Сегодня проводятся множественные клинические исследования противоопухолевых препаратов, ингибиторов контрольных точек иммунитета. Мишенью для терапии становятся опухоли различных локализаций, в том числе и рак молочной железы. В рамках исследования IMpassion130 получены обнадеживающие результаты выживаемости пациенток с тройным негативным подтипом рака молочной железы. На фоне проводимой терапии удалось достичь средней выживаемости в 25 мес (95% ДИ 19,6—30,7) у больных с местно-распространенным или метастатическим процессом, что на 7 мес дольше, чем у больных, не получавших атезолизумаб [1].

К сожалению, не всем пациентам показано лечение ингибиторами контрольных точек. На текущий момент для различных локализаций разработано несколько способов определения чувствительности к препарату. Основным считается оценка экспрессии лиганда программируемой клеточной гибели PD-L1. Наряду с этим весьма актуально определение уровня микросателлитной нестабильности при помощи иммуногистохимического метода. В последнее время особый интерес к новым иммуногистохимическим маркерам связан с появлением нового подхода к выбору лекарственной терапии (Tumor Type-Agnostic Treatment) [2]. Этот способ предполагает назначение лекарственного препарата только на основе результатов тестирования без учета локализации процесса.

Микросателлиты — это короткие повторяющиеся последовательности, присутствующие в геноме в большом количестве. Во время синтеза ДНК именно в этих участках часто происходят ошибки, что приводит к формированию гетеродуплесной ДНК. Участки новой созданной цепи ДНК, не соответствующие материнской, не способны формировать водородные связи, так как основания нуклеотидов в этих участках не комплиментарны. Такие фрагменты нити приобретают форму «петли» и требуют корректировки со стороны системы репарации неспаренных оснований ДНК [3].

Для поддержания микросателлитной стабильности в клетке имеется целая группа белков, способных образовывать гетеродимеры между собой. Например, белок MSH2 формирует гетеродимер с белком MSH6 для распознавания и коррекции ошибок в единичных нуклеотидах, исправляет короткие пели, а объединение с белком MSH3 позволяет корректировать более длинные петли. Гетеродимер MLH1 и PMS2 координирует связь между системой распознавания и другими белками системы репарации (MMR) [4, 5]. Накопление таких ошибок в связи с потерей белков MMR называется микросателлитной нестабильностью [6].

Однако снижение эффективности работы над ошибками может быть вызвано не только мутацией гена, кодирующего соответствующий белок, но и эпигенетическим нарушением — гиперметилированием гена MLH1, в результате чего отсутствует синтез белка в клетке [7].

Цель работы — оценить возможность применения иммуногистохимического выявления микросателлитной нестабильности для обнаружения пациентов, чувствительных к ингибиторам контрольных точек иммунитета.

Материал и методы

В исследование включены опухоли 40 пациенток: 31– с тройным негативным и люминальным B, HER2-негативным подтипом. У 18 наблюдаемых пациенток в момент постановки диагноза были метастазы в подмышечные лимфатические узлы. Лечение 16 пациенток было начато с оперативного вмешательства, остальные получали неоадъювантную химиотерапию согласно клиническим рекомендациям по лечению рака молочной железы. Наблюдение за пациентками велось с ноября 2014 г. до сентября 2019 г. За это время 1 пациентка выбыла из исследования, у 2 отмечен рецидив заболевания в виде висцеральных метастазов. Среднее время наблюдения составило 37 мес.

В каждом случае проведено патологоанатомическое исследование операционного материала, определен уровень инфильтрации иммунными клетками (TILs). У прошедших неоадъювантную терапию выполнена оценка остаточной опухолевой нагрузки по системе RCB.

С каждого исследуемого блока изготовлено по 6 срезов толщиной 4 мкм, которые размещались на стеклах с высоко адгезивным покрытием. После ночной сушки в термостате при температуре 37 °C препараты были окрашены в иммуногистохимическом стейнере Ventana Bench Mark Ultra. Первый срез окрашивали реагентом негативного контроля.

Для выявления микросателлитной нестабильности выбраны 3 мышиных моноклональных антитела: Ventana anti-MLH1 (клон M1), Ventana anti-MSH2 (клон G219-1129), Ventana anti-PMS2 (клон A16-4), и одно кроличье Ventana anti-MSH6 (клон SP93). В каждом случае применяли систему детекции OptiVeiw DAB IHC DetectionKit с OptiVeiwAmplificationKit. В качестве контроля использовали аппендикс и фрагмент рака сигмовидной кишки с известным высоким уровнем экспрессии маркеров микросателлитной нестабильности (рис. 1).

Рис. 1. Иммуногистохимические реакции в контрольных препаратах.

а—г: нормальный аппендикс, исследование с антителами к: а — MLH1; б — MSH2; в — MSH6; г — PMS2; д—з: рак ободочной кишки с известным статусом MSS, исследование с антителами к: д — MLH1; е — MSH2; ж — MSH6; з — PMS2. а—г — ×5, д—з — ×10.

При отсутствии экспрессии в 1 препарате из 4 выставлялся статус MSI-L (низкий уровень микросателлитной нестабильности), в 2 — MSI-H (высокий уровень микросателлитной нестабильности. Частичное выпадение экспрессии наблюдалось лишь в некоторых случаях, и согласно методике оценки такие препараты считались позитивными. Если не выпадало окрашивание применяемых маркеров, выставлялся статус MSS (микросателлитная стабильность).

Для оценки PD-L1-статуса опухоли использовали антитело Ventana PD-L1 (клон SP142), систему детекции OptiVeiw DAB IHC Detection Kit с Opti Veiw Amplification Kit. Статус опухоли считали позитивным, когда 1% и более иммунных клеток, расположенных в строме опухоли, имели позитивное окрашивание. Методика проведения анализа и оценки препаратов приведена в нашей публикации [8] ранее.

Статистическую оценку выживаемости проводили методом построения кривых Каплана—Майера, сравнение качественных независимых переменных — при помощи точного критерия Фишера.

Результаты

По данным нашего исследования, 14 (35%) из 40 пациенток имели PD-L1-позитивный статус. При этом выпадение каких-либо маркеров микросателлитной нестабильности наблюдалось в 4 (10%) из 40 случаев. Более того, наличие MSI-H выявлено лишь в 1 (2,5%) случае. Подробные данные приведены в таблице, а примеры позитивного и негативного окрашивания опухолей отражены на рис. 2.

Рис. 2. Иммуногистохимические реакции в опухолях молочной железы.

а—г: позитивные реакции, исследование с антителами к: а — MLH1; б — MSH2; в — MSH6; г — PMS2; д—з: негативные реакции, исследование с антителами к: д — MLH1; е — MSH2; ж — MSH6; з — PMS2; а—з — ×10.

Таблица 1. Характеристики выборки пациентов

Особый интерес представляла пациентка, у которой опухоль имела высокий уровень микросателлитной нестабильности. На момент обращения у нее были выявлены метастазы в подмышечных лимфатических узлах, позитивный PD-L1-статус и достаточно высокий уровень TILs (40%). Однако в процессе лечения размеры очага значительно сократились, и остаточная опухолевая нагрузка классифицировалась как RCBII.

Двухлетняя выживаемость больных составила 87,5%, при этом следует отметить, что медиана выживаемости не была достигнута ни в исследуемой выборке, ни при разделении на группы по статусам PD-L1 и MSI. Графики выживаемости представлены на рис. 3.

Рис. 3. Кривые общей и безрецидивной выживаемости.

а — безрецидивная выживаемость пациенток с позитивным и негативным статусом PD-L1; б — безрецидивная выживаемость пациенток с наличием или отсутствием микросателлитной нестабильности; в — общая выживаемость пациенток с позитивным и негативным статусом PD-L1; г — общая выживаемость пациенток с наличием или отсутствием микросателлитной нестабильности.

Малая выборка накладывает определенные ограничения и, хотя рейтинг общей выживаемости у пациенток с наличием микросателлитной нестабильности составил всего 75% (3/4), при оценке кривых видно, что продолжительность жизни у них выше. Необходимо также уточнить, что умершая больная обратилась за медицинской помощью на стадии заболевания IIIB в отличие от других пациенток с микросателлитной нестабильностью, размеры первичной опухоли у которых не превышали 21 мм.

Обсуждение

Методика оценки экспрессии PD-L1 выявила значительно большее количество позитивных случаев, которые потенциально могут отреагировать на иммунотерапевтическое лечение, чем иммуногистохимический метод оценки микросателлитной нестабильности (35,0% против 12,9%). Более того, в группе тройного негативного рака молочной железы частота выявляемости PD-L1-позитивных случаев достигла 38,71%, что приближается к данным, полученным при тестировании на большой выборке [9].

Пока в литературе имеются результаты единичных крупных исследований феномена микросателлитной нестабильности в раке молочной железы. N. Fusco и соавт. [10] на примере 444 опухолей молочной железы продемонстрировали встречаемость этого явления в 16,9% случаев. При этом в тройном негативном раке отмечена самая высокая частота этого события — 20,5%. В нашем исследовании также 3 из 4 опухолей имели тройной негативный подтип, более того, это составило 12,9% выборки тройных негативных карцином. Важно отметить, что N. Fusco и соавт. использовали методику создания тканевых матриц, что вносит погрешность в исследование из-за нередко встречающейся гетерогенности опухоли.

Китайские коллеги проанализировали 151 опухоль молочной железы с различными молекулярно-биологическими подтипами при помощи ДНК-секвенирования. В процессе этого исследования высокая микросателлитная нестабильнось также оказалась крайне редким событием (0,66%), однако дефицит системы репарации ДНК по другим позициям был установлен в 6,62% случаев. В этой работе сравнение с иммуногистохимическим выявлением микросателлитной нестабильности не проводилось [11].

Интересные данные получены этими авторами касательно выживаемости пациенток с высокой микросателлитной нестабильностью: для опухолей с люминальным B подтипом наличие микросателлитной нестабильности оказалось достоверным фактором неблагоприятного прогноза, в то время как для тройных негативных раков наоборот [11]. Удалось выявить несколько случаев с MSI, но все они оказались тройными негативными, при этом выживаемость пациенток была лучше по сравнению с пациентками с MSS. Факт позднего обращения единственной умершей пациентки говорит о невозможности считать микросателлитную нестабильность независимым фактором прогноза.

Существует большое количество статей по оценке статуса PD-L1 как прогностического фактора при раке молочной железы. Например, S. Muenst и Z. Li и соавт. [12, 13] считают, что экспрессия PD-L1 является негативным фактором. В то же время R. Beckers и соавт. [14] пришли к выводу, что мембранное окрашивание PD-L1 не коррелирует с выживаемостью пациенток с тройным негативным раком молочной железы. N. AiErken и A. Kim и соавт. [15, 16] высказывают мнение о лучшей безрецидивной и общей выживаемости таких пациентов. Наше исследование поддерживает позицию последних авторов.

Заключение

В проведенном исследовании обнаружено наличие позитивного PD-L1-статуса опухоли в 35% случаев, а выпадение экспрессии маркеров микросателлитной нестабильности в 10%. Наличие MSI-H отмечено только в PD-L1-позитивном образце.

Первый сравнительный анализ экспрессии PD-L1 и иммуногистохимических маркеров MSI, проведенный на малой выборке, не позволяет сделать однозначных выводов, но показывает необходимость изучения этого феномена на больших выборках и с использованием генетических методов.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Г.А. Франк

Сбор и обработка материала — М.И. Виноградов, О.А. Кузнецова

Статистическая обработка — О.А. Кузнецова

Написание текста — Л.Э. Завалишина, Ю.Ю. Андреева

Редактирование — М.В. Шомова, Ю.Ю. Андреева

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.