Введение

Мезенхимальные стромальные клетки (МСК) — гетерогенная популяция прогениторных клеток, присутствующих в периваскулярном компартменте большинства тканей организма и выполняющих важные регуляторные функции [1, 2]. В основном за счет секреции широкого спектра биологически активных молекул МСК регулируют такие процессы, как ангиогенез, нейрогенез, иммунные реакции, перестройку внеклеточного матрикса, что делает их важным инструментом клеточной терапии и тканевой инженерии [3, 4]. Наиболее изученными являются МСК костного мозга, жировой ткани и перинатальных тканей, однако совсем мало известно об МСК сердца и возможности модуляции их паракринной функции с целью повышения регенеративных свойств. Между тем из ткани сердца также могут быть выделены МСК [5—7], обладающие всеми свойствами, присущими этому типу клеток: фибробластоподобной морфологией, адгезивными свойствами, соответствующим набором поверхностных антигенов и способностью к дифференцировкам в адипогенном, хондрогенном и остеогенном направлениях.

МСК, получаемые из тканей сердца человека и животных, также представляют собой гетерогенную популяцию прогениторных клеток разных типов [8, 9]. Первоначально исследования МСК сердца были нацелены на поиск условий для индукции дифференцировки в направлении кардиомиоцитов и клеток эндотелия. Однако скоро стало очевидно, что МСК сердца реализуют регенеративные свойства в основном за счет паракринных механизмов, а не посредством дифференцировки и тканезамещения [8, 10]. Особый интерес представляют ангиогенные свойства секретома МСК сердца, так как восстановление васкуляризации и перфузии миокарда при ишемическом повреждении имеет решающее значение для эффективной репарации. Для повышения регенеративных свойств МСК и их секретома используют разные воздействия в процессе их культивирования: гипоксию [11, 12], инкубацию с цитокинами и химическими соединениями [13], генетическую модификацию [14, 15]. Однако поиск относительно простого способа подготовки клеток и оптимального подхода для оптимизации свойств их секретома все еще продолжается.

Более ранние исследования нашей группы показывают, что использование этапа культивирования МСК сердца мыши в составе 3D-структур (сфероидов) вызывает усиление их регенеративных свойств [6]. Группой ученых из МГУ им. М.В. Ломоносова продемонстрировано, что 3D-культивирование МСК жировой ткани в составе минимальных тканеинженерных конструкций — клеточных пластов — вызывает значительное повышение секреции прорегенеративных факторов роста [16].

В данной работе мы исследовали секретом МСК сердца человека, прошедших этап культивирования в виде сфероидов, и провели оценку его ангиогенных свойств.

Материал и методы

Выделение клеток сердца и сборка кардиальных сфероидов

Для выполнения исследований использованы клетки кардиосфер человека, полученные из ушка правого предсердия (n=24) в ходе операции аортокоронарного шунтирования, проводимой в отделе сердечно-сосудистой хирургии ФГБУ «НМИЦ им. акад. Е.И. Чазова» Минздрава России после получения письменного информированного согласия пациентов. Исследование одобрено Этическим комитетом упомянутого учреждения (протокол №271 от 27.09.21). Для получения первичной культуры клеток ткань ушка правого предсердия измельчалась с помощью ножниц до размера кусочков 1—2 мм³, промывалась раствором фосфатносолевого буфера (ФСБ) и обрабатывалась ферментативным раствором (коллагеназа A («Rosch», США) 2мг/мл) для получения клеточной суспензии. Полученные клетки высаживали на культуральные чашки, покрытые фибронектином (40 мкг/мл), и культивировали в среде DMEM/F12 («Gibco», США), содержащей 100 ед/мл пенициллина и стрептомицина, глутамин («Gibco», США), 10% фетальной сыворотки теленка («HyClone», США), инсулин-трансферрин-селенит («Gibco», США), до достижения конфлюента. Далее клетки открепляли от поверхности культуральной чашки с помощью раствора трипсина и высаживали в низкоадгезионные условия [чашки, покрытые poly(2-HEMA) (12 мг/мл) («Sigma-Aldrich», США) в среду роста с добавлением bFGF (50 нг/мл) и EGF (20 нг/мл)], что приводило к формированию сфероидов.

Получение клеточных культур

В работе использованы линии эндотелиальных клеток пупочной вены (n=3), выделенные в соответствии с оптимизированным протоколом лаборатории [17] и задепонированные в коллекции биоматериалов института Экспериментальной кардиологии. Наращивание клеточной культуры проводили в среде EGM-2 («Lonza», Швейцария).

Для проведения сравнительных исследований секретома использованы линии МСК жировой ткани человека (n=3), выделенные в соответствии с оптимизированным протоколом лаборатории [18] и задепонированные в коллекции биоматериалов Института экспериментальной кардиологии. Наращивание клеточной культуры проводили в среде DMEM/F12 («Gibco», США), содержащей глутамин, 10% FBS («HyClone», США), инсулин-трансферрин-селенит и антибиотики («Gibco», США).

Оценка иммунофенотипа клеток сфероидов

Оценку иммунофенотипа клеток проводили с помощью проточной цитофлюориметрии. Суспензию клеток, полученную путем обработки 0,025% раствором трипсина, отмывали ФСБ, затем инкубировали с флюоресцентно меченными первичными антителами или контрольными IgG (изотипический контроль) в буфере FACS (1% бычий сывороточный альбумин в ФСБ без Ca²⁺, Mg²⁺) в течение 30 мин в соответствии с рекомендуемыми производителем разведением. Первичные антитела использовали к антигенам клеток мезенхимного фенотипа CD105, CD73, CD90 (BD, США) и гемопоэтических клеток-предшественниц CD34, CD45 (BD, США). Клетки отмывали 3 раза FACS и фиксировали в 1% растворе формалина в течение 5 мин, после чего клетки вновь отмывали и ресуспендировали в буфере FACS. Все процедуры выполняли при 4 °С. Анализ проводили на проточном цитофлюориметре FACS Aria III с использованием программного обеспечения FACS DIVA (BD, США).

Получение кондиционированных сред клеток кардиальных сфероидов, МСК жировой ткани и исследование состава секретома

Клетки промывали 5 раз фосфатно-солевым буфером, проводили замену среды на DMEM/F12 без добавок и культивировали в течение 24 ч в условиях инкубатора. Полученные среды подвергали двухэтапному центрифугированию (300g 10 мин, 600g 30 мин), полученный супернатант использовали для анализа состава секретома. Определение концентрации цитокинов (sCD40L, EGF, Eotaxin/CCL11, FGF-2, Flt-3 ligand, Fractalkine, G-CSF, GM-CSF, GRO, IFN-α2, IFN-γ, IL-1α, IL-1β, IL-1ra, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12 (p40), IL-12 (p70), IL-13, IL-15, IL-17A, IP-10, MCP-1, MCP-3, MDC (CCL22), MIP-1α, MIP-1β, PDGF-AA, PDGF-AB/BB, RANTES, TGF-α, TNF-α, TNF-β, VEGF) в кондиционированных средах, полученных при культивировании клеток кардиальных сфероидов (n=3) и МСК жировой ткани (n=3) проводили с помощью набора MILLIPLEX MAP 41 Human Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel (HCYTMAG-60K-PX4141, «Merck», Германия) в соответствии с инструкциями производителя. Количественную оценку выполняли с помощью флюоресцентного анализатора MAGPIX System («Luminex Merck», Германия) и программного обеспечения xPONENT 4.3.229.0. Концентрацию цитокинов (пг/мл) в кондиционированных средах определяли с помощью кривой зависимости средней интенсивности флюоресценции от концентрации стандарта.

Исследование миграционной активности клеток эндотелия после воздействия секретома клеток кардиальных сфероидов

Оценку миграции выполняли с помощью «вставок» для оценки миграции компании Ibidi Culture-Insert 2 Well («Ibidi», Германия). Вставки помещались в 24-луночные культуральные чашки без покрытия, в каждую ячейку добавляли по 25 000 клеток эндотелия в 70 мкл среды культивирования, проводили культивирование в течение 24 ч в условиях инкубатора (5% CO₂, +37 °С), после чего вставки удаляли. Извлечение вставки создавало свободный от клеток промежуток размером около 500 мкм, который использовался для анализа миграционной активности клеток с помощью фазово-контрастной микроскопии. Для тестирования использованы следующие среды: а) EBM-2 Basal medium +2% ФСТ+20% DMEM/F12 (без добавок); б) EBM-2 Basal medium +2% ФСТ+20% кондиционированной среды МСК сердца; в) EGM-2 (положительный контроль); г) EBM-2 Basal medium без добавок (отрицательный контроль). Документирование изображений проводили на приборе LCI Image ExFluorer (Корея).

Анализ формирования капилляроподобных структур клетками эндотелия после воздействия секретома клеток кардиальных сфероидов

Тестирование способности клеток эндотелия к формированию капилляроподобных структур на поверхности матригеля in vitro проводили в соответствии с ранее описанным протоколом [18, 19]. Вкратце: HUVEC высевали на культуральные чашки (5×10⁴ клеток/см²), покрытые MatrigelTM и культивировали в течение 19 ч в следующих средах: а) EBM2 Basal medium +2% ФСТ+20% DMEM/F12 (без добавок); б) EBM-2 Basal medium +2% ФСТ+20% кондиционированной среды МСК сердца; в) EGM2 (положительный контроль); г) EBM-2 Basal medium без добавок (отрицательный контроль). Документирование сформированных капилляроподобных структур проводили с помощью световой микроскопии на приборе LCI Image ExFluorer (Корея).

Анализ васкуляризации матригеля in vivo после трансплантации клеток кардиальных сфероидов

Исследование ангиогенеза in vivo проводили на самцах иммунодефицитных мышей линии Balb/c nude (n=17, возраст 8 нед, вес 28—30 г). Работы с животными проводили в соответствии с Европейской Конвенцией о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях (Страсбург, 18 марта 1986 г.), ETS N 123, «Международными рекомендациями (этический кодекс) по проведению медико-биологических исследований с использованием животных», разработанными и опубликованными в 1985 г. Советом международных научных организаций «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных», утвержденными Приложением к приказу Минздрава СССР от 12.08.77 №755. Животные содержались на стандартной диете и имели свободный доступ к воде. Анестезию мышей проводили путем внутрибрюшинных инъекций 6% авертина («Sigma-Aldrich», США). Трансплантацию матригеля с клетками (100 мкл матригеля и 50 мкл суспензии, содержащей 400 000 МСК сердца в ФСБ) проводили путем подкожных инъекций в паховую область. В качестве контролей проводили подкожные инъекции матригеля без добавок (150 мкл) и матригеля без клеток (100 мкл матригеля и 50 мкл ФСБ). Через 14 сут мышей подвергали эвтаназии путем дислокации шейных позвонков и извлекали матригель для анализа его васкуляризации.

Визуализация сосудов на криосрезах матригеля

Извлеченный матригель заключали в среду Tissue-Tek O.C.T. Compound («Sakura Finetek», Япония) и замораживали в парах жидкого азота. Изготавливали криосрезы толщиной 7 мкм на криостате Leica CM1900, помещали их на предметные стекла и хранили при –70 °С.

Иммунофлюоресцентное окрашивание проводили с использованием крысиных антител к CD31 мыши («BD Biosciences», США) и коммерческих наборов ImmPACT Vector Red Substrate Kit, Alkaline Phosphatase (AP) и ImmPRESS-AP Goat Anti-Rat IgG Polymer Detection Kit, Alkaline Phosphatase («Vector Lab.») в соответствии с рекомендациями производителя. Количественный анализ количества сосудистых структур проводили с помощью ручного подсчета в программе ImageJ (National Institutes of Health, США).

Микроскопия и анализ изображений

Анализ клеток проводили с использованием флюоресцентного микроскопа Axiovert 200 M («Carl Zeiss», США) и программного обеспечения AxioVision 4.8 («Carl Zeiss», США).

Статистический анализ

Статистическую значимость различий между выборками оценивали с помощью непараметрического критерия Манна—Уитни. Статистическую обработку результатов проводили с помощью программы Statistica 8.0 («StatSoft, Inc.»). Данные представлены в виде среднего значения±стандартное отклонение (Mean±SD).

Результаты

Сфероиды образованы клетками, обладающими характеристиками МСК

Предложенный способ 3D-культивирования обеспечивал формирование сфероидов, имеющих размер 112+43 мкм (n=44). Внешний слой сфероидов был представлен плотно упакованными уплощенными клетками, формирующими наружный каркас. Внутренний слой сфероида образован отросчатыми клетками и существенно обогащен белками внеклеточного матрикса. Методом ферментативной диссоциации сфероида мы показали, что кардиосфера образована клетками фибробластоподобной морфологии (рис. 1, а, б), экспрессирующими ключевые маркеры мезенхимальных клеток (рис. 1, в) и обладающими способностью к дифференцировке в адипо-, хондро- и остеогенных направлениях (данные не представлены), что указывает на их принадлежность к мезенхимальным стромальным клеткам сердца.

Рис. 1. Характеристика клеток кардиальных сфероидов.

а — репрезентативные изображения сфероидов, полученных на чашках с низкоадгезионным покрытием. Масштабный отрезок 100 мкм; б — репрезентативные изображения 2D-культуры мезенхимоподобных клеток, полученных из сфероидов. Масштабный отрезок 50 мкм; в — экспрессия мезенхимальных маркеров в клетках сфероидов.

Секретом клеток сфероидов обогащен ангиогенными факторами. Известно, что тканевая принадлежность может оказывать существенное влияние на свойства МСК. В частности, тканеспецифические МСК, полученные из сердца (клетки кардиосфер), отличаются по свойствам от клеток из других источников и могут обладать более высоким репаративным потенциалом, реализуемым за счет секреции биологически активных соединений [9, 20]. В кондиционированной среде кардиальных МСК (рис. 2) были обнаружены различные проангиогенные факторы: VEGF (118±2 пг/мл), EGF (23±3 пг/мл), bFGF (21±3 пг/мл), eotaxin (138±131 пг/мл), G-CSF (53±4 пг/мл), GM-CSF (5±2 пг/мл), fractalkine (57±5 пг/мл), IL8 (1702±811 пг/мл), MCP1 (2133±270 пг/мл), MCP3 (14±7 пг/мл) и Rantes (33±29 пг/мл), количество которых было сопоставимо с их содержанием в МСК жировой ткани. При этом содержание эотаксина-1 (CCL11), обеспечивающего хемотакис и ангиогенное поведение клеток эндотелия [21, 22], было статистически достоверно повышено в секретоме МСК сердца в сравнении с клетками жировой ткани.

Рис. 2. Содержание проангиогенных цитокинов/хемокинов, факторов роста в среде культивирования МСК сердца и жировой ткани.

Секретом МСК сердца, культивированных в 3D-условиях, стимулирует миграцию клеток эндотелия и их проангиогенное поведение in vitro

Миграция эндотелиальных клеток является важнейшим этапом ангиогенеза. Подвижность клеток регулируется хемотаксическими, гаптотаксическими и механотаксическими стимулами и включает деградацию внеклеточного матрикса для обеспечения продвижения мигрирующих клеток, что необходимо для сборки новообразованных сосудов в зоне повреждения de novo [23]. Для проверки воздействия секретома кардиальных МСК на миграционные свойства клеток эндотелия была использована хорошо известная модель «заращения царапины» (wound scratch assay). Мы обнаружили (рис. 3), что секретом МСК сердца человека, культивированных в 3D-условиях, стимулирует заращение царапины, что может быть обусловлено усилением миграции эндотелиальных клеток. Кроме того, мы обнаружили, что секретом МСК сердца при воздействии на клетки эндотелия стимулирует формирование разветвленной сосудистой сети, содержащей многочисленные ячейки разного размера (рис. 4).

Рис. 3. Секретом МСК сердца стимулирует миграционную активность клеток эндотелия.

а, б — репрезентативные изображения миграции клеток эндотелия (11 ч после посадки) под действием контрольной среды и кондиционированной среды МСК сердца; в — график количественной оценки миграционной активности клеток. M+SD (n=8). Масштабный отрезок 100 мкм.

Рис. 4. Секретом МСК сердца стимулирует формирование капилляроподобных структур клетками эндотелия.

а, б — репрезентативные изображения капилляроподобных структур, сформированных клетками эндотелия под действием контрольной среды (а) и кондиционированной среды МСК сердца (б); в, г — график количественной оценки общей длины и ячеистости сосудистой сети, сформированной эндотелиальными клетками под действием контрольной среды и кондиционированной среды МСК сердца. M±SD (n=9). Масштабный отрезок 500 мкм.

Секретом МСК сердца, культивированных в 3D-условиях, стимулирует васкуляризацию подкожного имплантата Матригеля in vivo

Ангиогенные свойства МСК сердца исследованы in vivo на модели васкуляризации подкожного имплантата Матригеля у мышей. Мы обнаружили, что через 14 дней после трансплантации в контрольном Матригеле (без клеток) наблюдаются лишь единичные сосуды (рис. 5), а в Матригеле с МСК сердца отмечалось значительное увеличение плотности сосудов.

Рис. 5. МСК сердца стимулируют васкуляризацию Матригеля после его подкожной трансплантации.

а, б — репрезентативные изображения срезов контрольного Матригеля (без клеток) и Матригеля с МСК сердца (14 дней после трансплантации); в — график количественной оценки количества CD31+ сосудов на срезах Матригеля (контрольного и Матригеля с МСК сердца). M±SD (n=5). Масштабный отрезок 200 мкм.

Обсуждение

Ежегодно наблюдается увеличение количества работ, сосредоточенных на создании терапевтических подходов, направленных на комплексное воздействие на ключевые звенья патологического процесса, которые основаны на принципе «бесклеточной терапии», а именно на использовании секретома клеток [4]. При этом в значительной части ранее проведенных исследований предлагалось использовать продукты секреции или клетки, культивированные в 2D-условиях, т.е. в состоянии, значительно отличающемся от их микроокружения in vivo. В условиях 2D-культивирования не могут быть обеспечены более естественная для клеток пространственная 3D-организация матрикса, взаимодействие с клетками, направленное воздействие сил поверхностного натяжения клеточной мембраны, а также градиентов кислорода и факторов роста [24]. Следствием этого могут быть нарушение основополагающих функций стволовых/прогениторных клеток, уменьшение или полная утрата их репаративного потенциала. В настоящее время считается, что прохождение этапа 3D-культивирования ex vivo крайне важно для поддержания их функционального состояния [25]. Трехмерная (3D) культура клеток служит важным связующим звеном между условиями in vivo и in vitro благодаря способности имитировать элементы микроокружения и поддерживать сложный естественный рост клеток и их секреторный потенциал.

В данной работе мы исследовали секретом МСК сердца человека, полученных после этапа культивирования в составе сфероидов, и выполнили анализ его воздействия на ангиогенез на моделях in vitro и in vivo. Мы впервые показали: а) секретом МСК сердца, культивированных в виде сфероидов (кардиосфер), содержит значительное количество проангиогенных биологически активных соединений; б) секретом клеток МСК сердца, культивированных в виде сфероидов, способен усиливать миграцию и проангиогенное поведение клеток эндотелия in vitro; в) клетки кардиосфер способны активировать ангиогенез in vivo.

Ранее мы обнаружили, что использование этапа культивирования МСК сердца мыши в составе сфероидов вызывает усиление их прорепаративных характеристик: повышение экспрессии маркеров сосудистых прогениторных клеток (Pdgfrα, Kit, Vegfr1) и факторов-регуляторов ангиогенеза (Vegf, Fgf2, Angpt1), а также повышение секреции проангиогенных факторов (ANGPT1, VEGF, CXCL16, PIGF-2) [6]. На основании этих данных мы предположили, что прохождение этапа 3D-культивирования может способствовать получению оптимизированной культуры кардиальных МСК, обладающих секретомом с оптимальными проангиогенными свойствами. Действительно, мы обнаружили, что секретом кардиальных МСК богат ключевыми проангиогенными факторами, включая фактор роста фибробластов (bFGF), фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), трансформирующий фактор роста бета (TGF-β), тромбоцитарный фактор роста (PDGF), ангиопоэтин-1 (ANG1), плацентарный фактор роста (PIGF), интерлейкин-6 (IL-6) и моноцитарный хемоаттрактантный белок-1 (MCP-1), которые по отдельности или в комбинации способны усиливать миграцию эндотелиальных клеток и их способность к образованию капилляроподобных структур. Эти данные хорошо согласуются с исследованиями других научных групп, утверждающих, что свойства МСК напрямую определяются условиями культивирования клеток, а репаративные свойства секретома могут быть скорректированы путем изменения 3D-топографии поверхности [26—28]. Хорошо известно, что для оптимизации секретома необходимо добиться уменьшения показателей гетерогенности клеточных популяций, обеспечить оптимальные показатели выживаемости и сохранить межклеточные взаимодействия, что достигается за счет использования этапа 3D-прекультивирования в трехмерных условиях с использованием самообразующихся структур (клеточные пласты [29—31], или сфероидов [32], или полимерных скэффолдов [33, 34]). Таким образом, терапевтический потенциал МСК и секретируемых ими факторов может быть таргетирован на целевое воздействие на определенные типы клеток в зависимости от условий культивирования и клеточного микроокружения. Действительно, в нашей работе подтверждена возможность стимулировать формирование сосудистых структур in vivo за счет трансплантации кардиальных МСК человека в 3D-микроокружение (Матригель), что в значительной степени связано с созданием градиента проангиогенных факторов роста, обеспечивающих миграцию и проангиогенное поведение клеток эндотелия.

В целом результаты проведенных исследований доказывают, что МСК сердца человека, полученные после этапа культивирования в составе сфероидов, обладают секретомом с проангиогенными характеристиками, действие которого направлено на клетки эндотелия и стимуляцию ангиогенеза. Полученные результаты создают основу для дальнейших исследований, направленных на разработку новых типов бесклеточных продуктов на основе секретома клеток для лечения заболеваний ишемической природы.

Финансирование. Работа выполнена при финансовой поддержке гранта РНФ 19-15-00384.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.