Лейкоплакия - это наиболее часто встречающееся потенциально злокачественное поражение слизистой оболочки рта (СОР) [1, 2]. Лейкоплакия относится к разновидности гиперкератозов, характеризующихся хроническим течением и поражающих СОР и красную кайму губ [3]. При микроскопическом исследовании, когда клинически установлен диагноз «лейкоплакия», в 80-85% случаев обнаруживают гиперкератоз с гиперплазией базального и парабазального клеточного слоя, в 5-15% - гиперкератоз с различной степенью дисплазии, а в 2-5% - плоскоклеточный рак [4].

Факторы, приводящие к развитию лейкоплакии, полиэтиологичны. К ним относятся травмы механического, химического, термического генеза, генетическая предрасположенность. Около 70-90% случаев заболевания лейкоплакией СОР связано с курением, имеется прямая зависимость между частотой и длительностью курения и развитием лейкоплакии СОР [5, 6], в то же время факторы, вызывающие идиопатическую лейкоплакию, неизвестны.

В настоящее время выявлена связь развития лейкоплакии с наличием вируса папилломы человека (HPV) [7]. Папилломавирус человека - это небольшой ДНК-содержащий вирус, который проявляет тропизм к многослойному плоскому эпителию. В настоящее время идентифицировано около 120 типов HPV. HPV высокого онкогенного риска является причиной около 40% случаев заболевания раком СОР [8]. Репликации вируса HPV осуществляется только в пролиферирующих эпителиальных клетках СОР. В связи с этим выявление подобных клеток с помощью иммуногистохимического маркера пролиферации Ki-67 может служить дополнительным критерием предраковых состояний, поскольку известно, что при увеличении степени дисплазии количество пролиферирующих клеток, экспрессирующих белок Ki-67 в эпителии СОР, возрастает [9, 10].

HPV активизирует пролиферативную активность эпителиальных клеток за счет блокирования белка P16^INK4a. Ген P16^INK4a располагается на участке хромосомы 9p21, содержит три экзона и кодирует ядерный фосфопротеин с молекулярной массой 16 кД. Функция белка данного гена заключается в торможении клеточного цикла за счет связывания циклинзависимых киназ 4 и 6 и взаимодействия с циклином D1 [11].

В связи с вышеизложенным целью настоящего исследования было выявление белков Ki-67, P16^INK4a и антигенов папилломавируса человека высоко риска (HPV16) при гиперплазии, дисплазии и плоскоклеточном раке СОР.

Были исследованы биоптаты СОР 82 пациентов, в том числе 42 женщин и 40 мужчин. Средний возраст больных составил 62 года. При проведении гистологического исследования в качестве контрольной группы был взят неизмененный эпителий, прилегающий к участкам лейкоплакии. Гистологическая оценка исследуемого материала была выполнена согласно классификации ВОЗ (2005). Установлено 10 (12%) участков неизмененной слизистой, 35 (43%) образцов лейкоплакии без атипии, 16 (20%) биоптатов лейкоплакии с дисплазией различной степени от SIN 1 до SIN 3; у 21 (25%) пациента выявлен плоскоклеточный рак.

Материал фиксировали в 10% нейтральном формалине (pH 7,4), после проводки на гистопроцессоре образцы заливали в парафин с температурой плавления 54 °С. Для гистологического и иммуногистохимического (ИГХ) исследования серийные срезы толщиной 5 мкм помещали на стекла, покрытые поли-L-лизином. Выявление тканевых антигенов осуществляли с помощью поликлональных кроличьих антител к вирусу папилломы человека 16-го типа (ABBIOTEC) в разведении 1:400 и моноклональных антител P16^INK4a (clon EPR1473, EPITOMICS) - 1:200 и Ki-67 (MM1, «Diagnostic Biosystems») - 1:100. Выявление иммунных комплексов проводили при помощи безбиотиновой системы детекции на основе пероксидазы хрена (N-Histofine, Япония), срезы докрашивали гематоксилином Майера. Реакцию к вирусу папилломы человека 16-го типа и P16^INK4a оценивали качественно по клеточным зонам: в базальном, парабазальном и шиповатом клеточном слое, в плоскоклеточном раке оценивали периферическую и центральную зону распределения опухолевых клеток. Индекс пролиферации Ki-67 (ИП Ki-67) оценивали также по клеточным зонам, определяли отношение количества иммунореактивных ядер клеток к общему числу ядер (в %). Оценку показателей осуществляли в соответствующих участках тканей. Подсчет клеток проводили при увеличении в 400 раз. Статистическую обработку полученных данных проводили с помощью программы Statistica 10.0. стандартными методами с определением средней арифметической (М) и среднего квадратического отклонения (σ). Учитывая ненормальное распределение отдельных статистических показателей, сравнение двух независимых групп осуществляли непараметрическим методом при помощи U-критерия Манна-Уитни. Достоверными считали различия средних при уровне статистической значимости p<0,05. С помощью коэффициента r (табл. 2)

ИГХ-исследование эпителия СОР выявило особенности экспрессии белков, характеризующих пролиферативные процессы и вирусные антигены при различных морфологических проявлениях лейкоплакии, характеризующие репликацию вируса папилломы человека в пролиферирующих клетках многослойного плоского эпителия.

При ИГХ-исследовании неизмененного эпителия пролиферирующие клетки выявляли только в базальном слое, при этом в 6 случаях в ядрах клеток всех слоев определяли белок P16^INK4a, а в 2 случаях - белок HPV16. В клиническом материале при лейкоплакии с гиперплазией СОР и явлениями гиперкератоза экспрессию белка Ki-67 выявляли в ядрах эпителиальных клеток базального и парабазального слоя. При данном виде патологии отмечали экспрессию белка P16^INK4a в ядрах многослойного плоского эпителия всех исследованных зон в 77% случаев, а также положительную реакцию на вирусные антигены HPV16 в 34%. На рисунке продемонстрированы положительное ИГХ-окрашивание ядер эпителиальных клеток на белок P16^INK4a и отрицательная реакция на вирусные антигены HPV16 (см. рисунок, а, б).

Проведенный статистический анализ выявил высокие корреляционные связи между пролиферацией клеток в парабазальном слое при лейкоплакии с гиперплазией и экспрессией белка P16^INK4a, а также при лейкоплакии с дисплазией в парабазальном и шиповатом клеточном слое и наличием антигенов HPV16 (см. табл. 2).

Проведенные исследования показали, что при различных морфологических вариантах лейкоплакии от гиперплазии с гиперкератозом до плоскоклеточного рака в эпителиальных клетках многослойного плоского эпителия выявляются антигены вируса папилломы человека высокого риска HPV16 и белки, ассоциированные с HPV (P16^INK4a). Белок P16^INK4a тормозит формирование опухолей за счет блокирования циклинзависимых киназ (cdk4) за счет блокировки cdk4- и cdk6-вызванного pRb фосфорилирования, приводящего к торможению E2F-зависимой транскрипции, и осуществление клеточного цикла от точки сравнения G1 до S [12]. Подавление экспрессии гена P16^INK4a за счет гиперметилирования или мутации часто наблюдается в большинстве раковых клеточных линий и первичных опухолей человека. Таким образом, повышенная экспрессия гена P16^INK4a является непрямым маркером HPV, отражающим нарушение механизмов, контролирующих клеточную пролиферацию и характеризующим персистирование инфекции с высоким риском развития неоплазии [13, 14].

Учитывая тот факт, что в настоящее время идентифицировано более 120 типов HPV, выявлять их антигены с помощью ИГХ-методики не представляется возможным. Этот факт может объяснить низкий процент выявления антигенов HPV 16-го типа при гиперплазии СОР с гиперкератозом на фоне высокой экспрессии P16^INK4a, скорее всего вызванной папилломавирусами других типов.

ИГХ-исследования показывают, что P16^INK4a интенсивно экспрессируется в 100% случаев дисплазии и рака слизистой шейки матки, но редко выявляется в неизмененной слизистой оболочке [14, 15]. В серии диспластических поражений высокой степени коэффициент соответствия P16^INK4a-окрашивания составляет 100% [16]. В подобных исследованиях экспрессия P16^INK4a выявляет дисплазию шейки матки низкой степени, которая может прогрессировать в более выраженную дисплазию или карциному.

В настоящих исследованиях выявлена достоверная связь между SIN и HPV 16-го типа. Однако существуют самые противоречивые данные относительно наличия HPV-инфекции в эпителиальных клетках СОР при предраковых и раковых поражениях, начиная от 0 до 100% [17, 18]. Причина подобных расхождений скорее всего кроется в методических особенностях выбора образцов, методик исследования HPV и др. [19].

При различных морфологических вариантах лейкоплакии в эпителиальных клетках многослойного плоского эпителия слизистой оболочки рта обнаруживается повышенная пролиферативная активность клеток с экспрессией в клеточных ядрах белка Ki-67 и маркеров, которые непосредственно (HPV16) или косвенно (P16^INK4a) связаны с вирусом папилломы человека. При простой гиперплазии с гиперкератозом выявляется только белок P16INK4a, при плоскоклеточной интраэпителиальной неоплазии с гиперкератозом и плоскоклеточном раке - P16^INK4a и антигены вируса папилломы человека высокого риска (HPV16).

Выявление папилломавирусной инфекции при лейкоплакии позволяет не только определять ее генез, но и является морфологической основой для проведения эффективной профилактики и лечения этого часто встречающегося заболевания слизистой оболочки рта.