Несмотря на длительный период изучения особенностей неалкогольной жировой болезни печени (НЖБП), ее своевременная диагностика, профилактика и лечение остаются одной из нерешенных проблем медицины. В то же время создание эффективной схемы лечения НЖБП является крайне важной проблемой в связи с широкой распространенностью этой патологии и ее тяжелыми осложнениями [1—3].

Патогенез НЖБП остается до конца не изученным. Известно, что если образование липидов преобладает над синтезом липопротеинов и секрецией последних из печеночных клеток, происходит накопление жира в гепатоцитах, что ведет к усилению процессов свободнорадикального окисления липидов с накоплением продуктов перекисного окисления липидов, что при дальнейшем прогрессировании процесса приводит к некрозу.

Ремаксол (ООО «НТФФ «ПОЛИСАН», Санкт-Петербург), являясь многокомпонентным препаратом, содержащим инозин, меглюмин, метионин, никотинамид, янтарную кислоту, улучшает энергетическое обеспечение гепатоцитов, увеличивает синтез макроэргов, тем самым улучшая регенераторные способности клеток, кроме того, препарат повышает резистентность мембран гепатоцитов к перекисному окислению липидов. Являясь метаболическим препаратом, он также переводит анаэробные процессы в аэробные, что, вероятно, ускоряет утилизацию избытка внутриклеточных жирных кислот и глюкозы, тем самым предотвращая образование жировых включений в гепатоцитах.

Цель исследования — морфологическая оценка эффективности включения ремаксола в схему терапии НЖБП.

Работа была проведена на базе Научно-исследовательского института экспериментальной биологии и медицины ВГМУ им. Н.Н. Бурденко с использованием его оборудования. Протокол комиссии по этике ВГМУ № 2 от 30.10.18. Исследование выполнено на 32 самцах мышей линии C57BL/6 массой тела 35—44 г. Животные взяты из вивария клиники НИИ ЭБМ ВГМУ им. Н.Н. Бурденко. Моделирование НЖБП проводили с помощью гиперкалорийной диеты на основе высокого содержания фруктозы [4, 5].

Сформированы четыре группы животных по 8 в каждой. В 1-ю группу включены 8 мышей, в течение 75 сут содержащихся на стандартном пищевом рационе, включающем смесь овса, пшеницы, пшена, ячменя, семян подсолнечника (виварийный контроль). Во 2-ю и 3-ю группы вошли по 8 мышей, кормление которых осуществляли при помощи гиперкалорийной диеты в аналогичный период времени. Животных 2-й группы подвергли эвтаназии непосредственно после отмены диеты, а 3-й группы — через 20 сут восстановительного периода с переходом на стандартную диету. В 4-ю группу вошли мыши, которым после 75-суточного пребывания на гиперкалорийной диете проводили инъекции ремаксола внутрибрюшинно из расчета 25 мл/кг 1 раз в сутки через день, на курс 10 инъекций. Эвтаназию животных осуществляли в соответствии с требованиями Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и научных целей (Страсбург, 1986).

Для гистологического исследования фрагменты ткани левой доли печени мышей фиксировали в 10% нейтральном формалине (рН 7,4). Структуру долек и клеток печени исследовали после заливки образцов ткани в парафин на срезах, окрашенных гематоксилином и эозином. Липиды выявляли окраской REDOIL «O» с докраской гематоксилином Майера на криостатных срезах согласно соответствующему протоколу [6]. Полученные гистологические препараты исследовали на микроскопе ZEISS Axio Imager. А2, оснащенном камерой Camera Axiocam 506 color. Сфотографированные изображения обрабатывали в программе ZEN 2.3 («Carl Zeiss», Германия). Визуально оценивали структуру долек печени экспериментальных мышей всех групп, подсчитывали относительное количество гепатоцитов, содержащих липидные включения, на 75-е сутки опыта.

Статистическую обработку полученных результатов осуществляли стандартными методами в программе Excel 2007 Microsoft Office. Оценку различий между выборками проводили при помощи критерия Вилкоксона в онлайн-калькуляторе на сайте https://math.semestr.ru/group/wilcoxon.php.

При исследовании тканей печени мышей группы виварийного контроля в дольках наблюдались радиально расходящиеся от центральных вен печеночные балки, разделенные хорошо выраженными синусоидами. Цитоплазма большинства гепатоцитов содержала умеренное количество вакуолей различного размера (рис. 1, а).

Гепатоциты в балках содержали преимущественно одно ядро, однако встречались и двуядерные клетки. В области портальных трактов стромальный компонент был представлен в умеренной степени и практически отсутствовал в зоне центральных вен.

Через 75 сут диеты с высоким содержанием фруктозы в паренхиме печени у мышей наблюдались существенные дистрофические изменения. Выявлялась дискомплексация печеночных балок, просвет синусоидов в большинстве случаев определялся с трудом, что сочеталось с резким расширением некоторых из них (см. рис. 1, б). Цитоплазма превалирующего числа гепатоцитов была заполнена вакуолями различного размера вплоть до достаточно крупных, иногда занимающих практически весь объем клетки. Липидные включения разного размера выявлялись в большом количестве, занимая крупные области цитоплазмы (см. рис. 2, б) (табл. 1).

Гепатоциты с признаками выраженной жировой дистрофии локализовались преимущественно в перипортальной зоне долек печени. В паренхиме печени часто выявлялись лейкоцитарные инфильтраты без четкой внутридольковой локализации, однако более крупные из них располагались в перицентральной или перипортальной области. Стаз эритроцитов в центральных венах, венах портальной триады и поддольковых сосудах свидетельствовал о существенном нарушении внутрипеченочной гемодинамики.

У большинства животных через 20 сут после возврата на стандартную диету дискомплексация печеночных балок сохранялась в большей степени в перипортальной зоне, тогда как в перицентральной и в меньшей мере промежуточной области радиальная направленность печеночных балок имела тенденцию к восстановлению. Снижалась степень вакуолизации цитоплазмы гепатоцитов по сравнению с показателями группы затравки. Липиды в гепатоцитах определялись преимущественно в виде мелких капель, локализующихся в различных локусах клетки.

Обращало на себя внимание разное содержание липидов как в дольках печени, так и в рядом локализованных гепатоцитах, которые часто сильно различались по количеству жировых включений (см. рис. 2, в; cм. табл. 1). Тем не менее у 1 мыши из 7 выявлено высокое количество липидных включений, заполняющих практически всю цитоплазму большинства гепатоцитов. Лейкоцитарные инфильтраты сохранялись, так же как повышенное кровенаполнение сосудистого русла.

В табл. 2 приведена

У мышей, которым вводили ремаксол, морфологическим эквивалентом улучшения состояния печени по сравнению с группой без использования препарата являлись нормализация строения долек, сохранение структуры и внутридольковой направленности печеночных балок, восстановление ширины просвета синусоидов. Выраженность инфильтрации была гораздо меньшее по сравнению с группой экспериментальных животных без добавления препарата. Цитоплазма большинства гепатоцитов при окраске гематоксилином и эозином представляется заполненной оптически пустыми вакуолями различного калибра, которые, судя по результатам реакции на липиды, представляют собой включения другого состава (см. рис. 1, г). Однако в 1 случае из 7 при окраске REDOIL «O» наряду с оптически пустыми вакуолями выявляются достаточно многочисленные включения липидов преимущественно в виде мелких капель (см. рис. 2, г), что подчеркивают существующие индивидуальные различия метаболического профиля гепатоцитов животных.

Патогенез НЖБП остается до конца не изученным. Известно, что основные компоненты гепатоцеллюлярных липидов представлены триглицеридами, которые синтезируются из жирных кислот и глицерофосфата. Эти процессы идентичны как у людей, так и у мышей. Накопление липидных включений в печени может быть следствием избыточного поступления свободных жирных кислот в печень или усиленного их синтеза из ацетилкоэнзима А, особенно при избытке последнего. Источниками глицерофосфата в гепатоците являются глицерин, образующийся при гидролизе липидов, и глюкоза, которая в ходе гликолиза превращается в фосфатидную кислоту, запускающую реакции синтеза триглицеридов. Таким образом, продукция триглицеридов в гепатоците находится в прямой зависимости от содержания в нем жирных кислот, ацетилкоэнзима, А и глюкозы [7]. Фруктоза в печени по большей части под действием ряда ферментов, ведущее значение среди которых имеет альдолаза, превращается в глюкозу [7], избыток которой, как уже было сказано, приводит к повышенному производству триглицеридов. Если их образование превалирует над синтезом липопротеинов и секрецией последних из гепатоцита в виде липопротеинов очень низкой плотности, происходит накопление жира в гепатоците, что ведет к усилению процессов свободнорадикального окисления липидов с накоплением продуктов перекисного окисления липидов и развитием некроза печеночных клеток [8]. О патологической роли пероксидного окисления липидов известно давно. Усиление этого процесса вполне ожидаемо приводит к структурным изменениям, что и наблюдалось у подопытных мышей в исследовании на примере 2-й группы.

Ремаксол является многокомпонентным препаратом, содержащим инозин, меглюмин, метионин, никотинамид, янтарную кислоту. Согласно инструкции [9], ремаксол улучшает энергетическое обеспечение гепатоцитов, увеличивает синтез макроэргов, тем самым улучшая регенераторные способности клеток, что и повлияло на нормализацию клеточной структуры печени исследуемых мышей. Кроме того, препарат повышает устойчивость мембран гепатоцитов к перекисному окислению липидов, восстанавливает активность ферментов антиоксидантной защиты, тем самым снижая разрушительное влияние пероксидного окисления липидов. Являясь метаболическим препаратом, он также переводит анаэробные процессы в аэробные, что, вероятно, ускоряет утилизацию избытка внутриклеточных жирных кислот и глюкозы, предотвращая образование жировых включений в гепатоцитах. Подтверждает вышесказанное улучшение гистологической структуры срезов печени подопытных мышей на фоне лечения ремаксолом.

Примененный метод моделирования НЖБП на мышах линии C57BL/6 приводит к развитию признаков жировой дистрофии печени. Уменьшение дистрофических изменений, наблюдаемое после отмены гиперкалорийной диеты, позволяет считать возникшую патологию частично обратимой. Обнаруженные гистологические признаки могут свидетельствовать об эффективности применения ремаксола в терапевтической дозировке для лечения НЖБП.

Участие авторов:

Концепция и дизайн — Ю.Г.П., С.Е.П., Д.А.А.

Сбор и обработка материала — С.Е.П., А.А.К., Д.А.А., В.Л.Л.

Статистическая обработка данных — Ю.Г.П., С.Е.П., Д.А.А.

Написание текста — Ю.Г.П., С.Е.П.

Редактирование — А.А.К., Д.А.А., В.Л.Л.

Исследование проведено по инициативе авторов. ООО «НТФФ «ПОЛИСАН» не оказывало влияния на определение структуры исследования, анализ полученного материала, интерпретацию результатов и написание статьи. Исследование проведено без стороннего финансового участия.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.

Сведения об авторах

Притулина Ю.Г. — https://orcid.org/0000-0002-1484-2300, e-mail: pritulina1@gmail.com;

Прокопенко С.Е. — https://orcid.org/0000-0002-5211-4144;

Корденко А.А. — https://orcid.org/0000-0003-4744-332X;

Атякшин Д.А. — https://orcid.org/0000-0002-8347-4556;

Лобанов В.Л. — https://orcid.org/0000-0001-5798-7457

КАК ЦИТИРОВАТЬ:

Притулина Ю.Г., Прокопенко С.Е., Корденко А.А., Атякшин Д.А., Лобанов В.Л. Оценка влияния ремаксола на гепатоциты при моделировании неалкогольной жировой дистрофии у лабораторных мышей линии C57BL/6. Архив патологии. 2019;81(5):64-69. https://doi.org/10.17116/patol20198105164