введение
В настоящее время нестероидные противовоспалительные препараты (НПВП) получили широкое распространение в клинической практике, при этом отмечается, что наиболее частым осложнением применения препаратов данной группы являются поражения слизистой оболочки желудка (СОЖ) — так называемые НПВП-гастропатии [1].
В патогенезе индуцированных НПВП поражений желудка важное место отводится блокаде биосинтеза простагландинов-цитопротекторов и ингибированию образования циклооксигеназы-1 [2]. Это приводит к ульцерогенному действию, которое выражается в нарушении трофики СОЖ, повышении секреции желудочного сока, уменьшении выработки желудочной слизи и, таким образом, смещении баланса агрессивность/защита в сторону повреждающих факторов [1]. Кроме того, происходит выраженная активация процессов свободнорадикального окисления [2, 3], развиваются дальнейшие метаболические нарушения. Одним из ключевых показателей интенсивности процессов свободнорадикального окисления является содержание малонового диальдегида (МДА), а состояние антиоксидантной системы оценивается по активности фермента супероксиддисмутазы (СОД) в сыворотке крови.
Отмечается, что изменения нормальной СОЖ от воспаления к атрофии и неоплазии относятся к общебиологическим процессам, зачастую не зависящим от причинного фактора [4]. Это обусловливает целесообразность применения препаратов разнонаправленного патогенетического действия, особенно с антиоксидантными свойствами, или средств метаболической терапии в лечении поражений СОЖ различного генеза [1, 5].
В научной литературе опубликованы данные, показывающие эффективность дипептида альфа-глутамил-триптофан в комплексной терапии обострений язвенной болезни желудка, в частности отмечено ускорение сроков рубцевания хронических язв на 10 дней, снижение сроков купирования болевого синдрома на 3,2 дня, сокращение продолжительности диспепсического синдрома на 4,2 дня [6]. Успешный опыт применения альфа-глутамил-триптофана обусловил целесообразность разработки на его основе лекарственного препарата для лечения атрофического гастрита («Регастим Гастро»), снижающего интенсивность клеточной воспалительной инфильтрации слизистой оболочки желудка, восстанавливающего кислотообразующую функцию желудка, улучшающего структуру желудочных желез и обладающего высоким спектром безопасности при гастрите, ассоциированном с Helicobacter pylori [7—9]. Однако остаются малоизученными эффекты альфа-глутамил-триптофана при воздействии других патогенных факторов на СОЖ.
Цель исследования — изучить влияние альфа-глутамил-триптофана на предотвращение и заживление язвенных поражений слизистой оболочки желудка в модели язвообразования при профилактическом и лечебном курсовом пероральном введении препарата.
Материал и методы
Экспериментальные животные
Эксперименты выполнены на 110 крысах-самцах линии Wistar массой 220±20 г, полученных из питомника лабораторных животных Рапполово ФГБУ «Национальный исследовательский центр «Курчатовский институт» (Россия). В течение 14 дней до эксперимента животные находились в карантине. Все исследования на животных проводились согласно методическим рекомендациям Минздрава России, FELASA и РусЛАСА. Исследования проведены с соблюдением принципов гуманности (Директивы Европейского сообщества №86/609 ЕС) и одобрены протоколом локального этического комитета при ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины» Минобрнауки России.
Дизайн эксперимента
Для изучения противоязвенной активности проведены две серии экспериментов: 1) изучение профилактического влияния альфа-глутамил-триптофана на формирование вызванных индометацином язв СОЖ; 2) изучение лечебного действия альфа-глутамил-триптофана на показатели заживления язвенных поражений СОЖ, вызванных индометацином. В каждой серии экспериментов животных распределяли в опытную, контрольную и интактную группы по 10 крыс в каждой. Животным опытных групп перорально вводили исследуемый препарат и препарат сравнения (в профилактических целях: альфа-глутамил-триптофан (АО «МБНПК «Цитомед», Россия) — 0,1 мкг на 1 кг массы тела (2 мл на 1 кг массы тела) и 10 мкг на 1 кг массы тела (2 мл на 1 кг массы тела) ежедневно 7 дней, гастропротектор сукральфат («КРКА», Словения) 200 мг на 1 кг массы тела ежедневно 7 дней; в лечебных целях: альфа-глутамил-триптофан — 0,1 мкг на 1 кг массы тела и 10 мкг на 1 кг массы тела ежедневно 5 дней, сукральфат 200 мг на 1 кг массы тела ежедневно 5 дней). Животным контрольной группы вводили индометацин (АО «Софарма», Болгария) per os однократно в соответствующей серии эксперимента дозе. В модели профилактического влияния животным опытных групп вводили индометацин однократно (20 мг на 1 кг массы тела) на 8-й день, в модели лечебного действия — однократно в 1-е сутки (30 мг на 1 кг массы тела). Животным интактных групп ничего не вводили. Эффективность профилактического применения исследуемых веществ оценивали через 24 ч после введения индометацина, эффективность лечебного курса — через 24 ч после последнего введения препаратов (рис. 1). Взятие образцов крови, подсчет количества деструкций в желудке и вычисление их площади, определение биохимических показателей сыворотки крови выполняли в обеих сериях экспериментов.
Рис. 1. Дизайн эксперимента.
Оцениваемые показатели
Определяли число и площадь деструкций, которые дифференцировали на точечные (менее 1 мм), полосовидные и крупные (более 1 мм). Подсчитывали среднее количество деструкций на 1 животное в группе и процент животных с язвами. Определяли индекс Паулса (ИП) как интегральный показатель количества деструкций [10] по формуле:
ИП = среднее количество деструкций в группе × % животных с язвами / 100(1)
Вычисляли индекс изъязвления:
ИЯ = средняя площадь деструкций в группе × % животных с язвами / 100 (2)
Гастропротекторную активность определяли по формулам:
ГА1 = ИП контрольной группы / ИП опытной группы (3)
ГА2 = ИЯ контрольной группы / ИЯ опытной группы (4)
Изучаемый препарат считали активным, если ГА ≥2.
Интенсивность процессов свободнорадикального окисления оценивали по накоплению малонового диальдегида (МДА) в сыворотке крови, которое определяли методом спектрофотометрии. Данный метод основан на определении оптической плотности образовавшегося хромогенного комплекса с 2’-тиобарбитуровой кислотой (λ=532—535 нм).
О состоянии антиоксидантной системы судили по активности СОД. Для определения активности СОД использовали метод самоокисления кверцетина. Принцип метода заключается в способности СОД тормозить реакцию самоокисления кверцетина, в результате которой происходит образование супероксидных анион-радикалов, подвергающихся дисмутации [11].
Статистическая обработка
Статистическую обработку выполняли с помощью пакета статистических программ Statistica 12. Статистическую значимость различий между показателями групп для параметрических данных с нормальным распределением оценивали с помощью t-критерия Стьюдента для независимых групп, а для данных с распределением, отличным от нормального, с применением критерия Манна—Уитни. Для определения степени отличия распределения от нормального использовали критерий Шапиро—Уилка. Для оценки различий частотных показателей применяли критерий Пирсона (при необходимости точный критерий Фишера). В ряде случаев применялась поправка Йейтса.
Результаты
Изучение влияния альфа-глутамил-триптофана при курсовом профилактическом введении на формирование вызванных индометацином язв желудка
Введение индометацина в ульцерогенной дозе вызывало образование деструкций слизистой оболочки желудка, причем наибольшее их количество и площадь приходились на крупноточечные и полосовидные повреждения.
Альфа-глутамил-триптофан заметно препятствовал образованию язвенных поражений желудка, вызванных индометацином, в обеих исследованных дозах (рис. 2). Количество язв снижалось в среднем в 1,9—2,4 раза (в группе сукральфата — в 3,9 раза), а площадь деструкций слизистой оболочки желудка крыс, получавших альфа-глутамил-триптофан, — в среднем в 2,7—3,1 раза (в группе препарата сравнения — в 6,8 раза) (p<0,05).
Рис. 2. Влияние курсового профилактического введения альфа-глутамил-триптофана на количество (а) и площадь поражения (б) индометациновых язв.
Данные представлены в виде M±SEM. * — статистически значимые различия по сравнению с контрольной группой (p<0,05). ГТ — альфа-глутамил-триптофан.
Профилактическое введение альфа-глутамил-триптофана характеризовалось гастропротекторной активностью для обеих изученных доз как для количества деструкций, так и для площади поражений (табл. 1). Индекс Паулса, отражающий интегральный показатель количества деструкций, снижался в 2,0—2,4 раза (в группе сукральфата — в 4,9 раза). Индекс изъязвления снижался в 3,1 раза, а в группе препарата сравнения — в 8,6 раза по сравнению с группой контроля.
Таблица 1. Гастропротекторная активность альфа-глутамил-триптофана и индексы при профилактическом введении в модели индометацинового язвообразования
| Группа | Животные с язвами, % | Индекс Паулса | Индекс изъязвления | ГА1 | ГА2 |
| Индометацин 20 мг/кг | 100 | 21,3 | 22,6 | — | — |
| ГТ 0,1 мкг/кг массы тела + индометацин | 90 | 10,08 | 7,56 | 2,11 | 2,99 |
| ГТ 10,0 мкг/кг + индометацин | 100 | 8,8 | 7,4 | 2,42 | 3,05 |
| Сукральфат 200 мг/кг + индометацин | 80 | 4,32 | 2,64 | 4,93 | 8,56 |
Примечание. * — статистически значимые различия по сравнению с контрольной группой, p<0,05. ГА1 — гастропротекторная активность, рассчитанная по количеству деструкций; ГА2 — гастропротекторная активность, рассчитанная по площади поражений; ГТ — альфа-глутамил-триптофан.
Введение индометацина в дозе 20 мг на 1 кг массы тела сопровождалось выраженной индукцией процессов свободнорадикального окисления и параллельно развивающимися нарушениями антиоксидантного статуса организма (рис. 3). Профилактическое введение альфа-глутамил-триптофана способствовало повышению активности фермента эндогенной антиоксидантной системы СОД в 1,6—1,7 раза, что близко к показателю у животных, получавших препарат сравнения, а также снижению в сыворотке крови концентрации конечного продукта ПОЛ — МДА в 1,6—1,7 раза) (p<0,05 по сравнению с группой индометацина). Показатель СОД в группе препарата сравнения увеличивался в 1,8 раза, а уровень МДА снижался в 2,0 раза.
Рис. 3. Влияние профилактического введения альфа-глутамил-триптофана на активность супероксиддисмутазы (а) и содержание малонового диальдегида (б) в сыворотке крови крыс.
Данные представлены в виде M±SEM. # — статистически значимые различия по сравнению с интактными животными (p<0,05); * — статистически значимые различия по сравнению с контрольной группой (p<0,05). OD — оптическая плотность; ГТ — альфа-глутамил-триптофан.
Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что альфа-глутамил-триптофан проявляет гастропротекторную активность на модели индометацинового повреждения желудка при профилактическом введении. При этом альфа-глутамил-триптофан в обеих дозах обладает противоязвенным действием, однако по своей эффективности несколько уступает сукральфату. Показана антиоксидантная активность препарата.
Изучение действия альфа-глутамил-триптофана при курсовом лечебном введении на показатели заживления вызванных индометацином язвенных поражений слизистой оболочки желудка
Введение животным ульцерогенной дозы индометацина (30 мг на 1 кг массы тела) через сутки вызывало образование язвенных поражений у 100% животных. На 5-е сутки количество и площадь поражений у животных контрольной группы (индометацин) не изменились (табл. 2). Однако следует отметить, что выжили только 7 из 10 животных данной группы.
Таблица 2. Влияние альфа-глутамил-триптофана на заживление индометациновых язв при курсовом лечебном введении
| Группа | Количество поражений | Площадь поражений | % животных с язвами | ИП | Индекс изъязвления | ГА1 | ГА2 |
| Индометацин, 1-е сутки | 8,4±1,6 | 31,0±7,4 | 100 | 8,4 | 31,0 | — | — |
| Индометацин, 5-е сутки | 8,3±1,0 | 32,6±10,2 | 100 | 8,3 | 32,6 | — | — |
| Индометацин + ГТ 0,1 мкг/кг | 7,6±1,3 | 36,3±8,2 | 100 | 7,6 | 36,27 | 1,1 | 0,9 |
| Индометацин + ГТ 10,0 мкг/кг | 5,4±1,5 | 12,0±3,3* | 100 | 5,4 | 12,0 | 1,5 | 2,7 |
| Индометацин + сукральфат 200 мг/кг | 3,3±1,0* | 11,5±4,26* | 85,7 | 2,8 | 9,86 | 3,0 | 3,3 |
Примечание. * — статистически значимые различия по сравнению с контрольной группой на 5-е сутки (p<0,05); ГА1 — гастропротекторная активность, рассчитанная по количеству деструкций; ГА2 — гастропротекторная активность, рассчитанная по площади поражений; ГТ — альфа-глутамил-триптофан.
Альфа-глутамил-триптофан при лечебном введении вызывал уменьшение количества язв в 1,5 раза и статистически значимое снижение площади язвенных поражений желудка — в 2,7 раза. Терапевтический эффект альфа-глутамил-триптофана был сильнее в дозе 10 мкг на 1 кг массы тела массы тела. По своему действию в отношении способности сокращать площадь поражений альфа-глутамил-триптофан в этой дозе статистически значимо не отличался от препарата сравнения сукральфата. Введение альфа-глутамил-триптофана в дозе 10 мкг на 1 кг массы тела снижало индекс Паулса в 1,5 раза, а индекс изъязвления снижался в 2,7 раза по сравнению с контрольной группой (индометацин на 5-е сутки). Гастропротекторная активность, рассчитанная по площади поражения, была равна 2,7 (см. табл. 2).
Деструкции желудка наблюдали только у 85,7% животных, получавших сукральфат, поэтому индекс Паулса и гастропротекторная активность в этой группе были несколько выше, чем в группе альфа-глутамил-триптофана.
Образование деструкций слизистой оболочки желудка сопровождалось повышением интенсивности перекисного окисления липидов (ПОЛ). Индометацин в ульцерогенной дозе вызывал снижение активности СОД и повышение уровня МДА уже через одни сутки, на 5-е сутки активность СОД повышалась, а уровень МДА был выше нормы в 2 раза (рис. 4).
Рис. 4. Влияние альфа-глутамил-триптофана при курсовом лечебном введении на активность супероксиддисмутазы (а) и содержание малонового диальдегида (б) в сыворотке крови крыс с индометациновыми язвами.
Данные представлены в виде M±SEM. # — статистически значимые различия по сравнению с интактными животными (p<0,05); * — статистически значимые различия по сравнению с контрольной группой, 5-е сутки (p<0,05). OD — оптическая плотность; ГТ — альфа-глутамил-триптофан.
Применение в лечебной схеме альфа-глутамил-триптофана повышало активность СОД в 2,1 раза в обеих дозах при сравнении с группой контроля в 1-е сутки, в группе сукральфата — в 2 раза. Однако к 5-м суткам антиоксидантная система животных восстанавливалась и при сравнении с группой контроля активность СОД увеличивалась до 1,2 раза. Прием препарата в дозе 10 мкг статистически значимо снижал повышенное после введения индометацина содержание МДА — в 1,5 раза (p<0,05). У животных группы препарата сравнения содержание МДА сходным образом снижалось в 1,8 раза (p<0,05).
Таким образом, исходя из полученных результатов, можно заключить, что альфа-глутамил-триптофан проявляет лечебное действие на модели индометацинового язвообразования, вызывая противоязвенный, гастропротекторный и антиоксидантный эффект. Наилучший терапевтический эффект наблюдался при введении альфа-глутамил-триптофана в дозе 10 мкг на 1 кг массы тела.
Обсуждение
Выявлено, что на модели НПВП-гастропатии, сопровождаемой язвообразованием, альфа-глутамил-триптофан при профилактическом введении снижал площадь деструкций слизистой оболочки желудка крыс и препятствовал образованию язвенных поражений желудка, вызванных индометацином. Количество язв снижалось в 1,9—2,4 раза, а площадь деструкций слизистой оболочки желудка крыс — в 2,7—3,1 раза. Показана гастропротекторная активность препарата в обеих изученных дозах — 0,1 мкг и 10 мкг на 1 кг массы тела, рассчитанная как по количеству, так и по площади поражений. Индекс Паулса снижался в 10,1—8,8 раза, индекс изъязвления — в 7,6—7,4 раза. Полученный результат указывает на то, что дипептид альфа-глутамил-триптофан обладает выраженным профилактическим противоязвенным действием на индометациновой модели язвы желудка при его курсовом введении в течение 7 дней.
Возникновение язвенных дефектов слизистой оболочки желудка сопровождалось снижением активности СОД и увеличением содержания МДА. Полученные результаты непротиворечиво соотносятся с данными литературы. В частности, A. Razzaq и I.Z. Qureshi при язвенном поражении слизистой оболочки желудка у мышей, вызванном приемом НПВП, отмечали повышение уровня МДА и активных форм кислорода при одновременном снижении уровней каталазы, пероксидазы и СОД [12]. Профилактическое курсовое введение альфа-глутамил-триптофана способствовало повышению активности фермента антиоксидантной системы СОД в 1,7 раза и снижению содержания в сыворотке крови маркера окислительного стресса МДА в 1,7 раза, что соответствовало уровню показателей у животных группы сравнения. Данные изменения свидетельствуют о наличии профилактических свойств у альфа-глутамил-триптофана в отношении процесса изъязвления СОЖ.
Рядом авторов в исследованиях также показано, что препараты, оказывающие противоязвенное действие, предотвращали грубое повреждение слизистой оболочки желудка за счет гистологических изменений, а также улучшения биохимических показателей (маркеров окислительного стресса, показателей антиоксидантной системы) до уровня, близкого к контрольному [12—14], восстанавливался уровень индексов язв, что нашло подтверждение и в нашей работе.
Альфа-глутамил-триптофан при лечебном введении вызывал снижение количества и достоверное уменьшение площади язвенных поражений желудка в дозе 10 мкг на 1 кг массы тела в 1,5 раза и 2,7 раза соответственно по сравнению с группой индометацина. Терапевтический эффект был сопоставимым с таковым у животных группы препарата сравнения сукральфат. В этой дозе отмечены гастропротекторная активность, рассчитанная по площади поражений желудка, снижение индексов изъязвления и индекса Паулса в 2,7 раза и 1,5 раза соответственно. Кроме того, альфа-глутамил-триптофан в лечебной схеме в дозе 10 мкг на 1 кг массы тела на фоне введения индометацина способствовал повышению активности СОД в 1,2 раза и снижению в сыворотке крови МДА в 1,5 раза — на сходном с группой препарата сравнения уровне.
Подобного рода эффекты, по-видимому, могут быть связаны с двумя молекулярными механизмами. Во-первых, H. Ohashi и соавт. показали, что L-глутамил-L-триптофан является лигандом метаботропного глутаматного рецептора mGluR1a, запускающего передачу сигналов инозитол-фосфатного сигнального пути [15]. Во-вторых, гастропротекторное и противоязвенное действие альфа-глутамил-триптофана может осуществляться за счет модуляции активности матриксных металлопротеиназ (МПП-1, МПП-2, МПП-8, МПП-9), улучшающих удаление детрита на ранних этапах регенерации, а затем ускоряющих образование грануляционной ткани на этапе закрытия дефекта [16].
Давно известен и успешно применяется в клинике «Даларгин» — синтетический регуляторный гексапептид, аналог лейцин-энкефалина, способствующий заживлению язв желудка и двенадцатиперстной кишки, обладающий умеренной антисекреторной активностью, а также снижающий кислотность желудочного сока [17]. Следующим в ряду пептидных лекарственных препаратов, способных вызвать регенерацию язвенных поражений, является трипептид «Стемокин» (изолейцил-глутамил-триптофан), который показал эффективность при язвенных дефектах кожи [18].
При использовании трипептида лейцин-изолейцин-лизина в модели экспериментальной индометациновой язвы желудка при профилактическом применении отмечали существенное снижение оксидативного повреждения и уменьшение воспалительных процессов в СОЖ [19]. Авторы использовали трипептид в дозе 11,5 мг на 1 кг массы тела, что на 3 порядка больше дозы, используемой в нашей работе; это позволяет предположить более выраженную биологическую активность альфа-глутамил-триптофана в модели индометацинового повреждения СОЖ у крыс.
Приведенные данные показывают, что создание современных гастропротекторных и противоязвенных препаратов на основе синтетических пептидов является важной задачей, позволяющей существенно расширить возможности лечения заболеваний желудочно-кишечного тракта.
Заключение
Полученные результаты указывают на то, что альфа-глутамил-триптофан проявляет выраженное профилактическое и лечебное гастропротекторное действие, обладает выраженной антиульцерогенной активностью на модели индометацинового повреждения желудка при пероральном введении. Отмечен его антиоксидантный эффект при профилактической схеме приема. На модели индометацинового ульцерогенеза при лечебной схеме введения альфа-глутамил-триптофана наилучший гастропротекторный, противоязвенный и антиоксидантный эффект наблюдался при применении в дозе 10 мкг на 1 кг массы тела.
Альфа-глутамил-триптофан может быть рекомендован для продолжения клинических исследований и создания нового эффективного противоязвенного препарата при гастропатиях, индуцированных нестероидными противовоспалительными препаратами.
Участие авторов:
Концепция и дизайн исследования — Петленко С.В.
Сбор и обработка материала — Селина Е.Н., Кудрявцева Т.А., Родионова О.М., Кузнецова Н.Н.
Написание текста — Селина Е.Н., Кудрявцева Т.А., Родионова О.М., Кузнецова Н.Н.
Статистическая обработка данных — Краснов А.А.
Редактирование — Краснов А.А., Апрятина В.А., Петленко С.В.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Authors contribution:
Study design and concept — Petlenko S.V.
Data collection and processing — Selina E.N., Kudryavtseva T.A., Rodionova O.M., Kuznetsova N.N.
Text writing — Selina E.N., Kudryavtseva T.A., Rodionova O.M., Kuznetsova N.N.
Statistical analysis — Krasnov A.A.
Editing — Krasnov A.A., Apryatina V.A., Petlenko S.V.