Ранее было продемонстрировано, что уже через 4 сут после инъекции аутологичных мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костномозгового происхождения (АММСККП) с белком GFP рядом с тромбированной веной начинается ангиогенез с участием введенных клеточных элементов [1, 2]. Позже полученные результаты свидетельствуют о возможности фагоцитоза АММСККП макрофагами, в результате чего они приобретают способность к люминесценции при воздействии УФ-светом [3]. Более того, макрофаги обладают свойством спонтанной аутофлюоресценции [4—6] и к свечению за счет фагоцитоза эритроцитов и гемосидерина [6, 7], которых много в тканях после хирургического вмешательства и тромбирования магистральной вены.
В связи с вышеизложенным представляется целесообразным уточнение ответа на вопрос: действительно ли введенные извне АММСККП участвуют в ангиогенезе при нарушении кровотока, или макрофаги фагоцитируют инъецированные АММСККП, в результате чего приобретают способность к флюоресценции и имитируют сосудистые структуры?
Цельнастоящего исследования — изучение начала ангиогенеза после применения АММСККП при остром локальном нарушении венозного оттока в эксперименте.
В качестве модели были использованы самцы крыс линии Wag массой 180—200 г в возрасте 6 мес. Все исследования проводили с соблюдением «Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных», все манипуляции осуществляли под общим ингаляционным эфирным наркозом.
АММСККП получали, культивировали и трансфицировали ДНК плазмиды, содержащей ген зеленого флюоресцентного белка GFP, в соответствии с нашими прошлыми работами [1—3].
Кроме того, клеточные мембраны были окрашены раствором Vybrant CM-DiL («Thermo Fisher Scientific», США), который является карбоциановым красителем. Vybrant CM-DiL — готовый раствор, при добавлении в среду культивирования клеток окрашивает мембраны живых суспензионных или прикрепившихся клеток, используется при изучении слияния клеток, их адгезии и миграции.
Через 2 ч после трансфекции плазмидной ДНК белка GFP к суспензии АММСККП добавляли краситель Vybrant CM-DiL из расчета 5 мкл раствора на 1·10 клеток в 1 мл среды без сыворотки, мягко тщательно перемешивали пипетированием и оставляли на 20 мин в СО-инкубаторе при 37 °C в условиях насыщенной влажности. Затем АММСККП центрифугировали в течение 5 мин при 1500 об/мин, среду с красителем удаляли, к АММСККП добавляли новую порцию теплой среды. Данную процедуру удаления красителя проводили 3 раза. Затем АММСККП ресуспендировали в теплой среде в объеме из расчета 1·10 клеток в 1 мл.
Для моделирования острой локальной венозной непроходимости осуществляли хирургический доступ к , перевязывали ее нелизируемым шовным материалом как можно ближе к месту впадения в и ушивали кожную рану. Через 1 сут без удаления лигатуры после дезинфекции кожи спиртом через кожные покровы инсулиновым шприцем вводили 100 мкл суспензии АММСККП в культуральной среде (1·10 клеток в 1 мл) в проекции лигированной вены. Животных декапитировали через 4 сут после инъекции АММСККП. В качестве контроля использовали интактных крыс, животных с перевязанной веной без использования АММСККП и ложнооперированных (разрез кожи без перевязывания вены с последующим введением АММСККП). В каждой группе было 11—12 животных.
с окружающими тканями и регионарные паховые лимфатические узлы (ПЛУ) фиксировали в 4% растворе параформальдегида на фосфатном буфере (рН 7,4) не менее 24 ч, обезвоживали в градиенте плотности этанола возрастающей концентрации, просветляли в ксилоле и заключали в гистопласт. Срезы толщиной 5—7 мкм окрашивали гематоксилином и эозином, изучали на световом микроскопе AxioImager M1 при увеличении до 1200 раз, также неокрашенные срезы исследовали в режиме люминесценции указанного микроскопа с фильтрами Alexa 488 или для родамина. Кроме того, проведено изучение неокрашенных срезов на конфокальном лазерном сканирующем микроскопе LSM 780 NLO («Zeiss») на базе AxioObserver Z1 («Zeiss»).
Бедренная вена на момент исследования имела сжатый просвет и признаки деструкции стенок. В соединительной ткани сосудистого пучка отмечали явления лейкоцитарной инфильтрации с преобладанием лимфоцитов и макрофагов. Также выявляли множество свежих геморрагий с пропитыванием больших массивов ткани форменными элементами крови (рис. 1, а).
При изучении неокрашенных срезов в режиме люминесценции с фильтром Alexa 488 наблюдалось отсутствие специфического свечения в стенке лигированной вены. В большинстве случаев флюоресценция не была отмечена и в стенке мелких кровеносных и лимфатических сосудов паравазальной клетчатки (см. рис. 1, б).
Следует отметить, что практически у всех животных в соединительной ткани сосудистого пучка обнаружены довольно большие скопления ярко флюоресцирующих при использовании фильтра Alexa 488 удлиненных клеток. В некоторых случаях можно проследить начало формирования из таких клеточных элементов кольцеобразных структур, похожих на сосуды (см. рис. 1, в).
На основании окрашивания мембран живых АММСККП во время культивирования красителем Vybrant CM-DiI флюоресцирующим красным цветом в режиме люминесценции с фильтром для родамина было проведено исследование с использованием конфокальной микроскопии.
При совмещении изображений, полученных по каналам Alexa 488, родамин и фазовый контраст, было найдено присутствие клеток с достаточно ярким красным свечением. Такие объекты имели различную морфологию (округлую, вытянутую фибробластоподобную, вытянутую эндотелиоподобную) и были расположены как в самой клетчатке, так и рядом с сосудами и непосредственно в их оболочках (рис. 2, а—в). Вместе с этим на очень больших участках клетки и сосуды даже по данным конфокальной микроскопии не имели ни зеленого, ни красного свечения (см. рис. 1, г; 2, г).
Необходимо обратить внимание на то, что при свечении удлиненных клеточных элементов в кольцеобразных сосудоподобных структурах равномерно флюоресцирует вся цитоплазма (см. рис. 2, а—в). При свечении овальных крупных (10—15 мкм) макрофагоподобных клеток [3] очень ярко флюоресцируют разнокалиберные включения, вместе с этим часть цитоплазмы остается темной и имеется четкий переход между светящимися и темными участками цитоплазмы (см. рис. 2, в). Светятся именно ограниченные цитоплазменные включения, возможно, лизосомы.
В ПЛУ в большинстве наблюдений присутствовали единичные флюоресцирующие объекты разного размера, разбросанные по срезу всего органа и сосредоточенные, главным образом, глубже коркового плато: в паракортикальной зоне и мозговом веществе. При внимательном одновременном изучении срезов, окрашенных гематоксилином и эозином, и неокрашенных в режиме люминесценции, было найдено, что такие светящиеся объекты являются или макрофагами, часто очень крупными, или эритроцитами как во внутриузловых сосудах, так и находящихся между клеточными элементами паренхимы.
Только в 1 случае были найдены скопления крупных флюоресцирующих клеток различной формы до 25 мкм в диаметре. В таких клеточных элементах светилась не вся цитоплазма, а множество четко очерченных включений. Данные скопления клеток были расположены в паренхиме коркового вещества ПЛУ, в том числе и в корковом плато, не исключено, что в лимфоидных узелках (см. рис. 1, д). Следует отметить, что на уровне таких скоплений светящихся крупных клеток вблизи капсулы ПЛУ на окрашенных гематоксилином и эозином срезах присутствовало множество крупных макрофагов, расположенных также небольшими группами как в лимфоидных узелках, так и непосредственно в паренхиме коркового плато и паракортекса (см. рис. 1, е).
При использовании конфокальной микроскопии было подтверждено, что эти крупные клетки в скоплениях светятся не целиком и равномерно, а содержат включения различного размера и окраски. Часть включений светилась зеленым цветом при применении канала Alexa 488, тогда как другие флюоресцировали красным при включении канала для родамина. В результате совмещения изображений, полученных на различных каналах, было найдено, что некоторые такие крупные клетки содержали одновременно включения, флюоресцирующие только зеленым цветом, и включения, светящиеся только красным (см. рис. 2, д).
Хирургическое вмешательство приводит к повреждению тканей, образованию тканевого детрита и асептическому воспалению. В результате воспалительной реакции для лизиса детрита и репарации в тканях вокруг сосудистого пучка повышается численность лейкоцитов, а так как септический компонент отсутствует, возрастает в первую очередь содержание лимфоцитов и макрофагов.
Перевязка вены при моделировании венозной непроходимости сопровождается венозной гипертензией [8], по крайней мере, до тех пор, пока не будет сформировано адекватное коллатеральное кровообращение через другие вены. В связи с этим в тканях в регионе перевязанной вены возрастает численность форменных элементов крови и формируются свежие геморрагии. Свой вклад в этот процесс вносят поврежденные кровеносные сосуды как при хирургическом вмешательстве (доступ к сосудистому пучку), так и при лигировании вены.
Во всех случаях обнаружения флюоресцирующих клеточных элементов на основании морфологических данных затруднительно точно определить их происхождение, особенно если эти клетки расположены вне всяких структур. Наиболее вероятно, что эти клетки являются или введенными АММСККП, мигрировавшими активно или пассивно из места введения, или макрофагами, светящимися за счет аутофлюоресценции [4—6] или из-за фагоцитированного материала [3, 6, 7]: GFP из разрушенных АММСККП или эритроциты (гемосидерин) из участков рассасывания геморрагий.
На основании фибробластной морфологии и яркой флюоресценции клеточных элементов в соединительной ткани, особенно там, где было отмечено начало формирования из этих клеток кольцеобразных структур, можно предположить, что наиболее вероятно эти светящиеся объекты являются введенными АММСККП в месте инъекции или недалеко от него.
То, что на очень больших участках паравазальных тканей и формирующегося рубца клетки и сосуды, даже по данным конфокальной микроскопии, не имели ни зеленого, ни красного свечения, является еще одним доказательством как специфичности свечения вышеуказанных клеточных элементов, так и того, что светятся именно введенные АММСККП. Это еще раз подтверждает достоверность полученных данных об участии в формировании сосудов инъецированных АММСККП, меченных ДНК белка GFP и флюоресцентным красителем клеточных мембран.
Введенные АММСККП на 4-е сутки после инъекции не только сами формируют сосуды полностью, но одновременно и параллельно встраиваются в образующиеся из собственных клеток. В клетчатке присутствуют сосуды, оболочки которых построены как из собственных клеток, так и из флюоресцирующих АММСККП. Это также ускоряет восстановление васкуляризации тканей с нарушенным кровообращением и в дальнейшем позволяет более быстро и с минимальными последствиями элиминировать пусть и генетически идентичные, но взятые у другой особи АММСККП, из структур, созданных с их участием [3]. Когда из введенных АММСККП построены не полностью сосуды, а только участки сосудистых оболочек, то произойдет постепенное замещение этих АММСККП без потери функциональности сосуда и тем более без его разрушения.
Скорее всего, не все инъецированные АММСККП принимают участие в ангио- и васкулогенезе. Часть этих клеток подвергается деструкции и фагоцитозу макрофагами, также нельзя исключить миграцию АММСККП тем или иным способом в другие органы и ткани, например ПЛУ [3]. Поэтому не исключено, что макрофаги, содержащие флюоресцирующие различным цветом включения, принимают участие как в фагоцитозе части введенных АММСККП, так и в лизисе их детрита.
По мере деградации АММСККП или их детрита в лизосомах фагоцитов освободившаяся краска или накапливается в этих же лизосомах или даже окрашивает мембраны макрофагов, в том числе и мембраны фагосом. Так как макрофаг способен фагоцитировать не одну клетку, а несколько, особенно если при постепенной деструкции уже поглощенных клеток процесс фагоцитоза продолжается, концентрация мембранного красителя может оказаться достаточно большой. Таким образом появляется очень яркое свечение как самих макрофагов, так и их включений (лизосом) при использовании родаминового фильтра.
В ПЛУ поступает послеоперационный детрит и продукты распада АММСККП из региона лимфосбора: тканей вокруг лигированной вены. В связи с этим биологически активные вещества, оказывающиеся в тканях при воспалении и изменяющие микроциркуляцию крови и проницаемость сосудов, также оказываются в ПЛУ, где могут являться причиной формирования геморрагий и других микроциркуляторных расстройств. В некоторых случаях флюоресценции мелких объектов в ПЛУ можно предположить свечение клеточного детрита АММСККП и продуктов рассасывания кровоизлияний в самих ПЛУ или попавших в эти органы из региона лимфосбора: тканей вокруг перевязанной вены, где также присутствовало множество геморрагий, так как сами эритроциты и продукты их деструкции, такие как гемосидерин, обладают аутофлюоресценцией [9—11].
Ранее уже было сделано сообщение о появлении крупных светящихся клеток в регионарных лимфатических узлах, являющихся, скорее всего, макрофагами, после использования АММСККП с белком GFP в регионе лимфосбора [3]. Свечение макрофагов в ПЛУ данной группы животных можно объяснить с различных позиций.
1. Скорее всего, макрофаги поглощают продукты рассасывания геморрагий и флюоресцируют за счет фагоцитированных эритроцитов и их детрита. Это возможно как рядом с лигированной веной, в таком случае макрофаги мигрировали в регионарные ПЛУ вместе с током лимфы. Или в ПЛУ поступает непосредственно детрит с гемосидерином и прочими компонентами эритроцитов, и уже непосредственно в органах этот детрит фагоцитируется макрофагами и обеспечивает их свечение.
2. Макрофаги фагоцитируют часть введенных АММСККП, тем более что они не все жизнеспособны из-за резких изменений условий жизнедеятельности (резкий перенос из комфортных условий культивирования в ткани с другим температурным, биохимическим и оксигенационным режимом), непосредственно в тканях, и далее мигрируют в ПЛУ, или фагоциты поглощают детрит погибших АММСККП и часть самих этих клеточных элементов уже в ПЛУ. В таких случаях возможно свечение макрофагов за счет находящегося в лизосомах фагоцитированного GFP.
Одновременное присутствие в макрофагах и зеленых, и красных включений при использовании соответственных режимов конфокальной микроскопии также хорошо объясняется с этих позиций. Так как введенные АММСККП содержали не только белок GFP, но и краситель мембран, видимый при использовании канала для родамина, то при фагоцитозе этих клеток лизосомы фагоцитов должны светиться и зеленым цветом за счет белка GFP, и красным из-за присутствия окрашенных мембран.
На основании этого можно сделать следующее предположение: вследствие окрашивания отдельных лизосом макрофагов только зеленым или только красным цветом существует вероятность, что мембранные структуры фагоцитированных клеток (а, возможно, и других объектов, например бактерий) подвергаются деструкции в отдельных лизосомах, видимо, из-за необходимости применения специфических ферментов.
Таким образом, можно заключить, что после введения АММСККП с трансфицированным геном и окрашенными клеточными мембранами через кожу в проекцию лигированной бедренной вены уже через 4 сут в паравазальной клетчатке и послеоперационном рубце присутствуют большие скопления ярко флюоресцирующих удлиненных клеток и можно обнаружить признаки ангиогенеза. Инъецированные АММСККП не только сами формируют сосуды полностью, но одновременно и параллельно встраиваются в образующиеся из собственных клеток. Часть введенных АММСККП фагоцитируется макрофагами, которые приобретают способность к флюоресценции за счет мембранного красителя. Такие макрофаги на указанный срок уже появляются в регионарных ПЛУ, концентрируясь в виде скоплений в лимфоидной паренхиме коркового вещества.
авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Концепция и дизайн исследования — И.М., В.В.М., А.Ш., В.А.М.
Сбор и обработка материала — И.М., В.В.М., В.А.М., А.Ш., А.А., Н.Ф., Р.М., Г. Ч.
Написание текста — И.М., В.В.М., А.Ш., В.А.М.
Редактирование — И.М.