Кадгерины — семейство трансмембранных или мембраносвязанных гликопротеинов, обеспечивающих специфическую кальцийзависимую адгезию клеток [1]. Кадгерины входят в состав межклеточных контактов и играют важную роль в морфогенезе многих тканей и органов [2—4]. Данное семейство включает 5 подсемейств: классические кадгерины 1-го типа, кадгерины 2-го типа, кадгерины десмосом (десмоколлины и десмоглеины), протокадгерины и кадгеринсвязанные белки [5, 6].
Е-кадгерин (эпителиальный кадгерин, кадгерин-1) относится к классическим кадгеринам и получил префикс Е (epithelial), поскольку обнаруживается в эпителиальных клетках в отличие от N-кадгерина (определяется в нервных клетках) и Р-кадгерина (выявляется в плаценте) [7]. Е-кадгерин кодируется геном CDH1; он включает в себя внеклеточный, трансмембранный и внутриклеточный домены [8]. Внутриклеточный домен связывает β-катенин и αЕ-катенин с образованием Е-кадгерин/β-катенин/αЕ-катенинового комплекса, известного как ССС-комплекс [9—13]. ССС-комплекс динамически связан с актиновым цитоскелетом и принимает участие в поддержании полярности, регулировке подвижности и пролиферации эпителиальных клеток [14—17].
Большинство авторов подчеркивают существенную роль Е-кадгерина в канцерогенезе в качестве опухолевого супрессора [18—21]. Как показано в экспериментальных исследованиях, снижение функции Е-кадгерина связано с приобретением клетками мезенхимального фенотипа, усилением миграции, инвазивных свойств [22—25], способности к метастазированию [23, 26, 27].
Помимо функции опухолевого супрессора обсуждаются и другие возможные механизмы участия Е-кадгерина в прогрессии опухолей. На моделях воспалительной карциномы молочной железы показана важная роль Е-кадгерина в интравазации клеток опухоли, поддержании целостности опухолевых эмболов и дальнейшем метастазировании [28, 29]. Опухолевые эмболы — это не просто случайные конгломераты опухолевых клеток, их биология гораздо сложнее, чем предполагалось ранее. Клетки опухолевых эмболов не чувствительны к системной химиотерапии и при этом сохраняют жизнеспособность, что обеспечивает реализацию опухолевого метастазирования. Данные характеристики реализуются в опухолевых эмболах посредством гиперэкспрессии Е-кадгерина, обеспечивающего формирование межклеточных контактов. В исследовании J. Tomlinson и соавт. [30—33] на ксенографтной модели MARY-X воспалительной карциномы молочной железы показано, что Е-кадгерин гиперэкспрессируется в опухолевых эмболах, обеспечивая существование компактных опухолевых структур, подобных клеточным сфероидам. Опухолевые эмболы в этой модели не способны связываться с эндотелиальными клетками благодаря повышенной экспрессии sialyl-Lewis X/A-дефицитного муцина 1, который не может связываться с Е-селектином (основной молекулой адгезии эндотелиальных клеток) [30]. Сочетание гиперэкспрессии Е-кадгерина и неспособности эмболов к адгезии на эндотелиальных клетках облегчает пассивную диссеминацию эмболов. Таким образом, Е-кадгерин может выполнять функцию промотора опухолевой диссеминации [34].
Описанные свойства Е-кадгерина продемонстрированы на ксенографтной модели рака молочной железы [33], культуре клеток плоскоклеточного рака (HSC-3) и клеток саркомы Юинга [35, 36], однако подобных данных для рака желудка в литературе нет. Хотя известно, что в спорадическом диффузном/смешанном раке желудка соматические мутации, вызывающие отсутствие или аномальную экспрессию Е-кадгерина, встречаются в 20—60% случаев [37—40].
Цель работы — определить уровень экспрессии Е-кадгерина в опухолевых эмболах при раке желудка, сравнить его с уровнем экспрессии в опухоли, установить зависимость экспрессии Е-кадгерина в опухолевых эмболах от клинико-морфологических характеристик рака желудка.
Материал и методы
В исследовании использованы образцы операционного материала от 280 пациентов с верифицированным диагнозом рака желудка, не получавших в предоперационном периоде химиотерапию или лучевую терапию.
Каждый образец окрашивали гематоксилином и эозином, а также определяли экспрессию Е-кадгерина (использовали клон NCH-38 Dako/Agilent Technologies, США). Постановку иммуногистохимических реакций осуществляли с помощью системы детекции UltraVision Quanto (Thermo Fisher Scientific, США) в иммуностейнере Autostainer 480S (Thermo Fisher Scientific, США). В сомнительных случаях для подтверждения наличия эмболов именно в лимфатических сосудах использовали двойную систему детекции (Double Stain IHC Kit: M&R on human tissue (DAB&AP/Red, Abcam ab210059) с антителами к Е-кадгерину (мышиные, клон NCH-38 Dako/Agilent Technologies, США, окрашивание в коричневый цвет) и подопланину (кроличьи, Abcam, клон EPR22182, Abcam, Великобритания, окрашивание в красный цвет).
Результаты реакций в опухолевых клетках и эмболах оценивали полуколичественным методом по N. Setia и соавт. [41] с использованием светового микроскопа DM2500 (Leica Microsystems, Германия). Методика оценки экспрессии подразумевала разделение случаев на 4 категории: 0 — экспрессия отсутствует; 0,33 — экспрессия слабая, определяется в виде отдельных глыбок в цитоплазме клеток; 0,66 — умеренная или выраженная экспрессия, локализующаяся в цитоплазме клеток и на мембране; 0,99 — умеренная или выраженная экспрессия, локализующаяся только на мембране клеток.
Полученные результаты были сопоставлены с основными клинико-морфологическими характеристиками рака желудка (гистологический тип по классификации ВОЗ, 2019 г., гистологический тип по классификации P. Lauren, клиническая стадия, глубина инвазии (Т), количество метастазов в лимфатических узлах (N), наличие/отсутствие отдаленных метастазов (М), локализация опухоли в желудке).
Статистическую обработку данных проводили с использованием программного пакета Statistica 10 (StatSoft, Inc., США). Для статистической обработки результатов использовали критерий Шапиро—Уилка для проверки гипотез о нормальном распределении полученных данных; анализ на основе таблиц сопряженности и критерий χ2 Пирсона.
Результаты и обсуждение
Среди 280 случаев рака в препаратах, окрашенных гематоксилином и эозином, наличие опухолевых эмболов в лимфатических сосудах отмечено в 137 наблюдениях. Однако в препаратах, окрашенных с помощью иммуногистохимического метода на Е-кадгерин, опухолевые эмболы были обнаружены лишь в 67 случаях, которые использованы для дальнейшего анализа. Остальные 70 случаев из анализа исключены, так как при дорезке иммуногистохимических препаратов эмболы в срезы не попали.
Распределение пациентов по полу и возрасту, а также по клиническим стадиям и гистологическим типам рака (классификация ВОЗ, 2019 г.) представлено в табл. 1.
Таблица 1. Половозрастные характеристики выборки пациентов, распределение по стадиям и гистологическим типам (классификация ВОЗ, 2019 г.)
| Возрастная группа, годы | Мужчины | Женщины | Итого |
| 35—40 | 0 | 1 | 1 |
| 41—50 | 5 | 0 | 5 |
| 51—60 | 14 | 7 | 21 |
| 61—70 | 13 | 13 | 26 |
| 71—80 | 7 | 5 | 12 |
| Старше 80 | 1 | 1 | 2 |
| Всего | 40 | 27 | 67 |
| Клиническая стадия | Мужчины | Женщины | Итого |
| IA | 2 | 2 | 4 |
| IB | 0 | 1 | 1 |
| IIA | 3 | 1 | 4 |
| IIB | 3 | 5 | 8 |
| IIIA | 6 | 3 | 9 |
| IIIB | 10 | 7 | 17 |
| IIIC | 11 | 3 | 14 |
| IV | 5 | 5 | 10 |
| Всего | 40 | 27 | 67 |
| Гистологический тип (ВОЗ, 2019 г.) | Мужчины | Женщины | Итого |
| Тубулярный | 22 | 16 | 38 |
| Дискогезивный | 9 | 8 | 17 |
| Смешанный | 9 | 3 | 12 |
| Всего | 40 | 27 | 67 |
В анализируемой группе, состоящей из 67 больных, подавляющее большинство составили пациенты от 51 года до 70 лет с III стадией заболевания и преимущественно тубулярным гистологическим типом опухоли.
Экспрессия Е-кадгерина в ткани опухоли (рис. 1) была распределена следующим образом: 0 — 1 (1,5%) случай, 0,33 — 14 (20,9%) случаев, 0,66 — 28 (41,8%) случаев, 0,99 — 24 (35,8%) случая. Таким образом, в подавляющем большинстве наблюдений раки желудка демонстрировали сохранение мембранной экспрессии Е-кадгерина, в том числе если речь идет о дискогезивных раках (мембранная и мембранно-цитоплазматическая экспрессия выявлена в 8 случаях из 17). С другой стороны, среди опухолей с низким уровнем экспрессии Е-кадгерина (0 и 0,33, так называемая аберрантная экспрессия) преобладали дискогезивные раки — 60% (9 случаев из 15). В группе с нормальной экспрессией Е-кадгерина (0,66 и 0,99) дискогезивные раки встречались значительно реже (15%, 8 случаев из 52). Распределение уровней экспрессии Е-кадгерина в опухоли и в опухолевых эмболах по основным клинико-морфологическим параметрам представлено в табл. 2.
Рис. 1. Экспрессия Е-кадгерина различной интенсивности в ткани рака желудка.
а — дискогезивная карцинома желудка; б — отсутствие экспрессии Е-кадгерина в клетках дискогезивной опухоли (0); в — дискогезивная карцинома желудка; г — слабая цитоплазматическая экспрессия Е-кадгерина в клетках дискогезивной опухоли (0,33); д — низкодифференцированная тубулярная карцинома желудка; е — умеренная цитоплазматическая и мембранная экспрессия Е-кадгерина в клетках тубулярной опухоли (0,66); ж — дискогезивная карцинома желудка; з — выраженная мембранная экспрессия Е-кадгерина в клетках дискогезивной опухоли (0,99).
а, в, д, ж — окраска гематоксилином и эозином, ×40; б, г, е, з — иммуногистохимическое окрашивание с антителами к E-кадгерину, ×40.
Fig. 1. E-cadherin expression in gastric cancer.
Таблица 2. Распределение уровня экспрессии Е-кадгерина в опухоли и в опухолевых эмболах в разрезе основных клинико-морфологических характеристик опухоли
| Клинико-морфологические свойства опухоли | Уровень экспрессии Е-кадгерина | ||||||||
| в ткани опухоли | в опухолевых эмболах | ||||||||
| 0 | 0,33 | 0,66 | 0,99 | 0 | 0,33 | 0,66 | 0,99 | ||
| Гистологический тип опухоли (ВОЗ, 2019 г.) | |||||||||
| Тубулярный | 1 | 0 | 2 | 17 | 19 | 0 | 0 | 5 | 33 |
| Дискогезивный | 2 | 0 | 9 | 7 | 1 | 0 | 0 | 6 | 11 |
| Смешанный | 3 | 1 | 3 | 4 | 4 | 0 | 1 | 0 | 11 |
| Глубина инвазии | |||||||||
| T1a/T1b | 4 | 0 | 0 | 1 | 3 | 0 | 0 | 0 | 4 |
| T2 | 5 | 0 | 0 | 0 | 4 | 0 | 0 | 0 | 4 |
| T3 | 6 | 0 | 2 | 4 | 3 | 0 | 0 | 2 | 7 |
| T4a | 7 | 1 | 11 | 21 | 12 | 0 | 1 | 9 | 35 |
| T4b | 8 | 0 | 1 | 2 | 2 | 0 | 0 | 0 | 5 |
| Наличие метастазов в регионарных лимфатических узлах | |||||||||
| N0 | 9 | 0 | 1 | 7 | 5 | 0 | 0 | 1 | 12 |
| N1 | 10 | 0 | 0 | 4 | 3 | 0 | 0 | 1 | 6 |
| N2 | 11 | 0 | 1 | 3 | 4 | 0 | 0 | 1 | 7 |
| N3a | 12 | 0 | 7 | 9 | 5 | 0 | 0 | 7 | 14 |
| N3b | 13 | 1 | 5 | 5 | 7 | 0 | 1 | 1 | 16 |
| Наличие отдаленных метастазов | |||||||||
| M0 | 14 | 1 | 11 | 24 | 21 | 0 | 1 | 8 | 48 |
| M1 | 15 | 0 | 3 | 4 | 3 | 0 | 0 | 3 | 7 |
| Клиническая стадия (AJCC, 8-е издание) | |||||||||
| Стадия: | |||||||||
| IA | 16 | 0 | 0 | 1 | 3 | 0 | 0 | 0 | 4 |
| IB | 17 | 0 | 0 | 0 | 1 | 0 | 0 | 0 | 1 |
| IIA | 18 | 0 | 0 | 3 | 1 | 0 | 0 | 0 | 4 |
| IIB | 19 | 0 | 1 | 4 | 3 | 0 | 0 | 1 | 7 |
| IIIA | 20 | 0 | 1 | 4 | 4 | 0 | 0 | 2 | 7 |
| IIIB | 21 | 0 | 5 | 9 | 3 | 0 | 0 | 5 | 12 |
| IIIC | 22 | 1 | 4 | 3 | 6 | 0 | 1 | 0 | 13 |
| IV | 23 | 0 | 3 | 4 | 3 | 0 | 0 | 3 | 7 |
| Локализация опухоли желудка | |||||||||
| Верхняя треть | 24 | 0 | 3 | 4 | 7 | 0 | 0 | 2 | 12 |
| Средняя треть | 25 | 0 | 8 | 14 | 10 | 0 | 0 | 7 | 25 |
| Нижняя треть | 26 | 0 | 1 | 6 | 6 | 0 | 0 | 2 | 11 |
| Субтотальная | 27 | 1 | 2 | 4 | 1 | 0 | 1 | 0 | 7 |
| Тип опухоли по P. Lauren | |||||||||
| Кишечный | 28 | 0 | 0 | 2 | 15 | 0 | 0 | 1 | 16 |
| Диффузный | 29 | 0 | 9 | 7 | 1 | 0 | 0 | 6 | 11 |
| Промежуточный | 30 | 1 | 5 | 19 | 8 | 0 | 1 | 4 | 28 |
Во всей выборке в опухолевых эмболах экспрессия Е-кадгерина была значимо выше (p<0,001), чем в опухолевой ткани: 0,33 — 1 (1,5%) случай, 0,66 — 11 (16,4%) случаев, 0,99 — 55 (82,1%) случаев (рис. 2, рис. 3а). При этом не выявлено ни одного случая, где уровень экспрессии Е-кадгерина снижался в эмболах по сравнению с опухолью: в 59,7% случаев наблюдалось увеличение экспрессии Е-кадгерина, а в 40,3% случаев уровень экспрессии в опухоли был идентичен таковому в эмболах. Во всех 40,3% случаев выявлялись варианты нормальной, а не аберрантной экспрессии Е-кадгерина (0,66 и 0,99). Только в одном наблюдении экспрессия Е-кадгерина в эмболах отмечена на уровне 0,33, однако в этом материале реакция в опухолевых клетках отсутствовала полностью.
Рис. 2. Экспрессия Е-кадгерина различной интенсивности в опухолевых эмболах при раке желудка.
а — слабая цитоплазматическая экспрессия Е-кадгерина в клетках опухолевого эмбола (0,33); б — умеренная цитоплазматическая и мембранная экспрессия Е-кадгерина в клетках опухолевого эмбола (0,66); в — выраженная мембранная экспрессия Е-кадгерина в клетках опухолевого эмбола (0,99); г — выраженная мембранная экспрессия Е-кадгерина в клетках опухолевого эмбола, положительная экспрессия подопланина в эндотелии лимфатического сосуда.
а, б, в — иммуногистохимическое окрашивание с антителами к E-кадгерину, ×40; г — двойное иммуногистохимическое окрашивание с антителами к E-кадгерину (коричневый цвет) и подопланину (красный цвет), ×40.
Fig. 2. E-cadherin expression in tumor emboli.
Рис. 3. Сравнение экспрессии Е-кадгерина в ткани рака желудка и в опухолевых эмболах в контексте различных клинико-морфологических параметров.
а — распределение уровня экспрессии Е-кадгерина в ткани первичной опухоли и в эмболах; б — распределение уровня экспрессии Е-кадгерина в ткани первичной опухоли и в эмболах согласно классификации P. Lauren; в — распределение уровня экспрессии Е-кадгерина в ткани первичной опухоли и в эмболах различных гистологических типов согласно классификации ВОЗ, 2019 г.; г — распределение уровня экспрессии Е-кадгерина в ткани первичной опухоли и в эмболах в зависимости от наличия метастазов в регионарных лимфатических узлах.
Fig. 3. Comparison of E-cadherin expression in gastric cancer tissue and in tumor emboli depending by clinical and morphological characteristics of gastric cancer
Значимое повышение экспрессии Е-кадгерина в опухолевых эмболах по сравнению с первичной опухолью отмечено для всех гистологических типов (ВОЗ, 2019 г.): тубулярного (p=0,003), смешанного (p=0,026), дискогезивного (p<0,001), для промежуточного и диффузного типов по классификации P. Lauren (p<0,001) (рис. 3б, 3в). Сравнение экспрессии в эмболах и в опухоли для новообразований, различающихся по глубине инвазии (Т), стадии и локализации, не выявило статистически значимых различий. Повышение экспрессии Е-кадгерина в эмболах по сравнению с опухолями характеризовалось более высоким уровнем значимости при наличии метастазов (N1, N2, N3a, N3b; p<0,001), чем при их отсутствии (N0; p=0,016) (рис. 3г).
При сравнении экспрессии Е-кадгерина между эмболами в контексте различных клинико-морфологических параметров значимые различия выявлены лишь между дискогезивным и смешанным типами (p=0,043). Однако в данном случае уровень значимости приближается к p=0,05 и полученная разница, скорее всего, обусловлена наличием в группе смешанных опухолей одного случая с уровнем экспрессии Е-кадгерина в эмболах 0,33. Этот выброс сделал возможным появление формального различия между группами, которое по своей сути не несет смысловой нагрузки. При сравнении экспрессии Е-кадгерина в эмболах в контексте других клинико-морфологических параметров значимых различий не обнаружено.
Таким образом, в опухолевых эмболах при раке желудка наблюдается значимое увеличение экспрессии Е-кадгерина по сравнению с первичной опухолью, даже в случаях с аберрантной экспрессией белка (0 и 0,33). Вероятно, в этих случаях снижение или отсутствие Е-кадгерина в опухоли обусловлено эпигенетическими механизмами (например, метилированием промотора гена CDH1). Это свидетельствует о том, что экспрессия маркера в опухоли не является константой и может быть отрегулирована самими опухолевыми клетками при необходимости.
Е-кадгерин не только играет роль в поддержании целостности опухолевого эмбола, но и обеспечивает жизнеспособность этих клеток. Экспериментально показано, что Е-кадгерин обеспечивает безъякорный рост (ancorage independent growth) в сфероидах культуры клеток плоскоклеточного рака ротовой полости (HSC-3) и клеток саркомы Юинга [35, 36], причем в последнем примере экспрессия Е-кадгерина увеличивалась при культивировании в условиях безъякорного роста. Безъякорный рост — способность клеток выживать и пролиферировать в отсутствие взаимодействия с внеклеточным матриксом — является одной из характеристик опухолевых клеток. При безъякорном росте сигналы от межклеточных взаимодействий подавляют аноикис (разновидность апоптоза, наступает в ответ на неправильную адгезию клеток с внеклеточным матриксом). Таким образом, Е-кадгерин поддерживает целостность опухолевых эмболов, жизнеспособность и рост опухолевых клеток, ингибирует апоптоз [42] и является важным функциональным звеном метастазирования при раке желудка.
Заключение
Впервые показано значимое увеличение экспрессии Е-кадгерина в опухолевых эмболах по сравнению с первичной опухолью желудка. Установлено, что наибольшее увеличение экспрессии Е-кадгерина в эмболах характерно для опухолей диффузного типа по классификации P. Lauren, а также для опухолей с наличием метастазов в регионарных лимфатических узлах, что доказывает важную роль Е-кадгерина в процессе метастатической диссеминации при раке желудка.
Финансирование
Исследование выполнено в рамках темы 07.08.006 Госзадания НИР МГУ им. М.В. Ломоносова.
Участие авторов:
Концепция и дизайн исследования — Н.В. Данилова
Сбор и обработка материала — Н.В. Данилова, Н.А. Олейникова
Статистическая обработка данных — И.А. Михайлов
Написание текста — Н.В. Данилова, Н.А. Олейникова
Редактирование — П.Г. Мальков
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
The authors declare no conflicts of interest.