Введение

Исследование механизмов развития воспаления на экспериментальных моделях псориаза открывает возможности для оптимизации терапии. Модель имиквимод-индуцированного псориазоподобного дерматита у мышей была предложена в 2009 г. [1] и используется для изучения патогенеза псориаза и оценки эффективности различных методов лечения. С этой целью исследователи оценивают выраженность воспаления кожи и осуществляют исследования органов и тканей экспериментальных животных [2—5]. В частности, анализируются показатели экспрессии генов, кодирующих цитокины, другие медиаторы иммунной системы, секреции воспалительных цитокинов, изучается клеточный состав органов (лимфатических узлов, селезенки, периферической крови, кожи) [3, 4, 6]. Одним из методов таких исследований может стать объективная оценка интенсивности воспаления с целью определения эффективности терапии в рамках доклинических исследований лекарственных препаратов. Создание количественного способа оценки интенсивности воспаления в имиквимод-индуцированной модели псориаза у мышей с помощью цитофлуориметрического анализа содержания отдельных субпопуляций иммунных клеток в коже повысит результаты объективной оценки эффективности различных способов лечения в доклинических исследованиях.

Материал и методы

Предварительно исследуемых животных разделили на группы методом случайного распределения. Группу 1 (n=12) составили мыши с хроническим псориазоподобным дерматитом без назначения терапии с помощью крема имиквимод 5% (62,5 мг/см²/сут/мышь, 7 дней) [7]; группу 2 (опытную) (n=11) — мыши с хроническим псориазоподобным дерматитом, получавшие курс наружной терапии эмолентом, содержащим пироктоноламин, бисаболол, церамиды, холестерол, фитосфингозин, глицерин, глицерилстеарат, на фоне индуктора патологии крема имиквимод 5% в течение 7 дней; группу 3 (n=11) — мыши с хроническим псориазоподобным дерматитом, получавшие курс наружной терапии мазью 1% гидрокортизона на фоне индуктора патологии крема имиквимод 5% в течение 7 дней; группу 4 (n=10) — здоровые мыши, не получавшие препаратов. Хроническая экспериментальная патология была сформирована по методу Е.В. Сорокиной и соавт. [7]. Оценку степени тяжести осуществляли с применением mPASI [8—10]. В конце исследования выполняли биопсию кожи в области спины для патолого-анатомического и иммунологического исследований. Анализ гистологических препаратов выполнен при помощи светооптического микроскопа Carl Zeiss AxioImager A2 (Германия) при увеличении в 400 раз. Микрофотографирование проводили при помощи цифровой фотокамеры AxioCam 105 Color 1 и программного обеспечения ZEN 2.5 (blue edition) (Германия). Для оценки воспаления кожи применили полуколичественную оценку поражения, где 0 баллов — отсутствие воспаления, 1 балл — воспаление слабой степени (небольшое количество лимфоцитов определяется в эпидермисе, дерме и в подлежащей жировой клетчатке, воспаление носит очаговый характер, гиперкератоз незначителен), 2 балла — воспаление умеренной степени (увеличение количества клеток воспаления, увеличение площади поражения, небольшие участки некроза в пределах эпидермиса), 3 балла — выраженное воспаление (большое количество воспалительных элементов, может наблюдаться некроз, процесс распространяется обширно, вплоть до подкожно-жировой клетчатки и мышечного слоя, выраженный гиперкератоз). Помимо этого, каждый морфологический признак оценивали по шкале от 0 до 3 баллов. Для морфометрической оценки изменений в коже измеряли толщину эпидермиса.

Исследование субпопуляций мононуклеарных клеток (МНК) осуществляли методом проточной цитометрии с применением моноклональных антител (eBioscience, США; Miltenyi Biotec, Германия) — CD3, CD4, CD8, CD5, MHC II класса, TCRγδ, CD38, CD80, CD83, CD86, TLR2, результаты учитывали на проточном цитометре FC-500 (Beckman Coulter, США). Статистическая обработка проведена при помощи программного пакета WINMDI 2.8.

Результаты

Модель хронического воспаления кожи сформировали к 5-му дню, и с этого же дня в группах 2 и 3 была начата наружная терапия. На 7-й день терапии в группе 1 выраженность эритемы, инфильтрации и шелушения составила соответственно 12,6±0,73, 3,6±0,4 и 3,6±0,4 балла, суммарный балл (mPASI) — 18,2±0,2. В группе 2, где использовали эмолент, выраженность эритемы и инфильтрации составила 0,3±0,15 и 2,5±0,75 балла, шелушение и mPASI — соответственно 2,3±0,4 и 19,8±0,93 балла. В группе 3, где применяли гидрокортизон, выраженность эритемы, инфильтрации, шелушения и mPASI составили соответственно 3,6±0,73, 1,2±0,53, 0,6±0,4 и 5,4±0,93 балла. Площадь поражения к 7-му дню лечения сократилась в группах 2 и 3 до 65±20% и 45±13,33% соответственно (табл. 1).

Таблица 1. Сравнительная характеристика клинической картины кожи мышей: в 0-й и на 7-й дни лечения, баллы (M±σ)

Примечание. M — среднее арифметическое; σ — стандартное отклонение; * — достоверность различий между группами мышей (p<0,01) (тест Манна—Уитни).

На 7-й день терапии гидрокортизоном толщина кожи у двух групп мышей статистически значимо (p<0,01) различалась, у леченных гидрокортизоном мышей она была в 1,5 раза меньше (1,03±0,04 мм) по сравнению с группой 1 (1,58±0,24 мм) (табл. 2).

Таблица 2. Толщина кожи при воспроизведении модели хронического псориазоподобного воспаления у мышей линии C57BL/6 на фоне наружной терапии

Примечание. M — среднее арифметическое; σ — стандартное отклонение; * — достоверность различий между группами мышей (p<0,01) (тест Манна—Уитни); # — достоверность различий показателей до (1-й день) и после (7-й день) лечения (p<0,01) (тест Уилкоксона).

Патогистологическое исследование из очагов псориазоподобного воспаления кожи мышей показало (табл. 3), что группа с проведением местной терапии мазью гидрокортизона характеризуется снижением признаков воспаления, выраженности акантоза до 0,3±0,56 балла, гиперкератоза и папилломатоза до 0,15±0,36 балла, лимфоцитарной инфильтрации кожи до 0,25±0,62 балла, а также полным отсутствием микроабсцессов Мунро и уменьшением толщины кожи. В группе 2 отмечено уменьшение выраженности акантоза до 1,3±0,78 балла, гиперкератоза до 1,9±0,62 балла и числа микроабсцессов Мунро до 1,55±0,92 балла по сравнению с группой 1 (без лечения).

Таблица 3. Сравнительная характеристика патогистологической картины кожи мышей с псориазоподобным дерматитом без лечения и при наружном лечении, баллы (M±σ)

Примечание. M — среднее арифметическое; σ — стандартное отклонение; * — достоверность различий между группами мышей (p<0,05) (тест Манна—Уитни).

При проточной цитофлуориметрии клеток, выделенных из кожного биоптата мышей с хроническим имиквимод-индуцированным воспалением, получены данные, свидетельствующие о наличии субпопуляций, которые достоверно изменены в исследуемых группах мышей (табл. 4). К этим параметрам относятся клетки с иммунофенотипом CD4⁺, CD11c⁺, CD80⁺, CD83⁺, CD83⁺CD86⁺, γδTCR⁺, CD207⁺. Субпопуляция клеток CD4⁺ была снижена у мышей в 1-й группе в 7,3 раза (2,66±0,25%) по сравнению с контролем, в группе мышей, получавших терапию гидрокортизоном, этот показатель повысился до 13,2±0,64%, однако был ниже показателя в группе здоровых мышей — 19,14±0,48%. Клетки с фенотипом CD80⁺ также обнаружены в меньшем количестве в сравниваемых группах 1 и 3 — в 2,4 раза и 3,7 раза соответственно. Доля клеток, позитивных по дифференцировочным антигенам дендритных клеток (CD11c⁺, CD83⁺, CD83⁺CD86⁺), повышена у мышей исследуемых групп. Уровень клеток с фенотипом CD11c⁺ повышен в 2,1—2,3 раза, терапия не повлияла на нормализацию этого показателя. Клеток CD83⁺ было больше в 1,8—2,8 раза, их доли в опытных группах составили 49,52±2,66% и 37,16±1,23% соответственно, при этом терапия не привела к нормализации содержания в коже этих клеток. Доля клеток, экспрессирующих CD86, была повышена в 2,2 раза у мышей 1-й группы по сравнению с контролем (26,64±0,63% против 11,72±0,77%), в то время как в группе, где применяли наружно гидрокортизон в виде мази, этот показатель не отличался от показателя здоровых мышей в группе контроля — 11,46±0,39%. Количество Т-клеточной субпопуляции CD8a⁺ было снижено в группе 3 (мыши, получавшие гидрокортизон на фоне продолжения нанесения имиквимода) — 2,68±0,34%, что значительно меньше этого показателя в группе интактных мышей. Количество клеток с активационным маркером CD38 у мышей групп 1 и 3 различалось и составило 47,92±2,45% и 33,02±0,90% соответственно. Таким образом, в группе воспроизведенной хронической патологии этот показатель немного превышал показатель в группе контроля, в то время как при применении гидрокортизона наружно этот показатель был ниже, чем в группе контроля. Содержание клеток с иммунофенотипом CD205⁺ было повышено по сравнению с контролем в группе без лечения патологии — 64,52±0,49%, между тем применение гидрокортизона способствовало снижению числа этих клеток до 51,04±0,75%, что указывает на нормализацию этого показателя в ходе терапии гидрокортизоном. Содержание γδТ-клеток было значительно (в 2,8 раза) повышено у мышей, не получавших терапию псориазоподобного дерматита, и составило 64,6±2,36%, в то время как при применении наружно мази гидрокортизона этот показатель снизился до 37,64±1,31% и приблизился к значениям в группе здоровых мышей — 22,82±0,86%.

Таблица 4. Сравнительная характеристика фенотипа иммуноцитов кожи мышей интактных, с псориазоподобным дерматитом без лечения и при наружном лечении, доля экспрессирующих клеток в % (M±σ)

Примечание. M — среднее арифметическое; σ — стандартное отклонение; * — p<0,05, ** — p≤0,01 — достоверность различий между1-й и 3-й и 1-й и 2-й группами мышей; # — p<0,05 — достоверность различий между 1-й/2-й/3-й и 4-й группами мышей при по тесту Манна—Уитни.

В наибольшей степени изменялась доля клеток, считающихся одними из основных факторов воспаления при псориазе, — γδТ-лимфоцитов и клеток Лангерганса (CD207⁺). Количество клеток Лангерганса, выявляемых по экспрессии маркера CD207, у мышей группы 1 было увеличено в 8,1 раза (13,84±0,71% против 1,7±0,2% в контроле), применение мази гидрокортизона привело к нормализации этого показателя до 1,32±0,26%.

Заключение

Критериями оценки противовоспалительного эффекта в исследуемой модели являются снижение содержания γδТ-клеток по сравнению с исходными значениями и снижение содержания клеток, экспрессирующих CD207. Предложенный метод оценки эффективности терапии [7] позволяет выполнить более точную оценку эффекта лекарственных препаратов и химических веществ с помощью предложенных критериев, которые имеют количественные характеристики, при проведении доклинических исследований.

Преимуществами предложенного метода являются: 1) простота исполнения и экономичность (используют только один метод для количественной оценки — проточную цитофлуориметрию и только два маркера); 2) объективность оценки воспаления — наряду с количественной оценкой клеточного состава лейкоцитов кожи используют визуальную оценку интенсивности воспаления с помощью mPASI, а также сопоставляют mPASI, патогистологические признаки и содержание γδ-Τ-лимфоцитов и клеток Лангерганса в коже; 3) метод универсален для оценки эффективности методов наружной и системной терапии. Предложенный метод эффективен в модели как острого, так и хронического воспаления, является объективным методом оценки воспаления in vitro.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Е.В. Сорокина, Э.А. Ахматова

Сбор и обработка материала — В.Н. Столпникова, Е.О. Калиниченко, С.А. Сходова, Е.Ю. Сенцова

Статистическая обработка — И.В. Бишева

Написание текста — Е.В. Сорокина

Редактирование — И.В. Бишева

Финансирование. Исследование проведено без спонсорской поддержки.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Authors’ contributions:

The concept and design of the study — E.V. Sorokina, E.A. Akhmatova

Collecting and interpreting the data — V.N. Stolpnikova, E.O. Kalinichenko, S.A. Skhodova, E.Yu. Sentsova

Statistical analysis — I.V. Bisheva

Drafting the manuscript — E.V. Sorokina

Revising the manuscript — I.V. Bisheva

Funding. The study was performed without external funding.