Вирус Эпштейна—Барр (EBV) является членом семейства Herpesviridae. Считается, что им в латентной форме инфицировано более 90% взрослого населения во всем мире [1]. EBV-ассоциированная аденокарцинома желудка выделена в качестве отдельного молекулярного подтипа, который составляет 9% среди всех форм рака желудка и характеризуется высокой частотой мутаций гена PIK3CA, высоким уровнем метилирования ДНК, амплификацией гена JAK2 и генов PD-L1/PD-L2 [2]. Показано, что EBV-ассоциированный рак желудка имеет лучший прогноз по сравнению с EBV-негативными формами, хотя основные механизмы подобного различия неясны [3].
Выделена группа LMP-1-негативных опухолей с экспрессией LMP-1 в железистом эпителии перитуморальной области [4], что может свидетельствовать о персистенции вирусных антигенов.
Персистенция вирусных антигенов, одними из проявлений которой являются особенности иммунного ответа, выражается в том числе и в изменении клеточного состава иммунного микроокружения. Большинство EBV-ассоциированных опухолей имеет лимфоидное происхождение и развивается у пациентов с иммунодефицитом вследствие потери контроля иммунной системы над репликацией EBV [5, 6]. Другие EBV-ассоциированные эпителиальные опухоли, такие как назофарингеальная карцинома и рак желудка, развиваются в подавляющем большинстве случаев у пациентов без признаков иммуносупрессии [7]. Неясно, имеются ли нарушения EBV-специфического Т-клеточного иммунного ответа у пациентов с EBV-ассоциированными злокачественными новообразованиями, которые не связаны с иммунодефицитом [5, 6].
Иммунное микроокружение EBV-ассоциированного рака желудка изучено недостаточно. J. Ma и соавт. [8] показали, что плотность инфильтрации ткани опухоли лимфоцитами CD8+ и Foxp3+ значительно выше таковой по сравнению с EBV-негативными формами рака желудка и ассоциирована с лучшей общей 5-летней выживаемостью пациентов [8].
Не изучены популяции опухолеассоциированных макрофагов, дендритных клеток и других, отсутствуют данные об оценке иммунного микроокружения в слизистой оболочке перитуморальной области, в котором может наблюдаться персистенция вирусных антигенов, поэтому целью нашего исследования является установление связей между персистенцией вирусных антигенов EBV и клеточным составом иммунного микроокружения опухолевой ткани и слизистой оболочки перитуморальной области при раке желудка.
Материал и методы
В исследовании использованы образцы операционного материала от 55 пациентов с верифицированным диагнозом рака желудка. Средний возраст пациентов составил 62 года (минимальный — 25 лет; максимальный — 84 года). Важным критерием отбора парафиновых блоков было наличие в одном кусочке (образце) участков рака желудка и окружающей ткани перитуморальной области.
Каждый образец окрашивали гематоксилином и эозином и определяли экспрессию CD4 (использовали клоны фирмы Dako, Дания) (клон 4В12), CD8 (клон C8/144В), CD68 (клон PG-M1), CD1a (клон O10с) и LMP-1 (клон CS1-4). Постановку иммуногистохимических реакций осуществляли с помощью иммуностейнера Autostainer 480S (Thermo Fisher Scientific, США).
Результаты реакций оценивали морфометрическим методом, основой для разработки которого послужили рекомендации International Immunooncology Biomarkers Working Group [9]. В опухолевой ткани и в участках перитуморальной области выбирали по 3 участка микропрепарата, в которых при увеличении объектива в 20 раз подсчитывали абсолютное число клеток с положительным окрашиванием с дальнейшим подсчетом среднего числа клеток и медианы в трех полях зрения с использованием светового микроскопа DM2500 (Leica Microsystems, Германия).
Полученные результаты были сопоставлены с основными клинико-морфологическими характеристиками рака желудка. Прогностическую значимость изучаемых признаков оценивали по общей 5-летней выживаемости пациентов.
Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием дисперсионного анализа, непараметрических критериев для парного и множественного сравнения, анализа выживаемости по Каплану—Майеру логрангового критерия, многофакторного анализа выживаемости в регрессионной модели пропорциональных рисков Кокса (Statistica 10, StatSoft, Inc., США).
Результаты и обсуждение
При идентификации вирусного антигена LMP-1 получено следующее распределение:
— LMP-1-позитивные опухоли — 9 случаев;
— LMP-1-негативные опухоли — 22 случая;
— LMP-1-негативные опухоли с экспрессией LMP-1 в эпителии перитуморальной области — 24 случая.
Анализ характеристик иммунного микроокружения проводили в разрезе этих 3 групп отдельно в центральной части опухолевой ткани и в участках перитуморальной области, сводные результаты представлены в табл. 1.
Таблица 1. Показатели плотности инфильтрации основными популяциями иммунных клеток (среднее число клеток в трех полях зрения при об. х20 ± стандартное отклонение) при персистенции вирусного антигена LMP-1
| Популяция клеток | Локализация | LMP-1-негативные опухоли с экспрессией LMP-1 в эпителии перитуморальной области | LMP-1-позитивные опухоли | LMP-1-негативные опухоли | p |
| CD4+ | Центральная часть опухоли | 48,48±44,77 | 36,33±26,28 | 41,86±31,86 | 0,9316 |
| Перитуморальная область | 30,92±23,38 | 17,63±18,91 | 25,03±37,43 | 0,0792 | |
| CD8+ | Центральная часть опухоли | 102,15±66,30 | 110,83±60,05 | 104,64±97,15 | 0,6463 |
| Перитуморальная область | 100,48±54,72 | 62,71±58,32 | 48,71±59,36 | 0,0190 | |
| CD68+ | Центральная часть опухоли | 88,78±56,39 | 103,33±27,96 | 117,45±67,50 | 0,3221 |
| Перитуморальная область | 65,28±47,90 | 45,63±41,04 | 38,13±45,33 | 0,2492 | |
| CD1a+ | Центральная часть опухоли | 7,78±7,91 | 15,83±12,11 | 15,87±18,30 | 0,0813 |
| Перитуморальная область | 4,67±6,75 | 3,25±3,88 | 2,03±2,69 | 0,1503 |
LMP-1-негативные опухоли с экспрессией LMP-1 в эпителии перитуморальной области характеризовались наибольшей плотностью инфильтрации CD4+ лимфоцитами в центральной части опухоли (среднее число клеток 48,48 (см. табл. 1; рис. 1, а; рис. 2, а); p=0,9316) и в слизистой оболочке перитуморальной области (среднее число клеток 30,92 (см. табл. 1; рис. 1, б; рис. 2, б); p=0,0792).
Рис. 1. Плотность инфильтрации CD4+ и CD8+ лимфоцитами, макрофагами и дендритными антиген-презентирующими клетками при персистенции вирусного антигена LMP-1.
а — CD4+ лимфоциты; подсчет в центральной части опухолевой ткани; б — CD4+ лимфоциты; подсчет в участках перитуморальной области; в — CD8+ лимфоциты; подсчет в центральной части опухолевой ткани; г — CD8+ лимфоциты; подсчет в участках перитуморальной области; д — макрофаги (CD68+); подсчет в центральной части опухолевой ткани; е — макрофаги (CD68+); подсчет в участках перитуморальной области; ж — дендритные антиген-презентирующие клетки (CD1а+); подсчет в центральной части опухолевой ткани; з — дендритные антиген-презентирующие клетки (CD1а+); подсчет в участках перитуморальной области; LMP-1–/перитум. обл.+ — LMP-1-негативные опухоли с экспрессией LMP-1 в эпителии перитуморальной области; LMP-1– — LMP-1-негативные опухоли; LMP-1+ — LMP-1-позитивные опухоли.
Рис. 2. Инфильтрация CD4+ и CD8+ лимфоцитами, макрофагами и дендритными клетками опухолевой ткани и слизистой оболочки перитуморальной области.
а — инфильтрация CD4+ лимфоцитами стромы высокодифференцированной аденокарциномы желудка; б — инфильтрация CD4+ лимфоцитами собственной пластинки слизистой оболочки перитуморальной области; в — инфильтрация CD8+ лимфоцитами стромы низкодифференцировнной аденокарциномы желудка; г — инфильтрация CD8+ лимфоцитами собственной пластинки слизистой оболочки перитуморальной области; д — макрофаги (CD68+) в строме умеренно-дифференцированной аденокарциномы желудка; е — макрофаги (CD68+) в собственной пластинке слизистой оболочки перитуморальной области; ж — единичные дендритные клетки (CD1а+) в строме умеренно-дифференцированной аденокарциномы желудка; з — единичные дендритные клетки (CD1а+) в собственной пластинке слизистой оболочки перитуморальной области. а, б — иммуногистохимическое окрашивание с антителами к CD4, об. ×20; в, г — иммуногистохимическое окрашивание с антителами к CD8, об. ×20; д, е — иммуногистохимическое окрашивание с антителами к CD68, об. ×20; ж, з — иммуногистохимическое окрашивание с антителами к CD1a, об. ×20.
Известно, что опухоли, экспрессирующие транскрипты вируса Эпштейна—Барр, являются в высокой степени иммуногенными [10]. Возможно, и эпителий перитуморальной области, экспрессирующий вирусные антигены, также может быть высокоиммуногенным.
LMP-1-негативные опухоли с экспрессией LMP-1 в эпителии перитуморальной области характеризовались средней плотностью инфильтрации CD8+ лимфоцитами в центральной части опухоли — 102,15 клетки (см. табл. 1; рис. 1, в; рис. 2, в) и наибольшей плотностью инфильтрации CD8+ лимфоцитами в слизистой оболочке перитуморальной области с высоким уровнем значимости (среднее число клеток 100,48 (см. табл. 1; рис. 1, г; рис. 2, г); p=0,0190); средней плотностью инфильтрации макрофагами в центральной части опухоли — 88,78 клетки (см. табл. 1; рис. 1, д; рис. 2, д) и наибольшей плотностью инфильтрации макрофагами в слизистой оболочке перитуморальной области (среднее число клеток 65,28 (см. табл. 1; рис. 1, е; рис. 2, е); p=0,2492); средней плотностью инфильтрации дендритными антиген-презентирующими клетками (CD1a+) в центральной части опухоли — 7,78 клетки (см. табл. 1; рис. 1, ж; рис. 2, ж) и наибольшей плотностью инфильтрации CD1a+ клетками в слизистой оболочке перитуморальной области (среднее число клеток 4,67 (см. табл. 1; рис. 1, з; рис. 2, з); p=0,1503).
В LMP-1-позитивных опухолях наблюдалась наибольшая плотность инфильтрации CD8+ лимфоцитами в центральной части опухоли (среднее число клеток 110,83; p=0,6463).
Наибольшая плотность инфильтрации CD1a+ клетками была характерна для LMP-1-позитивных и LMP-1-негативных опухолей (среднее число клеток 15,83 и 15,87 соответственно). Данное различие характеризуется тенденцией к статистической значимости (p=0,0813).
Также наибольшая плотность инфильтрации макрофагами наблюдалась и у LMP-1-негативных опухолей (среднее число клеток 117,45; p=0,3221).
Полученные данные по инфильтрации CD1a+ клетками противоречат факту того, что плотность инфильтрации дендритными клетками отражает степень концентрации чужеродных антигенов в ткани, так как именно эта популяция клеток является основным активатором ответа в противоопухолевом иммунитете. Однако низкую плотность инфильтрации CD1a+ клетками в центральной части LMP-1-негативных опухолей с экспрессией LMP-1 в эпителии перитуморальной области можно объяснить тем, что в данной группе опухолей железистный эпителий, экспрессирующий вирусный антиген LMP-1, может стать еще большим стимулом для дендритных клеток, чем опухолевая ткань, не несущая вирусных антигенов.
Известно, что EBV-позитивные формы рака желудка характеризуются лучшей выживаемостью по сравнению с другими подтипами рака желудка [3], однако точные механизмы, объясняющие эту особенность EBV-позитивных опухолей желудка, неизвестны. Предполагается, что лучшая выживаемость связана с высокой иммуногенностью EBV-позитивных опухолей. В связи с этим мы выполнили анализ общей 5-летней выживаемости пациентов в разрезе LMP-1-позитивных, LMP-1-негативных и LMP-1-негативных опухолей с экспрессией LMP-1 в эпителии перитуморальной области для установления связи феномена персистенции вирусных антигенов с прогностическими свойствами опухолей.
В ходе анализа общей 5-летней выживаемости пациентов по Каплану—Майеру (рис. 3) установлено, что пациенты с LMP-1-негативными опухолями и экспрессией LMP-1 в эпителии перитуморальной области имеют худшую 5-летнюю выживаемость (медиана выживаемости составляет 23 мес) по сравнению с двумя другими группами пациентов, однако данное различие не является статистически значимым: уровень значимости в соответствии с критерием χ2 составляет p=0,5637.
Рис. 3. Анализ общей 5-летней выживаемости пациентов по Каплану—Майеру при персистенции вирусного антигена LMP-1.
В нашем предыдущем исследовании установлено, что группа LMP-1-негативных опухолей с экспрессией LMP-1 в перитуморальной области практически всегда представлена аденокарциномами желудка «промежуточного» типа в соответствии с классификацией P. Lauren (в модификации классификации ВОЗ, 2001), а следовательно эту группу составляют низкодифференцированные аденокарциномы, в том числе с наличием перстневидных клеток. Подобные гистологические характеристики могут косвенно объяснить, что именно LMP-1-негативные опухоли с экспрессией LMP-1 в перитуморальной области характеризуются худшей общей 5-летней выживаемостью.
Сводные результаты многофакторного анализа общей 5-летней выживаемости пациентов представлены в табл. 2.
Таблица 2. Прогностическая значимость феномена персистенции вирусного антигена LMP-1 в сравнении с классическими клинико-морфологическими характеристиками рака желудка
| Параметр | Уровень значимости (p) | Risk ratio (RR) | Нижняя граница доверительного интервала RR (5%) | Верхняя граница доверительного интервала RR (95%) |
| Степень дифференцировки, G | 0,4936 | 0,6885 | 0,2366 | 2,004 |
| Стадия опухолевого процесса | <0,0001 | 1,6428 | 1,2065 | 2,8689 |
| Гистологический тип по классификации P. Lauren | 0,2128 | 0,5915 | 0,2589 | 1,3511 |
| Эмболы в лимфатических сосудах | 0,0435 | 1,7800 | 1,3340 | 3,9514 |
| Эмболы в кровеносных сосудах | 0,1997 | 0,3865 | 0,0904 | 1,6526 |
| Локализация экспрессии белка LMP-1 | 0,0885 | 1,7718 | 0,9175 | 3,4212 |
| Плотность инфильтрации CD4+ клетками в центральной части опухоли | 0,0349 | 0,9787 | 0,9593 | 0,9985 |
| Плотность инфильтрации CD8+ клетками в центральной части опухоли | 0,0173 | 1,0135 | 1,0024 | 1,0247 |
| Плотность инфильтрации CD68+ клетками в центральной части опухоли | 0,0044 | 0,9769 | 0,9613 | 0,9927 |
| Плотность инфильтрации CD1а+ клетками в центральной части опухоли | 0,3985 | 0,9791 | 0,9322 | 1,0283 |
| Плотность инфильтрации CD4+ клетками в участках перитуморальной области | 0,0094 | 1,5357 | 1,1987 | 2,7880 |
| Плотность инфильтрации CD8+ клетками в участках перитуморальной области | 0,3837 | 0,9932 | 0,9781 | 1,0086 |
| Плотность инфильтрации CD68+ клетками в участках перитуморальной области | 0,0267 | 0,9844 | 0,9709 | 0,9982 |
| Плотность инфильтрации CD1а+ клетками в участках перитуморальной области | 0,2626 | 0,9252 | 0,8075 | 1,0600 |
Установлено, что персистенция вирусного антигена LMP-1 в железистом эпителии перитуморальной области в данной выборке не имеет статистически значимого влияния на прогноз заболевания (соотношение рисков RR=1,7718; уровень значимости p=0,0885), однако отмечается тенденция в сторону отрицательной прогностической значимости.
Также персистенция вирусного антигена LMP-1 сопровождается выраженной инфильтрацией CD4+ лимфоцитами, что подтверждают результаты многофакторного анализа выживаемости (соотношение рисков для плотности инфильтрации CD4+ клетками в участках перитуморальной области RR=1,5357; уровень значимости p=0,0094). Плотность инфильтрации CD4+ лимфоцитами в участках перитуморальной области имеет выраженное отрицательное прогностическое значение, сопоставимое со стадией опухолевого процесса, а следовательно эта характеристика иммунного микроокружения рака желудка является новым независимым отрицательным прогностическим фактором.
Заключение
Установлено, что LMP-1-негативные опухоли с экспрессией LMP-1 в эпителии перитуморальной области характеризуются наибольшей плотностью инфильтрации железистного эпителия лимфоцитами CD4+ и CD8+, что наиболее вероятно связано с активацией клеточного иммунного ответа и может являться одним из признаков персистенции вирусных антигенов. Характеристики клеточного иммунного ответа (инфильтрата) в большей степени определяются персистенцией вирусных антигенов, нежели опухолевыми антигенами.
Впервые показано, что у пациентов с LMP-1-негативными опухолями с экспрессией LMP-1 в эпителии перитуморальной области отмечается худшая 5-летняя выживаемость по сравнению с двумя другими группами пациентов. Феномен персистенции вирусного антигена LMP-1 в данной выборке не имеет статистически значимого влияния на прогноз заболевания, однако отмечается тенденция в сторону отрицательной прогностической значимости.
Финансирование. Исследование выполнено при поддержке гранта Российского научного фонда №20-75-00037 и с использованием оборудования, приобретенного по программе развития МГУ имени М.В. Ломоносова до 2020 г.
Участие авторов:
Концепция и дизайн исследования — Н.В. Данилова, И.А. Михайлов, Н.А. Олейникова, П.Г. Мальков
Сбор и обработка материала — Н.В. Данилова, Н.А. Олейникова, П.Г. Мальков, А.В. Чайка, В.М. Хомяков, В.В. Какоткин, М.Ю. Юдин
Статистическая обработка данных — И.А. Михайлов
Написание текста — И.А. Михайлов, Н.В. Данилова, Н.А. Олейникова
Редактирование — П.Г. Мальков, А.В. Чайка, В.М. Хомяков
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.