Стремительное развитие молекулярно-биологических технологий предъявляет новые требования к качеству медицинской диагностики в современном мире. В начале XXI века стало возможным применение методов массивного параллельного секвенирования, т.е. определения нуклеотидного состава молекулы ДНК. Это углубило представление о составе и функционировании генома живых организмов (в первую очередь человека и многих видов вирусов и бактерий) и дало мощную базу для применения методов секвенирования в практической медицине. Секвенирование нового поколения (англ. Next-generation sequencing, NGS) явилось предпосылкой к возникновению нового научно-практического направления - молекулярной медицины, в которой проблемы диагностики, профилактики и лечения решаются на молекулярном уровне при помощи анализа нуклеиновых кислот (ДНК, РНК) и продуктов их экспрессии (белков). Методологическую основу молекулярной медицины составляют современные представления о структуре генома в целом и отдельных генов, их функциональных взаимодействиях, обеспечивающих различные состояния организма в норме и при патологии.

В настоящее время для идентификации клинически значимых мутаций в геноме пациента используется широкий спектр молекулярно-биологических методов. К наиболее распространенным методам детекции генетических нарушений можно отнести аллель-специфичную ПЦР, ПЦР в режиме реального времени, гибридизацию с использованием ДНК-чипов и секвенирование ДНК. Однако наиболее комплексным подходом, обеспечивающим достоверный результат подобных исследований, является прямое определение нуклеотидной последовательности интересующих участков генома пациента, которое достигается секвенированием ДНК. Появление технологий массивного параллельного секвенирования позволило не только увеличить производительность и скорость прочтения до миллиардов пар оснований, но и существенно снизить стоимость анализа. Сегодня можно выделить несколько основных компаний, реализующих технологии секвенирования NGS: 454 «Sequencing», «Illumina», «Life Technologies», «Pacific Biosciences». Однако на данный момент лидирующую позицию занимает компания «Illumina»(США): ~90% всех данных секвенирования в мире получены на секвенаторах «Illumina» [1].

Компания «Illumina» производит настольную, автоматизированную и доступную систему секвенирования нового поколения MiSeq (см. рисунок).

Проверенная временем и тысячами научных публикаций технология «Illumina» основана на массивном параллельном секвенировании миллионов одноцепочечных фрагментов ДНК. При этом используется технология секвенирования методом синтеза (sequencing by synthesis, SBS) с использованием флюоресцентно-меченных нуклеотидных зондов [2]. В каждый цикл секвенирования встраивается только один нуклеотид, меченный собственным флюорофором. Лазер приводит флюорофор в возбужденное состояние. После детекции флюорофор и блокатор ферментативно отщепляются и цикл начинается заново. Полученные данные флюоресценции анализируются внешним контролирующим компьютером и управляющим программным обеспечением и переводятся в представление последовательности ДНК.

В отличие от применяемых в настоящее время методов молекулярно-генетического анализа (ИФА, ПЦР, капиллярное секвенирование), технология секвенирования системы MiSeq обладает рядом особенностей, способных получить полную картину состояния генома пациента. Среди таких преимуществ можно выделить:

- Высокую производительность.

На сегодняшний день секвенатор MiSeq является наиболее мощным настольным секвенатором в мире с производительностью более 15 млрд пар оснований за один запуск, с максимальной длиной прочтения более 600 пар нуклеотидов. Такая производительность позволяет применять прибор с максимальной эффективностью и открывает новые направления для использования прибора в диагностике и исследованиях.

- Точность анализа.

Точность получаемых данных 99,99% позволяет быть уверенным в полученном результате, избежать явления ложноположительных и ложноотрицательных результатов, что является важнейшим фактором при постановке диагноза.

- Универсальность.

Секвенатор MiSeq открывает доступ к таким мощным методам секвенирования нового поколения, как секвенирование ампликонов, секвенирование малых геномов (микроорганизмы, вирусы), целевое секвенирование генома, анализ экзонов, секвенирование РНК, анализ статуса метилирования ДНК и многое другое. Это позволяет секвенатору MiSeq решать не только фундаментальные научно-исследовательские, но и прикладные задачи медицинской генетики.

- Возможность мультиплексного анализа.

Возможность анализа до 96 образцов за один запуск прибора делает MiSeq незаменимым при скрининговых исследованиях большого числа пациентов. При этом значительно экономится время исследования: для исследования 96 образцов потребуется не более 48 ч.

- Высокую степень автоматизации процесса исследования и обработки результатов.

Полный рабочий процесс характеризуется простотой: ручная работа максимально упрощена и ее длительность сведена к минимуму (от 1,5 ч). Поэтому возможность ошибки на стадии подготовки библиотек ДНК значительно снижена. Секвенирование и обработка данных происходят в автоматическом режиме, без непосредственного участия человека, что исключает «человеческий фактор» и позволяет избежать ошибки, цена которой при неправильной диагностике измеряется зачастую жизнями конкретных людей. Система MiSeq прекрасно подходит для использования в диагностических лабораториях медицинских учреждений из-за простоты обучения персонала работе с прибором.

Высокая точность получаемых результатов позволила использовать секвенатор MiSeq для проведения медицинских исследований и генетической диагностики. Следует отметить, что секвенатор MiSeq (модель MiSeqDx) стал первым в мире секвенатором нового поколения, получившим марку CEIVD и одобрение FDA (Управление по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных средств США) [3]. Это означает, что MiSeq может использоваться в целях клинической генетической диагностики в странах Европейского союза и США.

Таким образом, проверенная технология секвенирования путем синтеза в сочетании с простой и удобной пробоподготовкой делает секвенатор MiSeq идеальным инструментом для осуществления быстрого и эффективного генетического анализа для широкого круга областей применения: фармакогенетические исследования, диагностика генетических заболеваний и предрасположенности, дифференциальная диагностика рака, полногеномный анализ инфекционных возбудителей, метагеномов и т.п.

Компания «Illumina» предлагает целый ряд готовых наборов реагентов для различных областей клинической диагностики, разработанных совместно с ведущими мировыми научными и медицинскими центрами. Эти наборы обеспечивают простой процесс пробоподготовки и сразу же на выходе дают результаты анализа участков генома, имеющих отношение к той или иной патологии. Для анализа требуется не более 50 нг ДНК, при этом осуществляется секвенирование с высокой глубиной для каждого исследуемого гена, что обеспечивает высокую точность анализа. Глубина секвенирования, т.е. среднее количество прочтений каждого нуклеотида в геноме, является одним из наиболее важных факторов при секвенировании генома пациента или отдельных генов. При этом мировые стандарты генетических исследований требуют, чтобы каждый нуклеотид был прочитан минимум 30 раз для достоверного определения мутации в геноме пациента. Таким образом, технические характеристики секвенатора MiSeq в сочетании с использованием наборов реагентов позволят сразу включить прибор в цикл работы практикующих специалистов по основным направлениям:

1. Диагностика онкологических заболеваний.

Благодаря применению новых методов и диагностических возможностей в области генетики онкологических заболеваний было установлено, что каждая опухоль обладает собственными, присущими только ей характеристиками, которые отличаются от клеток здоровых тканей. Раковые опухоли даже одной локализации гетерогенны и по-разному реагируют на лекарственную терапию. На основании этих различий стала возможной разработка лекарственных препаратов, действующих непосредственно на молекулярную мишень в опухолевой клетке, не повреждая серьезным образом другие органы и ткани пациента. Особенность такой целевой («таргетной») терапии заключается в том, что каждый конкретный препарат эффективен лишь в отношении опухолей, обладающих определенными молекулярными характеристиками. Применение новых препаратов, ориентированных на «точечное» воздействие на молекулярные механизмы, требует обязательной идентификации генетических нарушений. Без проведения подобного исследования исход терапии в значительной степени неэффективен [4].

Подход «Illumina» к диагностике онкологических состояний заключается в точной идентификации маркеров ранней детекции для популяций и отдельных групп риска, наряду с идентификацией маркеров развития и прогнозирования заболевания с целью назначения и оценки эффективности проводимой терапии. Благодаря использованию набора TruSight Cancer стало возможным благополучное решение вопросов предрасположенности и их профилактики к онкологическим заболеваниям. Использование данного набора позволяет секвенировать 94 онкогена и выявить их мутации, которые отвечают за предрасположенность к развитию различных типов рака.

Кроме того, секвенирование ДНК из клеток раковых опухолей позволит идентифицировать мутации в опухоли и определить эффективность терапии. Наборы TruSight Tumor и TruSeq Amplicon - Cancer Panel позволяют секвенировать гены раковых опухолей (включая солидные опухоли легких, толстого кишечника, желудка, яичника, меланомы). Данные диагностические наборы позволяют анализировать до 48 известных онкогенов, включая ABL1, BRAF, EGFR, KRAS, NRAS, PIK3C, JAK2 и др. Из отличительных особенностей данных наборов необходимо отметить возможность работы с различными типами образцов (включая парафиновые блоки), а также высокую чувствительность - наборы позволяют точно идентифицировать мутации в малых субпопуляциях раковых клеток в образце (менее 5%).

Таким образом, результаты секвенирования ДНК пациентов позволят выявить мутации в геноме и определить эффективность терапии. Пациенты, являющиеся носителями мутаций в онкогенах, должны проходить тщательный скрининг для раннего обнаружения раковых опухолей. Своевременное выявление мутаций с последующим диспансерным наблюдением позволит: прогнозировать развитие рака, выбрать индивидуальную стратегию лечения, проводить профилактику повторного заболевания и в конечном итоге избежать тяжелых последствий для пациента.

Секвенатор MiSeq является идеальным инструментом при проведении анализа статуса метилирования ключевых онкогенов, результаты которого позволят прогнозировать развитие рака. Отклонения от нормального эпигенетического профиля четко продемонстрированы при злокачественных новообразованиях различных локализаций [5]. Специфические профили метилирования ассоциированы с факторами, которые позволяют прогнозировать развитие рака. Кроме того, многочисленные исследования показали, что повышение уровня метилирования генов-супрессоров опухолевого роста в раковых тканях в сопоставлении с нераковыми иногда достигает 100% [6].

2. Диагностика генетических заболеваний.

Следует отметить, что по данным ВОЗ врожденные наследственные заболевания составляют значительную долю наследственной патологии. Многие генетические заболевания, несмотря на достаточно высокий уровень медико-биологических знаний, представляют значительные трудности в своевременной диагностике и эффективном лечении и часто приводят к значительному нарушению качества жизни больных, инвалидизации и раннему летальному исходу. Компания «Illumina» предлагает уже готовые решения для диагностики многих генетических заболеваний.

Использование набора TruSight Exome позволяет секвенировать за один запуск прибора ~2700 генов и выявлять мутации, лежащие в основе или ассоциированные с множеством наследственных заболеваний, которые описаны в международной базе данных Human Gene Mutation Database (HGMD).Кроме того, данную тест-систему возможно использовать для диагностики переносимости лекарственных препаратов, что позволит обосновать применение того или иного препарата, а также оценить его эффективность.

Отдельно стоит отметить возможность применения секвенатора MiSeq для диагностики кардиомиопатий. Диагностический набор реагентов TruSight Cardiomyopathy позволяет секвенировать 46 генов, которые связаны с развитием различных типов кардиомиопатий: гипертрофической кардиомиопатии, дилатационной кардиомиопатии, рестриктивной кардиомиопатии, аритмогенной правожелудочковой кардиомиопатии, катехоламинергической полиморфной желудочковой тахикардии, синдромом некомпактного миокарда левого желудочка. Точная своевременная дифференциальная диагностика наследственных типов кардиомиопатий позволит назначить планомерное лечение с целью предотвращения и смягчения тяжелых последствий для пациента [7].

В настоящее время существует проблема диагностики аутизма у детей: во многих случаях специалисты могут расценивать настораживающие особенности раннего развития как признаки других нарушений самого широкого спектра, например как проявление ДЦП, сенсорных или речевых нарушений, невропатии и т.д. К сожалению, коррекционная работа редко начинается до 3-летнего возраста, потому что, как правило, аутизм редко диагностируется до 3 лет. Это приводит к потере времени и уменьшает шансы выравнивания ребенка (общение, восприятие, моторика, интеллектуальное развитие, речь, игра, навыки социального поведения). Хотя точные причины аутизма неизвестны, факторы риска включают в себя генетический компонент [8]. Секвенатор MiSeq в сочетании с использованием набора TruSight Autism позволяет секвенировать 101 ген и выявить нарушения, которые ассоциированы с расстройствами аутистического спектра. Такой подход позволит осуществить раннюю диагностику аутизма у детей и своевременно начать поведенческую терапию, что позволит улучшить обучение, коммуникацию и социальные навыки ребенка.

3. Диагностика инфекционных заболеваний.

В настоящее время секвенатор MiSeq успешно применяется в диагностике инфекционных заболеваний. Технология секвенирования «Illumina» позволяет идентифицировать микроорганизмы в анализируемом образце путем секвенирования 16S рРНК бактерий [9]. Данная методика позволяет производить метагеномный анализ, т.е. расшифровку «суммарного» генома бактериологических сообществ, что может дать ясную картину микробной нагрузки при анализе вспышек внутрибольничных инфекций и детекции септических состояний [10]. Результаты такого анализа позволят подобрать соответствующую терапию при лечении пациентов. Высочайшая производительность при возможности параллельного мультиплексного исследования 96 геномов позволит в кратчайшие сроки выявить возбудителя, включая некультивируемые штаммы, с очень высокой чувствительностью (до 0,1% устойчивого штамма). Помимо точной идентификации возбудителей, глубокое секвенирование позволит проводить активный эпидемиологический надзор за динамикой развития и распространения лекарственной устойчивости.

4. HLA-типирование.

Отдельно стоит отметить возможность применения секвенатора MiSeq для HLA-типирования [11]. В отличие от применяемых в настоящее время методов тканевого типирования (ИФА, ПЦР, серологические методы) технология секвенирования нового поколения обладает рядом особенностей и преимуществ [12]: быстрое получение результата типирования, анализ любых необходимых локусов MHC, отсутствие этапов работы с диагностическими сыворотками, высокое покрытие генов при секвенировании. Высокоточные результаты анализа локусов HLA позволяют подобрать донора, совместимого с пациентом по HLA-антигенам, при проведении трансплантации органов, тканей и гемопоэтических стволовых клеток при синдромах костномозговой недостаточности, иммунодефицитах, гемобластозах, онкологических и наследственных заболеваниях, а также диагностировать иммунные формы невынашивания беременности. Кроме того, возможен мультиплексный анализ специфических участков, ассоциированных с некоторыми аутоиммунными заболеваниями, такими как рассеянный склероз, нарколепсия, глютеновая болезнь, ревматоидный артрит и др. В настоящее время HLA-типирование с использованием технологии секвенирования NGS успешно применяется в крупных медицинских центрах и лабораториях США и стран Европейского Союза: в частности, в Техническом университете г. Кайзерслаутерн (Германия), медицинском центре DKMS Life Science Lab (Германия), компания «HistoGenetics» (США) использует секвенатор MiSeq с целью создания банков доноров костного мозга.

Таким образом, учитывая возможность проведения нескольких разнотиповых анализов на базе одного прибора, способностль проводить быстрое автоматическое секвенирование большого количества образцов, точности проведения генетического анализа, возможности автоматической интерпретации результатов анализа, метод секвенирования с использованием прибора MiSeq является оптимальным решением для клинико-диагностических лабораторий. Применение технологий секвенирования нового поколения способно дать мощнейший толчок для развития медицинской области в Российской Федерации и выйти на новый этап развития медицины, превентивной диагностики, тем самым способствуя улучшению качества жизни и здоровья населения РФ.