Минздрава России. Концентрацию цитокинов в ТБА определяли в лаборатории ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России. В исследование вошли 30 пациентов, соответствующих критериям включения. Исследование одобрено Межвузовским комитетом по этике, протокол №03-15 от 19.03.15.
Критерии включения и исключения пациентов
Для отбора пациентов приняты следующие критерия включения:
1) возраст от 18 до 85 лет включительно;
2) продолжительность ИВЛ более 3 суток;
3) наличие клинико-лабораторных и радиологических признаков ВАП (компьютерная томография (КТ): более 5 баллов по шкале CPIS (Clinical Pulmonary Infection Score) [12];
4) неврологические или нейрохирургические заболевания без сопутствующих инфекционных осложнений.
Критерии невключения в исследование:
1) наличие внелегочного инфекционного процесса (перитонит, менингит);
2) наличие изолированного трахеобронхита (без признаков инфильтрации легочной ткани по данным КТ);
Критерии исключения из исследования:
1) выявление внелегочного инфекционного процесса в период наблюдения;
2) отлучение от ИВЛ в период наблюдения (1—3-и сутки от начала антибактериальной терапии).
Дизайн исследования
Состояние пациентов оценивали в течение 5 суток после выявления признаков ВАП по шкале CPIS (табл. 1) и назначения антибактериальной терапии. В 1-е сутки забор биоматериала производили до введения антибактериальных препаратов. В 1-е и 3-и сутки пациентов оценивали на предмет основных признаков воспалительной реакции: уровень лейкоцитоза, концентрация С-реактивного белка (СРБ) в плазме и наличие гипертермии, а также забирали ТБА при санации трахеобронхиального дерева. Аспират помещали в асептические пробирки, содержащие ингибиторы протеаз (SIGMAFAST Protease Inhibitor Tablets, каталожный номер S8820, а также 4-(2-аминоэтил) бензолсульфонилфторид гидрохлорид, этилендиаминтетрауксусную кислоту, бестатин гидрохлорид, ингибитор цистеиновых протеаз E-64, лейпептин и апротинин), и замораживали при температуре –70 °C для последующего измерения концентрации цитокинов. Критерии разделения пациентов на группы применяли ретроспективно при анализе клинического состояния пациентов в течение 5 сут.
Таблица 1. Шкала CPIS [12]
| Показатели | Оценка по шкале CPIS, баллы | ||
| 0 | 1 | 2 | |
| Температура тела, °C | 36,5—38,4 | 38,5—38,9 | ³39,0 или 36,0 |
| Лейкоциты, ·109/л | 4—11 | <4 или >11 | <4 или >11. Незрелые формы >0,5·109/л |
| Трахеальный секрет | Минимальный/отсутствует | Значимый (светлая мокрота) | Гнойная мокрота |
| PaO2/FiO2, мм рт.ст.* | >240 или признаки ОРДС** | — | <240 и отсутствие признаков ОРДС |
| Рентгенография органов грудной клетки | Отсутствие инфильтрации | Диффузная инфильтрация | Локализованная инфильтрация |
| Результат микробиологического исследования ТБА | Отрицательный | — | Положительный |
Примечание. * PaO2/FiO2 — индекс оксигенации; PaO2 — напряжение кислорода в артериальной крови; FiO2 — концентрация кислорода во вдыхаемой газовой смеси; ** — ОРДС — острый респираторный дистресс-синдром; ТБА — аспират из трахеи и бронхов.
Принципы интенсивной терапии
Всем больным, включенным в исследование, проводили антибактериальную терапию в соответствии с чувствительностью нозокомиальной флоры ОРИТ. ИВЛ осуществляли в рамках протективной концепции: режимы вентиляции, управляемые по давлению, дыхательный объем — 6—8 мл на 1 кг массы тела, уровень положительного давления в конце выдоха (PEEP) 8—12 см вод. ст.
В настоящем исследовании не принимали во внимание различия между группами в медикаментозной и инфузионной терапии, лечении основного заболевания, а также в нутритивной поддержке пациентов.
Стратификация пациентов по группам
Пациенты ретроспективно разделены на две группы, обозначенные условно как «белая» и «красная», в зависимости от клинического течения ВАП. В «белую» группу вошли пациенты, у которых после начала антибиотикотерапии или смены антибиотикотерапии появилось клиническое улучшение (успешная антибиотикотерапия, n=17). Пациенты, состояние которых не изменилось или ухудшилось, несмотря на антибактериальную терапию, вошли в «красную» группу (n=13), оценка по шкале CPIS составила более 5 баллов к 5-м суткам наблюдения.
Пациентов включали в «белую» группу по результатам экспертной оценки клинического состояния и результатов лабораторных исследований:
1) регресс клинических признаков пневмонии и уровня маркеров системного воспалительного ответа;
2) клинические и лабораторные признаки улучшения газообмена;
3) положительная динамика по данным КТ органов грудной клетки;
4) оценка по шкале CPIS 5 баллов и менее на 5-е сутки наблюдения.
Определение концентрации цитокинов в биоматериале
Для измерения концентрации цитокинов и хемокинов использовали стандартные подготовленные диагностические наборы Bio-Plex 27-plex и 37-plex («Bio-Rad», США), измерение производили с помощью системы мультиплексного анализа Bio-Plex MAGPIX («Bio-Rad», США). С помощью мультиплексного иммуноферментного анализа образцов ТБА на магнитных частицах Magpix («Bio-Rad», США) определены концентрации 59 цитокинов: это антагонист рецептора интерлейкина (IL) IL-1 (IL-1RA), IL-1β, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12р70, IL-13, IL-15, IL-17, индуцируемый гамма-интерфероном белок 10-го типа (IP-10), эотаксин, гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (G-CSF), колониестимулирующий фактор гранулоцитов и макрофагов (GM-CSF), гамма-интерферон (IFN-γ), моноцитарный хемотаксический протеин 1-го типа (MCP-1), макрофагальный воспалительный белок 1 альфа (MIP-1α), макрофагальный воспалительный белок 1 бета (MIP-1β), основной фактор роста фибробластов (β-FGF), фактор роста тромбоцитов (PDGF-BB), фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), хемокин, экспрессируемый и секретируемый T-клетками при активации (RANTES), фактор некроза опухоли альфа (TNF-α), член надсемейства лигандов TNF 13-го типа (APRIL или TNFSF-13), B-лимфоцит-активирующий фактор (BAFF), протеин клеточной мембраны из семейства рецепторов TNF (sCD30), растворимый рецептор гемоглобина, экспрессируемый на клеточной мембране макрофагов (sCD163), хитиназа 3-подобный белок 1 (Chitinase 3-like), гликопротеин 130 (gp130/sIL-6Rβ), альфа 2-интерферон (IFN-α2), бета-интерферон (IFN-β), рецептор IL-6 альфа (IL-6 Rα), IL-11, IL-12p40, IL-19, IL-20, IL-22, IL-26, IL-27 p28, IL-28A/IFN-lambda2, IL-29/IFN-lambda1, IL-32, IL-34, IL-35, белок 14 надсемейства TNF (LIGHT или TNFSF14), матриксные металлопротеиназы (MMP) — MMP-1, MMP-2, MMP-3, остеокальцин, остеопонтин, пентраксин 3-го типа, растворимые рецепторы TNF — sTNFR1, sTNFR2, тимический стромальный лимфопоэтин (TSLP), элемент 12 надсемейства лигандов TNF (TWEAK).
Подготовку проб и измерение концентрации цитокинов проводили по стандартным инструкциям, предоставленным производителем. Концентрацию цитокинов измеряли с помощью стандартного программного обеспечения системы мультиплексного анализа.
Статистическая обработка данных
Обработку данных производили с помощью статистического пакета PASW STATISTICS 22. Для определения нормальности использовали критерий Шапиро—Уилкса. Описательные статистики на графиках представлены в виде медианы, квартилей, крайних точек и выбросов, к которым относили величины на расстоянии большем, чем 1,75 межквартильного размаха (не исключали из расчетов). Данные в несвязанных выборках сравнивали с помощью U-критерия Манна—Уитни, в связанных выборках — с помощью критерия Вилкоксона. Различия считали статистически значимыми при p<0,05. Прогностическую значимость концентрации цитокинов в ТБА и различия концентраций на 1-е и 3-и сутки определяли с помощью ROC-анализа. Для статистически значимых предикторов определены пороги диагностических критериев и соответствующие им показатели чувствительности и специфичности. Общую прогностическую ценность маркеров определяли и сравнивали по параметру AUC (area under the curve, площадь под кривой).
Результаты
Изменение концентрации цитокинов при различных ответах на антибактериальную терапию вентилятор-ассоциированной пневмонии
Для анализа отобрано 30 пациентов, удовлетворяющих критериям включения в исследование. Демографические характеристики выборки представлены в табл. 2.
Таблица 2. Описательная характеристика обследованных пациентов
| Характеристика | Все пациенты (n=30) | «Белая» группа (n=17) | «Красная» группа (n=13) |
| Возраст, лет | 55,1±15,4 | 54,3±16,1 | 56,2±15,1 |
| Пол | |||
| Мужчины, % (n) | 43,3 (13) | 58,8 (10) | 23,1 (3) |
| Женщины, % (n) | 56,7 (17) | 41,2 (7) | 76,9 (10) |
| Основной диагноз (заболевание или повреждение ЦНС) | |||
| ОНМК по геморрагическому типу, % (n) | 16,6 (5) | 17,6 (3) | 15,4 (2) |
| ОНМК по ишемическому типу, % (n) | 6,6 (2) | 5,9 (1) | 7,7 (1) |
| Опухоль головного мозга, % (n) | 33,3 (10) | 35,3 (6) | 30,8 (4) |
| Аневризма мозговых артерий, % (n) | 10 (3) | 11,8 (2) | 7,7 (1) |
| Закрытая черепно-мозговая травма, % (n) | 16,6 (5) | 11,8 (2) | 23,1 (3) |
| Открытая черепно-мозговая травма, % (n) | 10 (3) | 11,8 (2) | 7,7 (1) |
| Артериовенозная мальформация, % (n) | 3,3 (1) | 0 | 7,7 (1) |
| Энцефаломиелопатия, % (n) | 3,3 (1) | 5,9 (1) | 0 |
Примечание. ЦНС — центральная нервная система; ОНМК — острое нарушение мозгового кровообращения.
Концентрацию цитокинов в ТБА пациентов групп благоприятного («белая группа) и неблагоприятного («красная группа») клинического течения ВАП измерили в 1-е и 3-и сутки исследования. В 1-е сутки статистически значимые различия между группами выявлены по концентрации целого ряда цитокинов: IL-1β, IL-1RA, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-10, IL-13, эотаксина, FGF, IFN-g, MIP-1a, TNF-a, BAFF/TNFSF13B, IL-8, IL-29/IFN-lambda1, IL-32, sTNFR1, sTNFR2, TSLP (критерий Манна—Уитни, p<0,05, рис. 1). Во всех случаях концентрации цитокинов оказались значительно выше у пациентов с благоприятным клиническим течением пневмонии.
Рис. 1. Статистически значимые различия концентрации цитокинов в аспирате из трахеи и бронхов в 1-е сутки наблюдения.
Для наглядности значения концентраций приведены в логарифмической шкале (lg концентрации, пг/мл). Данные приведены в виде медианы, квартилей, крайних точек, выбросов.
Концентрация цитокинов у пациентов с неблагоприятным клиническим течением пневмонии практически не изменилась между двумя временными точками. У пациентов «белой» группы статистически значимо уменьшилась концентрация цитокинов MIP-1β, IL-10 и sTNFR2 (критерий Вилкоксона, p<0,05, рис. 2).
Рис. 2. Статистически значимые различия концентрации цитокинов в аспирате из трахеи и бронхов между 1-ми и 3-ми сутками наблюдения у пациентов «белой» группы.
Данные приведены в виде медианы, квартилей, крайних точек, выбросов.
При сравнении динамики концентрации цитокинов в образцах ТБА обнаружены статистически значимые различия между группами благоприятного и неблагоприятного клинического течения пневмонии: IL-1β (у пациентов «белой» группы — –1130 пг/мл, «красной» — –8 пг/мл), MIP-1a (у пациентов «белой» группы — –474 пг/мл, «красной» — +5 пг/мл), IL-10 (у пациентов «белой» группы — –10 пг/мл, «красной» — –3 пг/мл), sTNFR1 (у пациентов «белой» группы — –542 пг/мл, «красной» +14 пг/мл), sTNFR2 (у пациентов «белой» группы — –204 пг/мл, «красной» — 0 пг/мл) (рис. 3).
Рис. 3. Статистически значимые различия изменения концентрации цитокинов в аспирате из трахеи и бронхов за трое суток наблюдения у пациентов «белой» и «красной» групп.
Данные приведены в виде медианы, квартилей, крайних точек, выбросов.
ROC-анализ значимых предикторов благоприятного исхода
Прогностическую значимость динамики концентрации цитокинов определяли с помощью ROC-анализа. ROC-кривые построены для цитокинов, динамика концентрации которых статистически значимо и с достаточно большими абсолютными значениями различалась между пациентами групп благоприятного и неблагоприятного течения пневмонии.
Для изменения концентрации IL-1β в качестве предиктора клинического течения ВАП площадь под кривой составила 0,724 (p<0,05). Выбрано пороговое значение –339,5 пг/мл с показателями чувствительности 76,9% и специфичности 70,6%. Для изменения концентрации MIP-1a в качестве предиктора клинического течения ВАП площадь под кривой составила 0,758 (p<0,05). Выбрано пороговое значение —152,5 пг/мл с показателями чувствительности 92,3% и специфичности 70,6%. Для изменения концентрации sTNFR1 в качестве предиктора клинического течения ВАП площадь под кривой составила 0,756 (p<0,05). Выбрано пороговое значение –113,5 пг/мл с показателями чувствительности 92,3% и специфичности 64,7%. Для изменения концентрации sTNFR2 в качестве предиктора клинического течения ВАП площадь под кривой составила 0,812 (p<0,05). Выбрано пороговое значение —59 пг/мл с показателями чувствительности 100% и специфичности 64,7% (рис. 4).
Рис. 4. ROC-кривые изменения концентрации цитокинов в аспирате из трахеи и бронхов в качестве предикторов клинического течения вентилятор-ассоциированной пневмонии.
а — IL-1β; б — MIP-1a; в — s-TNFR1; г — s-TNFR2.
Обсуждение
Использование цитокинов в качестве биомаркеров эффективности лечения и исходов ВАП является перспективным направлением в оптимизации антибиотикотерапии пациентов с ВАП. Ряд исследований продемонстрировал потенциал цитокинов в качестве предикторов тяжести течения вне- и внутрибольничной пневмонии [13]. В то время как классические биомаркеры показали свою недостаточную информативность, развитие технологий одновременного определения низких концентраций белков в образцах малого объема позволило исследовать изменения концентрации первичных факторов воспалительного ответа непосредственно в образцах ТБА из очага воспаления. Известно, что корреляция между маркерами эндотоксикоза, специфическими биомаркерами и медиаторами воспаления может существенно варьировать на уровне клеточной, тканевой и сывороточной концентрации [14]. Как правило, образцы ТБА используют для поиска возбудителя пневмонии. Одновременно с этим небольшую часть образцов можно использовать для определения концентрации биомаркеров.
По результатам исследования, несмотря на небольшой размер выборки, выявлено несколько важных закономерностей. Уровень ряда провоспалительных и противовоспалительных цитокинов в ТБА оказался снижен уже в первые сутки наблюдения у пациентов с ВАП, у которых в последующем заболевание протекало тяжелее. Возможно, это является прямым следствием низкой эффективности воспалительной реакции и может быть связано с низким иммунным статусом больных. Среди этих цитокинов наибольший интерес представляют те, изменение концентрации которых к 3-м суткам было само по себе значительным и различалось между группами благоприятного и неблагоприятного исходов заболевания. Наиболее важными представляются различия в динамике цитокинов IL-1β, MIP-1a, sTNFR1, sTNFR2. IL-1β — один из ключевых цитокинов, инициирующих развитие воспаления при пневмонии. Его выделяют клетки эпителия бронхов, нейтрофилы, макрофаги и другие иммунные клетки с первых часов развития инфекционного процесса. По мере естественной смены стадий воспалительной реакции выделение IL-1β уменьшается. В нашем исследовании у пациентов с благоприятным клиническим течением пневмонии концентрация IL-1β в ТБА статистически значимо уменьшилась на 3-и сутки в отличие от пациентов с неблагоприятным клиническим течением пневмонии. Полученные данные соотносятся с данными литературы: в некоторых исследованиях последних лет показано, что изменение концентрации IL-1β в ТБА может являться диагностическим критерием развития ВАП [15, 16]. MIP-1a синтезируется активированными макрофагами в очаге воспаления. MIP-1a относится к группе хемокинов, обеспечивает хемотаксис лейкоцитов на ранних этапах воспалительной реакции. Концентрация MIP-1a у пациентов с благоприятным течением пневмонии в крови снижалась значительнее, чем у пациентов с неблагоприятным течением. Снижение концентрации хемокинов, участвующих в ранних этапах воспалительной реакции, также является проявлением эффективного иммунного ответа, в то время как высокая концентрация хемокинов свидетельствует о недостаточной эффективности иммунных клеток, пытающихся рекрутировать большее количество лейкоцитов из кровотока. MIP-1a не изучен в ТБА в качестве биомаркера, исследования концентрации данного цитокина в плазме, проведенные M.M. Relster и соавт., показали его прогностическую ценность при инфекциях дыхательных путей [17]. sTNFR1 и sTNFR2 — растворимые формы рецепторов к TNF-α. Считается, что эти цитокины оказывают противовоспалительное действие, поскольку ограничивают активность TNF-α — провоспалительного цитокина, выделяемого на разных этапах воспаления. TNF-α оказывает мощное системное и цитотоксическое действие, поэтому растворимые рецепторы необходимы для ограничения иммунного повреждения клеток. Роль sTNFR1 и sTNFR2 при пневмонии мало изучена в настоящее время. Имеются данные о том, что при некоторых других заболеваниях легких, в частности при туберкулезе, концентрация sTNFR снижается на фоне успешной антибиотикотерапии [18]. В нашем исследовании концентрация обоих рецепторов в ТБА у пациентов «белой» группы снизилась, что можно объяснить уменьшением выраженности воспалительной реакции. Это, в свою очередь, могло повлиять на продукцию противовоспалительных факторов, ограничивающих токсические эффекты TNF-a. Снижение концентрации sTNFR1 и sTNFR2 в ТБА в проведенном нами исследовании оказалось наиболее сильным предиктором благоприятного исхода лечения ВАП с высокими показателями чувствительности и специфичности. Полученные результаты указывают на необходимость проведения проспективного исследования с включением больших групп пациентов и на возможность использования этих параметров в клинической практике.
Заключение
Изучение цитокинов аспирата из трахеи и бронхов в качестве биомаркеров определения тяжести течения и прогнозирования исходов вентилятор-ассоциированной пневмонии является новым подходом в ведении пациентов, находящихся на длительной искусственной вентиляции легких. В нашем исследовании уже в 1-е сутки манифестации вентилятор-ассоциированной пневмонии цитокиновый профиль аспирата из трахеи и бронхов значительно различался между пациентами, у которых в последующем заболевание протекало благоприятно или неблагоприятно: высокая концентрация как противовоспалительных, так и провоспалительных цитокинов указывала на благоприятный прогноз. Особый интерес представляют цитокины, концентрация которых в аспирате из трахеи и бронхов не только была повышена в 1-е сутки у пациентов «белой» группы, но и ее изменения различались между группами. Установлено, что у больных нейрохирургического и неврологического профиля снижение концентрации провоспалительных цитокинов IL-1β и MIP-1a и sTNFR в аспирате из трахеи и бронхов на 3-и сутки от манифестации вентилятор-ассоциированной пневмонии является благоприятным прогностическим маркером эффективности антибактериальной терапии. Отсутствие динамики или увеличение концентрации этих цитокинов в аспирате из трахеи и бронхов может свидетельствовать о неэффективности проводимой антибактериальной терапии и указывать на необходимость смены тактики лечения.
В проведенном поисковом исследовании выявлены наиболее перспективные биомаркеры воспаления. В дальнейшем планируется более подробно исследовать динамику концентрации этих цитокинов в аспирате из трахеи и бронхов и практическую ценность их измерения.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.