Аневризма аорты — это расширение сосуда, превышающее 3 см в диаметре (в 1,5 раза больше нормальной артерии). С увеличением расширения аневризмы аорты (более 5 см) повышается риск ее разрыва. Смертность в США в связи с разрывом аневризмы аорты достигает 80—90%. Одна только аневризма абдоминального отдела аорты — причина 1—2% всех смертей у мужчин старше 65 лет [1].

Этиология возникновения аневризмы аорты не всегда известна. Традиционно считалось, что аневризма абдоминальной аорты в основном атеросклеротического происхождения, в то время как аневризма грудного отдела аорты чаще связана с наследственными генетическими болезнями. Понятно, что такое деление во многом условно. Дилатация аорты и последующее развитие аневризмы аорты связаны с нарушением ее стенки, т. е. с повреждением основной ее структурно-функциональной единицы ламели [2]. Ламели состоят из эластических фибрилл, формирующих две пластины, между которыми находится гладкомышечная клетка, окруженная коллагеновыми волокнами. Толщина ламели составляет 15—16 мкм. Число единиц ламелей в восходящей аорте 55—60, а в абдоминальном отделе аорты 28—32. В аневризме аорты расстояние между пластинами, состоящими из эластических фибрилл, увеличивается, эластические фибриллы истончаются и становятся фрагментированными [3].

Различные отделы аорты отличаются друг от друга по многим параметрам: они имеют разное эмбриональное происхождение (грудная аорта развивается из нервного гребня, а брюшная аорта — из мезодермы), отличается и количество vasa vasorum в адвентиции грудной и брюшной аорты. Наибольшее количество vasa vasorum в восходящей части аорты, а наименьшее — в брюшной аорте [4]. Отличия касаются и источников кровоснабжения разных отделов аорты: так, vasa vasorum восходящего отдела аорты кровоснабжаются из коронарных артерий, vasa vasorum грудного отдела аорты — из брахиоцефальных и межреберных артерий и т. д. Отмечено уменьшение толщины медиального слоя брюшной аорты по сравнению с толщиной медии в грудном отделе аорты [4]. Грозными осложнениями аневризмы аорты являются расслоение и разрыв ее стенки. Согласно статистике, расслоение стенки аорты в 95% случаев происходит в грудной аорте (в 65% случаев в восходящей части аорты, в 20% в нисходящей части грудной аорты, в 10% в дуге аорты) и только в 5% случаев — в брюшной аорте [5]. Все вышеперечисленное не позволяет проводить морфометрические исследования интимы, медии, адвентиции и vasa vasorum аневризмы без учета изучаемого отдела аорты. Высокая вероятность развития смертельных осложнений и в связи с этим большая социальная значимость аневризмы грудного отдела аорты заставили нас остановиться на изучении аневризмы этого отдела аорты.

Повреждение структуры стенки аневризмы связано и с наличием в ней воспалительных инфильтратов. Воспалительные инфильтраты стенки аневризмы представлены в основном Т-клетками и макрофагами. Помимо этих клеточных популяций, в стенке аневризмы аорты встречаются В-лимфоциты, лейкоциты, натуральные киллеры (NК-клетки) и тучные клетки. Еще в работах A. Koch и соавт. [6] отмечено, что среди воспалительных инфильтратов стенки аневризмы аорты доминируют CD3-положительные Т-клетки, состоящие из CD4 и CD8 Т-клеток. Количество CD4 Т-клеток в инфильтратах стенки аневризмы аорты превышает в 2—4 раза процентное содержание CD4 Т-клеток в нормальной периферической крови [6, 7]. В стенке аневризмы аорты среди CD4 Т-клеток обнаружены Th1 Т-клетки, Th2 Т-клетки и Treg Т-клетки. В этих же инфильтратах CD8 Т-клетки представлены как CD8⁺CD27^–, так и CD8⁺CD28^– [8—11]. Важную роль в повреждении стенки аорты и развитии в последующем аневризмы играют макрофаги, которые начинают вырабатывать и экспрессировать матриксные металлопротеиназы (MMPs). MMPs участвуют в процессах дезорганизации соединительной ткани стенки аорты.

Кроме MMPs, в стенке аневризмы присутствуют и их ингибиторы — тканевые ингибиторы матриксных металлопротеиназ (TIMPs). Таким образом, перераспределение или расширение границ определенных подтипов Т-клеток и макрофагов указывает на важность их участия в патогенезе аневризмы аорты.

Все сказанное представляет далеко не полный перечень известных на сегодня данных. Однако даже из приведенного описания понятно, что воспаление ответственно за повреждение стенки аорты. Мы постараемся выяснить, существует ли зависимость между активным воспалением в стенке аневризмы аорты и плотностью (количеством) vasa vasorum в различных ее слоях.

Материалом для исследования служили сегменты стенки аневризмы аорты, состоящие из интимы, медии и адвентиции, полученные во время протезирования аневризмы аорты. Исследовали аневризмы грудного отдела аорты больных с клиническим диагнозом дисплазии стенки аорты. Мужчин среди больных было 20, женщин — 5. Возраст больных колебался от 33 до 69 лет. Сегменты аорты, взятые у больных в операционной, немедленно фиксировали в 4% параформе. Далее фиксированные в параформе сегменты аневризмы аорты обрабатывали по общепринятой методике и заливали в парафин. Проведенное исследование делилось на два этапа. Первый этап заканчивался оценкой степени активности воспаления в стенке аневризмы и разделением исследуемого материала на три группы. В дальнейшем результаты такого деления не пересматривались! Второй этап заключался в оценке плотности vasa vasorum аорты в каждой группе. Иммуногистохимическое (ИГХ) исследование проводили следующим образом: с каждого блока делали 10 серийных срезов толщиной 3 мкм. Серийными срезами являются только «соседние» срезы (1-й и 2-й; 3-й и 4-й и т. д.), так как расстояние между ними равно или 0, или максимум 6 мкм, а расстояние между первым и последним срезом равно 24 мкм. На 1-м срезе ставили контрольную реакцию; со 2-го по 5-й — ИГХ-реакцию с антителами к CD3, CD4 и CD8 Т-клеткам, CD68-макрофагам. Далее визуально по степени активности воспалительного процесса в стенке аневризмы аорты все образцы разделили на три группы (1-я группа с активным воспалительным процессом, 2-я группа с воспалением средней степени активности, 3-я группа без воспалительных инфильтратов). Вторым этапом было сравнение плотности vasa vasorum в аневризме в ранее выделенных группах больных. Для этого в каждой группе 6-й срез исследовали с помощью антител к фактору Виллебранда, а 7-й срез — с помощью антител к NO-синтазе эндотелия. ИГХ-реакцию к α-актину гладкомышечных клеток ставили на 8-м срезе (рис. 1, д).

После ИГХ-реакции с антителами к CD3-, CD4-, CD8- и CD68- антигенам и α-актину препараты окрашивали гематоксилином. Морфометрические исследования проводили с помощью прибора ScanScope фирмы «Leica» (Германия) с применением морфометрической программы ImageScope («Leicamycrosystems CMS GmbH», Австрия). В 4 случаях морфометрическую оценку материала не проводили по независящим от исследователя объективным причинам. В каждом препарате измеряли толщину интимы, медии и адвентиции (в мкм). Измерения проводили в 6 различных, произвольно выбранных местах (по 6 измерений интимы, медии и адвентиции в каждом препарате). Статистическую обработку данных о толщине различных слоев аневризмы проводили с использованием программы MS Excel 2013. Количество vasa vasorum считали на площади ~ 500 мкм² (495 мкм² при увеличении 400) в 6 различных, произвольно выбранных полях зрения (по 6 полей зрения в медии и адвентиции) с помощью прибора ScanScope с применением морфометрической программы ImageScope (см. рис. 1, е). Для получения максимально объективных данных все подсчеты и измерения одновременно осуществляли два исследователя. Статистический анализ числа vasa vasorum проводили с помощью программы для статистического анализа Statistica 6.0. Оценку достоверности различий количественных показателей осуществляли, используя непараметрические критерии Манна—Уитни. Различия считали значимыми при уровне достоверности p≤0,05.

Первый этап начинался с гистологического исследования, при котором в подавляющем большинстве случаев интима была незначительно утолщена и склерозирована. Только в 4 случаях отмечались единичные небольшие атеросклеротические бляшки (липосклеротические) и липидные полоски. В медиальном слое аорты пучки гладкомышечных клеток местами имели разнонаправленную ориентацию, отличались по толщине, встречались участки дисплазии соединительной ткани, иногда (3 больных) по типу кистозного медианекроза. В ряде случаев (n=14) отмечена реваскуляризация средней оболочки. У 2 больных имелись участки расслоения стенки по среднему слою с развитием распространенных склеротических изменений всех слоев. Гистологическое исследование у 6 больных показало наличие в стенке аневризмы аорты массивных воспалительных инфильтратов (см. рис. 1, а). Воспалительная инфильтрация была не только в адвентиции: часть воспалительных мононуклеаров находилась в медиальном слое сосуда. В 6 случаях воспалительная инфильтрация адвентиции была умеренной и не выходила за ее пределы. В стенке аневризмы аорты у 13 больных обнаружить воспалительные мононуклеары не удалось или их выявляли как единичные клетки в поле зрения, они локализовались только в адвентиции сосуда.

Иммуногистохимически в воспалительных инфильтратах находились CD3-, CD4-, CD8- и CD68-клетки (см. рис. 1, б—г). Визуально среди воспалительных мононуклеаров в инфильтратах доминировали CD4 Т-клетки и CD68-макрофаги. Следует отметить частую локализацию Т-клеток и макрофагов вокруг vasa vasorum. В местах, где воспалительные инфильтраты окружали vasa vasorum, в просвете этих сосудов можно было видеть адгезированные на эндотелии Т-клетки и моноциты CD68 (рис. 2, а,

Таким образом, толщина медии в 1-й группе больных с высокой активностью воспалительного процесса была больше толщины медиального слоя 2-й группы (группа средней степени активности). Кроме того, отмечена тенденция к увеличению толщины медии у больных 1-й группы по сравнению с 3-й. Эти различия не были статистически значимы, что можно связать с большим разбросом данных и недостаточным в связи с этим количеством материала в 3-й группе. На этом первый этап исследования аневризмы аорты заканчивался.

Второй этап начинался с ИГХ-реакции к фактору Виллебранда и к NO-синтазе эндотелия. Реакция с антителами к NO-синтазе выявила неоднородность эндотелия vasa vasorum. Группы эндотелиальных клеток, а иногда и весь эндотелий, выстилающий отдельные капилляры и венулы (vasa vasorum), давали отрицательную реакцию с этим антителом. В то же время рядом расположенные капилляры и венулы vasa vasorum интенсивно окрашивались при этой реакции. Эндотелий vasa vasorum, не содержащий NO-синтазу, давал положительную реакцию с антителами к фактору Виллебранда (на серийных срезах) (см. рис. 2, б, д; длинные и короткие стрелки указывают на эндотелий vasa vasorum), т. е. говорить о том, что эндотелий в этих сосудах отсутствует, не приходится. Капилляры и венулы, в эндотелии которых отсутствовала NO-синтаза, крайне редко встречались и часто были единичными в срезе (см. рис. 2, в, е; длинные стрелки указывают на отсутствие NO-синтазы, короткие стрелки указывают на эндотелий, содержащий NO-синтазу).

Морфометрический подсчет количества vasa vasorum проводили на площади ~500 мкм² (или 0,5 мм²). Эндотелий vasa vasorum выявляли с помощью антител к фактору Виллебранда. Группа с активным воспалительным процессом (1-я группа) сравнивалась со 2-й и 3-й (2-я группа со средней степенью активности и 3-я группа, в которой не удалось выявить воспалительные инфильтраты в стенке аневризмы аорты).

При подсчете vasa vasorum в адвентиции аневризмы аорты обнаружена статистически значимая разница данного показателя между 1-й и 2-й группой, а также между 1-й и 3-й (p≤0,05) (табл. 2).

Исследование численности vasa vasorum с помощью антител к NO-синтазе в адвентиции выявило статистически значимое различие этого параметра между 1-й и 2-й группой, а также между 1-й и 3-й (p≤0,05) (табл. 3).

Формирование расслоения стенки аневризмы аорты и ее разрывы во многом связаны с воспалением и неоваскуляризацией стенки аневризмы аорты [12]. Визуально среди воспалительных мононуклеаров стенки аневризмы доминировали CD4 Т-клетки и CD68-макрофаги. В стенке аневризмы среди CD4 Т-клеток обнаружены Th1 Т-клетки, Th2 Т-клетки и Treg Т-клетки. Th1-клетки экспрессируют цитокины IL-2 и γ-интерферон, Th2-клетки — цитокины IL-4 и IL-5. В большинстве случаев Th2-клетки играют противовоспалительную роль, а Th1-клетки — провоспалительную [8—10]. Так, цитокины, экспрессируемые Th1-клетками, способствуют лизису коллагена и эластина, в то время как цитокины Th2-клеток препятствуют этим процессам. От того, каких клеток больше в инфильтратах, зависит прогрессирование воспаления в стенке аневризмы или превалирование в ней репаративных процессов. CD4 Т-клетки являются основным источником γ-интерферона, который вызывает активизацию макрофагов и способствует экспрессии ими матриксных металлопротеиназ (MMP-1, MMP-2, MMP-3, MMP-7, MMP-8, MMP-9 и т. д.). Макрофаги неоднородны: выделяют субпопуляции М1- и М2-макрофагов. М1-макрофаги являются провоспалительными клетками, способствующими прогрессированию деструкции и воспаления в ткани. М2-макрофаги могут оказывать противовоспалительное действие. Дисбаланс между М1-/М2-макрофагами может способствовать развитию аневризмы аорты. На модели аневризмы аорты, вызванной у мышей, продемонстрировано, что с помощью массивных инъекций Treg (Treg-клетки — это субпопуляция, находящаяся среди CD4 Т-клеток) можно вызвать переход М1-макрофагов в М2 и тем самым препятствовать развитию аневризмы аорты [13]. Кроме MMPs, в стенке аневризмы присутствуют и их тканевые ингибиторы (TIMPs), которые представляют собой ряд цинксодержащих ферментов. Местный баланс между MMPs и TIMPs определяет общее воздействие ферментов на стенки аорты. Так, при увеличении экспрессии матриксных металлопротеиназ происходит повреждение ламелей аорты [14, 15].

В настоящее время дискутируется вопрос, каким образом появляются мононуклеары крови в стенке аневризмы аорты. Согласно одной из гипотез, мононуклеары крови адгезируют к эндотелию аневризмы и далее через интиму аорты проникают в стенку сосуда. Вторая гипотеза утверждает, что воспалительные мононуклеары проникают в стенку аорты из vasa vasorum адвентициальной оболочки. Выявленная частая локализация Т-клеток и макрофагов вокруг vasa vasorum и формирование вокруг этих сосудов массивных воспалительных инфильтратов, очевидно, свидетельствуют о проникновении этих клеточных популяций в стенку аневризмы аорты из vasa vasorum. Это подтверждают и обнаруженные на эндотелии vasa vasorum адгезированные Т-клетки и моноциты. Все сказанное выше заставляет нас думать, что проникновение воспалительных мононуклеаров в стенку аневризмы со стороны интимы аорты маловероятно.

Иммунная реакция к NO-синтазе выявила гетерогенность эндотелия единичных vasa vasorum. Так, целые группы эндотелиальных клеток, а иногда и все эндотелиоциты в одном из сосудов vasa vasorum не давали положительной реакции с антителами к NO-синтазе. При этом рядом расположенные vasa vasorum содержали NO-синтазу. Мы не можем объяснить обнаруженный «феномен» особенностями иммуноморфологической реакции в данном конкретном месте, так как условия постановки реакции были одинаковые на всем гистологическом препарате. Так, в иммуногистостейнере Ventana воздушные сопла вортексы создают мягкий вихревой эффект над жидкостью на предметном стекле и вращают эту жидкость во время инкубационного периода сначала по часовой стрелке, а затем — против. Поэтому происходит тщательное смешивание антител и реагентов, а их постоянная концентрация осуществляется автоматическими дозаторами. Температура под каждым стеклом контролируется с помощью микросхем. И еще, реакция проходит не в капле, покрывающей срез (как это происходит при обычной иммуноморфологической реакции), а в жидкости, равномерно покрывающей все стекло. Все это дает нам право считать, что отрицательная реакция с антителами к NO-синтазе отдельных vasa vasorum не артефакт, а связана с отсутствием этого фермента. Неоднородность или гетерогенность эндотелиальных клеток отмечали и другие исследователи [16, 17]. Неоднородность эндотелиоцитов обнаружена при исследовании таких антигенов, как CD31, CD143. Одни эндотелиальные клетки были с высокой экспрессией CD31- или CD143-антигена, а в других он отсутствовал или содержался в крайне низкой концентрации. Такая гетерогенность встречалась в эндотелии сосудов сердца, желудка, кишечника и в культуре эндотелиальных клеток [16]. Возможно, что обнаруженная с антителами к NO-синтазе неоднородность клеток эндотелия vasa vasorum свидетельствует о его дисфункции. Существует версия, что эндотелиальная дисфункция вызывает высвобождение в сосуде O₂^–, ONOO^–, что приводит к экспрессии цитокинов и хемокинов (MCP-1, IL-6) и инфильтрации стенки аорты воспалительными мононуклеарами [18].

Статистически значимая разница между количеством vasa vasorum в 1-й и 2-й группах (р≤0,05); в 1-й и 3-й группах (р≤0,05) как с антителами к фактору Виллебранда, так и с антителами к NO-синтазе (см. табл. 2 и 3) свидетельствует о связи воспалительного процесса в стенке аневризмы аорты с количеством новообразованных vasa vasorum. Причем этот процесс происходит как в адвентиции, так и в медиальной оболочке аневризмы аорты. Отмечено, что уровень плотности капилляров в ране в процессе ее заживления коррелирует со степенью воспалительного ответа: факторы воспаления индуцируют миграцию эндотелиоцитов и перицитов в рану [19, 20]. Такую зависимость можно объяснить присутствием активных Т-клеток и макрофагов, экспрессирующих в окружающие ткани большое количество провоспалительных цитокинов (IL-1, IL-6, IL-8, INF-, TNF-, MCP-1 и др.), которые выявлены в стенке аневризмы аорты [21, 22]. Некоторые из них, кроме воспаления, способствуют неоваскулогенезу. Показано, что IL-1α, IL-6 стимулируют ангиогенез в ткани мозга, желудке и кишечнике [23, 24]. Очевидно, этим и обусловлена выявленная закономерность — статистически значимое увеличение числа vasa vasorum в препаратах аневризмы аорты с обильными воспалительными инфильтратами.

Таким образом, можно предположить, что vasa vasorum в стенке аневризмы аорты и ее воспалительная инфильтрация — это два взаимозависимых и взаимообусловливающих друг друга явления.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — П.В.Ч.

Сбор и обработка материала — А.Г.И., П.В.Ч., И.П.Д.

Статистическая обработка — Г. И.Х., М.А.А.

Написание текста — П.В.Ч.

Редактирование — А.Ю.П., П.В.Ч., И.П.Д.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflict of interest.

Сведения об авторах

Чумаченко П.В. — https://orcid.org/ 0000-0002-1162-6055, e-mail: chumach7234@mail.ru;

Афанасьев М.А. — https://orcid.org/ 0000-0002-4382-3176;

Иванова А.Г. — https://orcid.org/0000-0001-6962-7440;

Дробкова И.П. — https://orcid.org/ 0000-0003-1854-7322;

Хеймец Г.И. — https://orcid.org/ 0000-0003-3672-1830;

Постнов А.Ю. — https://orcid.org/0000-0002-2501-7269

КАК ЦИТИРОВАТЬ:

Чумаченко П.В., Афанасьев М.А., Иванова А.Г., Дробкова И.П., Хеймец Г.И., Постнов А.Ю. Воспалительные инфильтраты, vasa vasorum и NO-синтаза эндотелия в стенке аневризмы грудного отдела аорты. Архив патологии. 2019;81(5):45-52. https://doi.org/10.17116/patol20198105145