EBV-ассоциированная аденокарцинома желудка выделяется многими исследователями в отдельный молекулярный подтип в связи с наличием в опухолевых клетках латентных форм EBV [1]. Идентификация кодируемых EBV малых вирусных РНК (Epstein-Barr virus-encoded small RNAs, EBER) методом гибридизации in situ (EBER-ISH), по мнению большинства авторов [2, 3], является золотым стандартом для установления ассоциации аденокарциономы желудка с EBV.

При использовании EBER-ISH подавляющее большинство опухолевых клеток EBV-ассоциированных аденокарцином желудка демонстрирует выраженную положительную реакцию [2]. Однако частота выявления EBV-ассоциированных аденокарцином желудка от общего числа аденокарцином желудка варьирует, по данным разных авторов, от 2 до 18%, что является довольно большим разбросом и, вероятно, зависит от расовых и популяционных характеристик исследуемой группы [4]. Известно, что частота выявления EBV-ассоциированных аденокарцином желудка в популяции Северной Америки составляет 9,9%, в азиатской популяции — 8,3%, в европейской — 9,2% [5]. Стоит отметить, что исследование распространенности EBV-ассоциированных аденокарцином желудка на выборках пациентов из Российской Федерации не проводилось.

Согласно исследованию TCGA, EBV обнаруживается в злокачественных эпителиальных клетках в 9% случаев рака желудка [6]. Помимо идентификации методом EBER-ISH авторы также использовали секвенирование мРНК и микроРНК. Результаты, полученные с помощью обоих методов, оказались идентичны. Также было установлено, что наиболее часто встречающимся типом генетических нарушений в клетках EBV-ассоциированных аденокарцином является множественное метилирование CpG-островков, что позволяет выделять эту группу опухолей в качестве отдельного молекулярного подтипа [6]. Более того, выявленные отличия между профилями метилирования EBV-ассоциированного подтипа и подтипа, ассоциированного с микросателлитной нестабильностью (MSI), также объясняют разницу между этими группами по мутационному профилю. EBV-ассоциированные опухоли имели более высокую распространенность гиперметилирования ДНК, чем любые виды рака, а именно гиперметилирование промотора гена CDKN2A, но не имели гиперметилирования MLH1, характерного для MSI-ассоциированного рака желудка [6]. Также для EBV-ассоциированных опухолей в 80% случаев характерны соматические мутации гена PIK3CA, в 55% случаев — гена ARID1A и в 23% — гена BCOR, однако при этом частота возникновения мутаций гена TP53 значительно ниже по сравнению с другими молекулярными подтипами [6].

Известно, что и EBV- и MSI-ассоциированные опухоли характеризуются высоким уровнем экспрессии PD-L1 и, следовательно, эффективно реагируют на иммунотерапию блокаторами PD-L1 [7]. Другой примечательной особенностью EBV-ассоциированного рака желудка является меньшая частота обнаружения метастазов в лимфатических узлах, но в то же время большая глубина инвазии слоев стенки желудка по сравнению с другими подтипами рака желудка на момент постановки диагноза [8]. У большинства пациентов с EBV-ассоциированным раком желудка диагностируется уже продвинутая стадия (в 52% случаев III и IV стадия) опухолевого процесса, и 49% пациентов умерли в течение среднего периода наблюдения, составившего 3 года [9]. Нескорректированный регрессионный анализ Кокса показал, что медиана выживаемости пациентов с EBV-ассоциированным раком желудка составляет 8,5 года, тогда как медиана выживаемости пациентов с EBV-негативными опухолями желудка — всего 5,3 года [9]. На этом основании считается, что прогноз и эффективность лечения пациентов с EBV-ассоциированным раком желудка более благоприятны [10, 11]. Однако вместе с тем многими авторами [2, 3, 9] поднимается вопрос о необходимости уточнения этих данных, поскольку они были получены в результате выполнения сетевого метаанализа путем сопоставления исследований, проведенных на разных популяциях с неодинаковыми исходными характеристиками, в том числе по соотношению в выборках различных клинических стадий.

Цель исследования — оценить частоту выявления EBV-аденокарцином желудка в выборке российских пациентов, а также уточнить клинико-морфологические характеристики и медианы выживаемости пациентов с EBV-ассоциированным раком желудка по сравнению с пациентами с EBV-негативными формами рака желудка.

Материал и методы

В исследовании были использованы образцы операционного материала от 282 пациентов с верифицированным диагнозом рака желудка. Средний возраст пациентов составил 63 года (минимальный 22 года; максимальный 84 года). Половозрастные характеристики выборки пациентов и распределение по стадиям опухолевого процесса представлены в табл. 1.

Таблица 1. Половозрастные характеристики выборки пациентов, распределение по стадиям опухолевого процесса

Каждый образец был окрашен методом гибридизации in situ с использованием праймеров к малым вирусным РНК вируса Эпштейна—Барр (INFORM EBER, Roche Ventana, США) и системы визуализации ISH iVIEW Blue Detection Kit (Roche Ventana, США). Постановка реакций гибридизации in situ осуществлялась с помощью прибора Ventana BenchMark Ultra (Roche Ventana, США).

Результаты реакций оценивали в соответствии с общепринятыми стандартами [12, 13]. Реакция считалась положительной, если сигнал EBER был локализован в ядре опухолевых клеток, но при этом отсутствовало цитоплазматическое окрашивание за исключением случаев митоза, при которых ядерная мембрана утрачивает свою целостность [12]. При каждой постановке реакции в обязательном порядке использовали положительный контроль в виде тканевого образца EBV-ассоциированной назофарингеальной карциномы.

Полученные результаты были сопоставлены с основными клинико-морфологическими характеристиками рака желудка. При сопоставлении результатов со степенью злокачественности по Классификации ВОЗ 2019 г. из анализа были исключены перстневидно-клеточные раки, так как в соответствии с этой классификацией степень злокачественности оценивается только для тубулярных и папиллярных аденокарцином желудка. Прогностическая значимость изучаемых признаков оценивалась по общей 5- и 8-летней выживаемости пациентов.

Статистическая обработка полученных данных проводилась с использованием анализа таблиц сопряженности, критерия хи-квадрат, непараметрических критериев для парного и множественного сравнений, анализа выживаемости по Каплану—Мейеру, логрангового критерия, многофакторного анализа выживаемости в регрессионной модели пропорциональных рисков Кокса (Statistica 10, StatSoft, Inc., США).

Результаты и обсуждение

По результатам идентификации EBER в опухолевых клетках из 282 исследованных случаев рака желудка 27 (9,57%) оказались EBER-положительными и 255 (90,43%) EBER-отрицательными (рис. 1). Таким образом, частота выявления EBV-ассоциированной аденокарциномы желудка в нашей выборке составила 9,57%.

Рис. 1. Экспрессия EBER в аденокарциномах желудка.

а, в — высокодифференцированные аденокарциномы желудка; б — отсутствие экспрессии EBER в опухоли; г — экспрессия EBER в опухоли. а, в — окраска гематоксилином и эозином, об. ×10; б, г — выявление EBER методом гибридизации in situ, об. ×10.

Полученное значение частоты выявления согласуется с данными, установленными при исследовании европейской популяции другими авторами [6].

При сопоставлении результатов с клинико-морфологическими характеристиками рака желудка, а именно с глубиной инвазии опухоли, установлено, что большинство EBER-положительных аденокарцином характеризовалось глубиной инвазии T4a и T4b — суммарно 16 случаев (табл. 2), однако это преобладание не являлось статистически значимым (p=0,752) по сравнению с группой EBER-отрицательных опухолей вследствие значительного преобладания в выборке случаев с глубиной инвазии T4a и T4b.

Таблица 2. Статистическая значимость различий по EBER-статусу в разрезе клинико-морфологических характеристик рака желудка

При сопоставлении результатов идентификации EBER с количеством метастазов в регионарных лимфатических узлах установлено, что EBER-положительные случаи были равномерно распределены среди всех групп опухолей: опухоли N0 — 9 случаев, N1 — 4, N2 — 7 и опухоли N3a-N3b — 7 случаев (см. табл. 2).

При сопоставлении результатов идентификации EBER с количеством отдаленных метастазов установлено, что большинство EBER-положительных опухолей — 24 случая (см. табл. 2) характеризовалось отсутствием отдаленных метастазов (M0), однако это преобладание не являлось статистически значимым (p=0,667) по сравнению с группой EBER-отрицательных опухолей.

Полученные результаты хорошо согласуются с имеющимися данными о том, что EBV-ассоциированные аденокарциномы желудка, как правило, имеют значительную глубину инвазии, но низкое количество метастазов в лимфатических узлах и отдаленных метастазов [8].

При сопоставлении результатов идентификации EBER со стадиями опухолевого процесса установлено, что большинство EBER-положительных опухолей относилось к группе со стадией III (см. табл. 2) — 15 (55,56%) случаев из 27, однако это преобладание не являлось статистически значимым (p=0,315) по сравнению с группой EBER-отрицательных опухолей.

Среди EBER-положительных опухолей в одинаковой степени встречались как опухоли с наличием эмболов в лимфатических сосудах — 11 случаев, так и с их отсутствием — 16 случаев (см. табл. 2). Однако в то же время среди EBER-положительных опухолей преобладали опухоли с отсутствием эмболов в кровеносных сосудах — 24 (88,87%) случая из 27, однако данное превосходство не являлось статистически значимым (p=0,499) по сравнению с группой EBER-отрицательных опухолей.

Установлено, что EBER-положительные опухоли значительно чаще (p=0,021) относятся к промежуточному типу по классификации P. Lauren (табл. 2, рис. 2, а) — 18 (66,67%) случаев из 27 в сравнении с EBER-отрицательными опухолями — 99 (38,82%) из 255. Эта выявленная характеристика EBER-положительных опухолей хорошо согласуется с тем фактом, что EBV-ассоциированные аденокарциномы желудка склонны к быстрой инвазии слоев стенки желудка до подслизистой основы [8].

Рис. 2. Выявленные различия аденокарцином желудка по EBER-статусу в зависимости от гистологического типа по P. Lauren (а) и степени злокачественности (б) (ВОЗ, 2019).

Также установлено, что EBER-положительные опухоли значительно чаще (p=0,035) относятся к опухолям с высокой степенью злокачественности (high grade) в соответствии с Классификацией ВОЗ 2019 г. (см. табл. 2, рис. 2, б) — 18 (75%) случаев из 24 в сравнении с EBER-отрицательными опухолями — 98 (52,13%) из 188.

В целях уточнения различий в выживаемости пациентов с EBER-положительными и EBER-отрицательными опухолями желудка были рассчитаны медианы выживаемости пациентов как для всей выборки, так и в разрезе по стадиям опухолевого процесса (табл. 3). Также был проведен анализ 5- и 8-летней выживаемости пациентов по Каплану—Мейеру.

Таблица 3. Медианы выживаемости пациентов в разрезе клинических стадий опухолевого процесса и EBER-статуса

Установлено, что общая медиана выживаемости всех пациентов с EBER-положительными опухолями (53,5 мес) была выше по сравнению с таковой всех пациентов с EBER-отрицательными опухолями — 36,5 мес (см. табл. 3). Анализ общей 5- и 8-летней выживаемости пациентов не выявил статистически значимых различий (рис. 3, а, б) — минимальное p-значение логрангового критерия составило 0,5379.

Рис. 3. Анализ выживаемости пациентов с раком желудка различных клинических стадий в зависимости от EBER-статуса (объяснение в тексте).

При проведении анализа выживаемости в разрезе отдельных стадий установлено, что медиана выживаемости пациентов с EBER-положительными опухолями I—II стадии составила 75,0 мес, что совпадает с медианой выживаемости пациентов с EBER-отрицательными опухолями I—II стадии (см. табл. 3). Анализ общей 5- и 8-летней выживаемости пациентов не выявил статистически значимых различий (рис. 3, в, г) — минимальное p-значение логрангового критерия составило 0,4799.

Медиана выживаемости пациентов с EBER-положительными опухолями III стадии (30,0 мес) была выше по сравнению с аналогичным показателем для пациентов с EBER-отрицательными опухолями — 20,0 мес (см. табл. 3). Однако анализ общей 5- и 8-летней выживаемости пациентов не выявил статистически значимых различий (рис. 3, д, е) — минимальное p-значение логрангового критерия составило 0,5622.

Выживаемость пациентов с EBER-положительной опухолью IV стадии (13,0 мес) также была незначительно выше по сравнению с аналогичным показателем для пациентов с EBER-отрицательными опухолями — 12,0 мес (см. табл. 3). Анализ общей 5-летней выживаемости пациентов не выявил статистически значимых различий (рис. 3, ж, з) — минимальное p-значение логрангового критерия составило 0,8006.

Дополнительно был проведен многофакторный анализ выживаемости в регрессионной модели пропорциональных рисков Кокса и установлено, что EBER-статус не является значимым прогностическим признаком (HR=1,0143; ДИ: 0,9897—1,0196). Это свидетельствует о том, что отдельно взятый EBER-статус не оказывает значимого влияния на прогноз у пациентов с раком желудка.

Заключение

Установлено, что EBER-положительные аденокарциномы желудка преимущественно являются опухолями промежуточного типа по классификации P. Lauren и опухолями high grade по Классификации ВОЗ 2019 г.

Не выявлены статистически значимые различия между пациентами с EBER-положительными и EBER-отрицательными опухолями как в общей выборке, так и по стадиям опухолевого процесса. Однако при этом пациенты с EBER-положительными опухолями III стадии характеризуются бо`льшими медианами выживаемости по сравнению с пациентами с EBER-отрицательными опухолями аналогичной стадии. Показано, что отдельно взятый EBER-статус не является значимым независимым прогностическим признаком и может рассматриваться только в совокупности с »классическими» клинико-морфологическими характеристиками, основная из которых — стадия опухолевого процесса, так как именно они в первую очередь определяют прогностические свойства опухоли.

Финансирование: Исследование выполнено при поддержке гранта Российского научного фонда №20-75-00037.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования – Н.В. Данилова, И.А. Михайлов, П.Г. Мальков

Сбор и обработка материала – Д.В. Калинин, А.В. Чайка, В.М. Хомяков, М.Ю.Юдин, В.В.Какоткин

Статистическая обработка данных – И.А. Михайлов, Д.В. Вычужанин

Написание текста – Н.В. Данилова, Н.А. Олейникова

Редактирование – Ю.Ю. Андреева, П.Г. Мальков