Для глиальных опухолей головного мозга человека описан широкий диапазон молекулярных изменений, который включает генетические, эпигенетические, транскриптомные изменения, а также изменения уровня микроРНК [1]. Тем не менее, несмотря на огромное количество данных, полученных за последние 40 лет, феномен нестабильной экспрессии коннексинов остается малоизученным и является своеобразной «визитной карточкой» глиом различной степени малигнизации [2, 3]. В предыдущей работе нами продемонстрирована дифференцированная экспрессия белка щелевых контактов (ЩК) нейронов коннексина 36 в глиомах Grade 2 и Grade 4 (глиобластомах). Показано снижение, но не полное исчезновение экспрессии этого антигена при увеличении степени малигнизации опухоли, что поднимает вопрос об участии цитоплазматического пула коннексина 36 в развитии злокачественного процесса [4]. В то же время известно, что белок ЩК астроглии коннексин 43 (Cx43) играет особую роль в развитии глиом [5]. Выявлено, что для глиальных неоплазм связь между экспрессией Cx43 и биологией опухоли отличается высокой сложностью [1]. Действительно, восстановление уровня экспрессии Сх43 в культуре клеток глиомы снижает скорость клеточной пролиферации и туморогенность. Однако этот онкосупрессивный эффект может быть нивелирован способностью коннексина 43 при определенных условиях усиливать инвазивность, способность к адгезии и миграции клеток опухоли [6]. Механизмы, лежащие в основе этих эффектов, предполагают участие самых разнообразных белков, которые связываются с разными участками молекулы Сх43, а также влияние проводящей функции ЩК и полуканалов.

Закономерности формирования ЩК и экспрессии коннексина 43 в глиальных опухолях в основном изучены на клеточных линиях, и вопрос об их наличии в условиях естественного развития нейроонкопатологии остается открытым. Исследование Щ.К. и полуканалов, образованных коннексином 43 в ткани опухоли, будет способствовать расширению представлений о патогенезе изучаемого злокачественного процесса и послужит основанием для поиска новых терапевтических подходов, нацеленных на восстановление онкосупрессивной активности Сх43 в клетках опухоли и перитуморальной зоны.

Целью настоящей работы являлось иммуногистохимическое (ИГХ) исследование экспрессии коннексина 43 в образцах глиальных опухолей различной степени малигнизации: гемистоцитарных астроцитомах (Grade 2), олигодендроглиомах (Grade 2) и глиобластомах (Grade 4).

Материалом для исследований служили фрагменты глиальных опухолей головного мозга человека, локализованных преимущественно в лобных долях, резецированные оперативным путем. Опухоли различались по степени злокачественности и включали гемистоцитарные астроцитомы (Grade 2, n=2), олигодендроглиомы (Grade 2, n=2), глиобластомы (Grade 4, n=14), а также фрагменты ткани, окружающей опухоль (n=4). Исследование было одобрено этическим комитетом МБУЗ «Городская больница скорой медицинской помощи» Ростова-на-Дону. Морфология и иммунофенотип глиальных неоплазм были определены при помощи патоморфологического исследования в сочетании со стандартной диагностической иммуногистохимией (см. таблицу).

Материал фиксировали в 10% забуференном формалине, обезвоживали и заливали в парафин по общепринятой методике, 4-микронные срезы изготавливали на автоматическом ротационном микротоме Leica RM 2255 (Германия). После стандартной процедуры депарафинирования, дегидратации проводили тепловую демаскировку антигенов. Тепловую демаскировку антигенов проводили в ретривере Cell Marque (США). Для ИГХ-исследования срезов использовали первичные кроличьи поликлональные антитела к коннексину 43 («Spring Bioscience», США) и систему визуализации Dako EnVision System + Peroxidase (DAB) («Dako», Дания). После проведения ИГХ-реакции ядра клеток докрашивали гематоксилином Майера. Полученные срезы изучали под светооптическим микроскопом DM 2500 («Leica», Германия) со встроенной цифровой камерой DFC 495 («Leica», Германия). Положительный контроль реакции с антителами к коннексину 43 проводили на образцах ткани миокарда человека, также осуществляли отрицательный контроль, в котором вместо первичных антител на срезы наносили буфер.

В качестве контроля для оценки возможных изменений экспрессии коннексина 43 при опухолевой трансформации исследовано распределение этого белка в ткани мозга, окружающей опухоль. В образцах перитуморальной ткани отмечается равномерная умеренная экспрессия коннексина 43 в нейропиле и более выраженная вокруг сосудов. При большем увеличении визуализируются многочисленные мелкие зерна хромогена, локализованные преимущественно на отростках клеток в нейропиле, а также в области формирования периваскулярных астроцитарных муфт вокруг микрокапилляров (рис. 1).

Исследование образцов опухолей показало, что по сравнению с перитуморальной тканью на препаратах гемистоцитарной астроцитомы, олигодендроглиомы и глиобластомы характер экспрессии коннексина 43 резко меняется. Из равномерной мелкозернистой в нейропиле она трансформируется в основном в крупногранулярную цитоплазматическую (внутриклеточную) и даже ядерную в зависимости от типа исследуемой опухоли. В целом, по нашим наблюдениям, в исследуемых глиомах отмечается снижение экспрессии коннексина 43 в структурах нейропиля, который сам по себе представлен в опухолях в меньшем количестве, т. е. содержание этого белка в отростках клеток обратно пропорционально степени злокачественности опухоли. В образцах гемистоцитарной астроцитомы Grade 2 в опухолевых гемистоцитах, имеющих атипичный вид, экспрессия белка ЩК астроглии в основном крупногранулярная цитоплазматическая и мембранная в отдельных клетках, также визуализируются негативные к коннексину участки ткани. При большом увеличении отмечаются плотные гранулы хромогена различного диаметра в цитоплазме, вокруг ядра и в отдельных тонких сложно переплетенных отростках опухолевых клеток. В некоторых дискретно расположенных опухолевых клетках наблюдается ядерная положительная реакция на исследуемый белок (рис. 2).

ИГХ-исследование олигодендроглиомы Grade 2 выявило выраженную экспрессию коннексина 43 в цитоплазме единичных отдельных крупных клеток опухоли и в их отростках, при этом экспрессия коннексина 43 в ядрах клеток отсутствовала (рис. 3, а). При большом увеличении в единичных участках наблюдаются дискретные мелкие гранулы продукта реакции в нейропиле опухоли, количество которых заметно снижено по сравнению с образцами гемистоцитарной астроцитомы (см. рис. 3, б).

При ИГХ-исследовании глиобластомы Grade 4 очаговая положительная реакция на коннексин 43 выявлена только в 6 из 14 образцов. В положительных на коннексин 43 опухолях отмечается фокальная экспрессия в области так называемых псевдопалисадов — участки с отрицательной реакцией на коннексин сменяются зонами с гранулярной специфической реакцией на исследуемый белок (рис. 4, а). При большом увеличении отмечаются яркие многочисленные крупные и мелкие гранулы хромогена в цитоплазме опухолевых клеток (см. рис. 4, б). Особый интерес представляет отчетливая гранулярная реакция на мембранах отростков опухолевых клеток, возможно, ассоциированная с образованием ЩК или полуканалов. Следует отметить, что, так же как и в образцах гемистоцитарной астроцитомы, в некоторых образцах глиобластом наблюдается ядерная реакция на коннексин 43, что может быть общим признаком астроцитом.

Проведенное ИГХ-исследование показало, что по сравнению с неизмененной тканью на препаратах гемистоцитарной астроцитомы, олигодендроглиомы и глиобластомы отмечается изменение распределения и в целом — снижение экспрессии коннексина 43, количество которого обратно пропорционально степени злокачественности опухоли. Эти результаты находят подтверждение в доступной литературе [5—12]. Уменьшение экспрессии коннексина 43 может быть связано как с подавлением транскрипции гена Gja1, кодирующего этот белок, так и со снижением трансляции мРНК и активацией процессов посттрансляционной деградации белка [1]. Процесс угнетения экспрессии коннексина 43 может приводить не только к редукции функциональных астроглиальных ЩК и полуканалов, но и к уменьшению количества самого белка, самостоятельно обладающего анти- и проонкогенными свойствами. К примеру, в ряде работ установлено, что наружные и внутренние домены коннексина 43 способствуют адгезии и усиливают миграцию опухолевых клеток [13—15]. В то же время молекула коннексина 43 обладает противоопухолевой активностью, обусловленной взаимодействием карбоксильных С-концов с веществами, участвующими в регуляции процессов клеточного цикла, пролиферации, дифференцировки и апоптоза [2, 5].

На фоне общего снижения экспрессии белка коннексина 43 отмечены некоторые особенности его распределения в глиальных опухолях по сравнению с образцами перитуморальной ткани мозга. Наиболее отчетливая разница выявлена в уровне экспрессии в цитоплазме опухолевых и неопухолевых клеток и в нейропиле, причем эти отличия наиболее очевидны для ткани олигодендроглиомы и образцов глиобластомы, в меньшей степени выражены в ткани гемистоцитарной астроцитомы. Наблюдаемое фокальное накопление коннексина 43 в цитоплазме клеток опухоли может быть связано с сохраняющейся экспрессией этого белка на фоне активного клеточного деления. Так, во время митоза происходит фосфорилирование С-конца молекулы коннексина 43 по остаткам серина в позициях S255, S262 и S368, которое сопровождается интернализацией белка и его аккумуляцией в цитоплазме. Как правило, после выхода из митотического цикла количество коннексина в цитоплазме уменьшается в результате формирования новых бляшек ЩК на мембране [16]. С другой стороны, наблюдаемое явление аккумуляции белка может быть результатом нарушения формирования коннексонов и накопления промежуточного белка в цитоплазме либо превалирования процесса интернализации. Оба этих процесса в опухолевых клетках могут быть связаны с аберрантной активностью ряда киназ. Так, например, воздействие на клетки некоторых факторов роста через опосредованную активность таких киназ, как протоонкогенная тирозинкиназа Src или протеинкиназа C (PKC), приводит к уменьшению количества коннексонов в бляшках ЩК [1, 17]. При этом ингибирование киназы PKC при опухолевом процессе может приводить к накоплению коннексина 43 в цитоплазме, поскольку ее влияние стимулирует движение белка из цитоплазмы к клеточной мембране [18]. Аберрантная активность протеинкиназы, А (РКА) вполне способна отвечать и за повышенную экспрессию коннексина 43 и в ядрах опухолевых клеток, отмеченную нами в образцах гемистоцитарной астроцитомы и глиобластомы, при отсутствии таковой в образцах неизмененной ткани. Несмотря на то что белок коннексин 43 не имеет участка, отвечающего за транспортировку молекулы в ядро, по немногочисленным имеющимся в литературе данным, этот коннексин, действительно, способен проникать в ядра кардиомиоцитов и HeLa-клеток после их трансформации вектором, экспрессирующим С-конец молекулы коннексина 43 [19]. Транспортировка коннексина 43 в ядро может быть опосредована анкорным белком протеинкиназы, А 95 (АКАР95) при действии РКА во время перехода от G1- к S-фазе [20]. Хотя авторы показали, что Сх43 при этом связывается в ядре с ДНК, на настоящий момент трудно определить роль ядерного пула коннексина 43 в процессах онкогенеза, в том числе для глиальных опухолей головного мозга.

Выявленная при помощи иммуногистохимии диффузная и фокальная экспрессия коннексина 43 в нейропиле глиальных опухолей не всегда может быть ассоциирована с формированием Щ.К. Вероятно, наблюдаемое мелко- и крупногранулярное окрашивание некоторых клеток и их отростков в основном проявляется благодаря наличию полуканалов, содержащих коннексин 43. При этом в литературе обсуждается гипотеза о том, что коннексин 43+ полуканалы способствуют прогрессии астроцитарных опухолей путем обеспечения свободного доступа к внеклеточному АТФ, который является иммуносупрессивным и ростстимулирующим агентом [21].

Низкий уровень экспрессии коннексина 43 может отражать как редукцию функциональных астроглиальных ЩК и полуканалов, так и уменьшение количества самого белка, самостоятельно обладающего антионкогенными свойствами. Наблюдаемая цитоплазматическая и ядерная экспрессия коннексина 43, вероятнее всего, связана с аберрантной активностью ряда киназ, таких как протоонкогенная тирозинкиназа Src или протеинкиназа C (PKC).

Работа выполнена при поддержке внутреннего гранта Южного федерального университета № 213.01−07−2014/05 ПЧВГ и гранта РФФИ № 15−04−03035.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования: Е.Ю.К., А.Э.М., П.Э.П.

Сбор и обработка материала: А.Ф.С., Д.В.К., М.А.А.

Статистическая обработка данных: Е.Ю.К., П.Э.П., А.Э.М.

Написание текста: Е.Ю.К., С.Ю.Ф.

Редактирование: Е.Ю.К., А.Э.М., П.Э.П.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.