Введение
С момента установления роли H. pylori (HP) в развитии воспалительных заболеваний желудка и двенадцатиперстной кишки были изучены различные факторы патогенности бактерии на структурном и функциональном уровнях. Однако до сих пор неясно, почему только у части инфицированных пациентов развиваются серьезные патологии, такие как язва двенадцатиперстной кишки (ДПК), атрофический гастрит, рак желудка. Накопленные данные показывают, что развитие H. pylori-ассоциированных заболеваний связано с генотипом бактерии, взаимодействием иммунной системы хозяина с патогеном и факторами окружающей среды [1]. В Республике Беларусь частота выявления хеликобактериоза составляет более 70%, что представляет серьезную проблему здравоохранения [2].
HP экспрессирует большое число белков внешней мембраны, важнейшими из которых являются адгезины, отвечающие за прикрепление бактерии к рецепторам на эпителиальных клетках желудка хозяина [3]. Белок OipA (Outer inflammatory protein) опосредует взаимодействие бактерии с эпителиальными клетками, участвует в активации генов cag острова патогенности и индукции синтеза провоспалительных цитокинов [4].
Ген oipA является фазово-вариабельным геном, т.е. только некоторые штаммы HP экспрессируют функционально активный белок. Механизм экспрессии этого гена регулируется ошибочным спариванием соскальзывающей цепи (slipped strand mispairing) в области, кодирующей сигнальный пептид. Изменение числа СТ-повторов приводит к сдвигу рамки считывания с вставкой или утратой стоп-кодона, что влияет на транскрипцию гена [5].
Показано, что выявление определенных факторов патогенности HP, таких как гены острова патогенности cagPAI, помогает прогнозировать исход инфекции. Сообщалось, например, что наличие интактной области cagPAI часто связано с серьезными желудочными заболеваниями, такими как язва двенадцатиперстной кишки и рак желудка [6, 7].
Цель исследования — изучить вариабельность структурной организации гена oipA и его функциональный статус в образцах H. pylori с использованием метода секвенирования, оценить связь этого гена с наличием генов острова патогенности cagPAI и характером клинического течения хеликобактриоза.
Материал и методы
Было проведено обследование 84 H. pylori-положительных пациентов, обращавшихся в медицинский центр «Нордин» Минска с целью эндоскопического исследования желудочно-кишечного тракта. Все пациенты разделены на три группы в зависимости от диагноза: с поверхностным гастритом — 30 человек (средний возраст — 38,4±2,5 года, 18 женщин и 12 мужчин), с атрофическим гастритом — 28 человек (средний возраст — 55,4±2,3 года, 14 женщин и 14 мужчин), с язвой ДПК — 26 человек (средний возраст — 45,6±2,4 года, 15 женщин и 11 мужчин).
Для гистологического исследования биоптат из антрального отдела желудка фиксировали в 10% растворе формалина и заливали в парафин. Далее образцы окрашивали гематоксилином и эозином. На основании гистологического исследования описывали основные морфологические изменения слизистой оболочки желудка: атрофия желез, кишечная метаплазия, степень и активность воспалительного процесса в желудке, наличие H. pylori.
Объектом исследования была ДНК H. pylori выделенная из биоптатов антрального отдела слизистой оболочки желудка, полученных во время гастродуоденофиброскопии.
Выделение бактериальной ДНК проводили с использованием набора «Нуклеосорб С» (ОДО «Праймтех», РБ), в соответствии с инструкцией производителя. Детекция генов острова патогенности HP (cagPAI) была выполнена с помощью ПЦР с использованием олигонуклеотидных праймеров в объеме реакционной смеси 25 мкл, как описывалось ранее [6].
Для выявления вариабельности в отношении числа повторов CT-динуклеотидов в последовательности сигнального пептида гена oipA (CT-генотипа) и его функционального статуса проводили ПЦР с последующим секвенированием области, кодирующей сигнальный пептид, с помощью праймеров, описанных ранее в работе M. Sallas и соавт. [8]. Нуклеотидные последовательности были проанализированы с помощью программного обеспечения Mega 8.
Для статистического анализа полученных результатов была использована компьютерная программа Statistica 10. Для установления статистической достоверности различий между группами использовали критерий хи-квадрат, корреляцию по Спирмену, ОШ — соотношение шансов. Критерием достоверности считалось достижение уровня значимости p<0,05.
Результаты и обсуждение
При исследовании 84 штаммов H. pylori в области гена oipA, кодирующей сигнальный пептид, было обнаружено 13 различных комбинаций CT-динуклеотидных пар (рисунок (см. https://mediasphera.ru/upload/medialibrary/files/Mol_genetika_2022_04_011_add.zip)). Показано, что 67 (79,8%) образцов имеют активный функциональный статус, т.е. ген «включен», а остальные 17 (20,2%) образцов имели нефункциональный статус гена, т.е. в состоянии ген «выключен», как представлено в табл. 1.
Таблица 1. Ассоциация частоты CT-повторов гена oipA H. pylori с клиническими формами заболеваний
| CT-повторы | Атрофический гастрит, (28) n/% | Поверхностный гастрит, (30) n/% | Язва двенадцатиперстной кишки, (26) n/% | Всего/(84) n/% |
| Включен: | ||||
| 6 | 17/60,7 | 11/36,7 | 20/76,9 | 48/57,1 |
| 8 | 1/3,6 | 1/3,3 | 1/3,8 | 3/3,6 |
| 9 | — | 1/3,3 | 1/3,8 | 2/2,4 |
| 2+3 | — | — | 1/3,8 | 1/1,2 |
| 2+6 | — | 1/3,3 | — | 1/1,2 |
| 5+2 | 5/17,9 | 4/13,3 | 2/7,7 | 11/13,1 |
| 5+3 | — | 1/3,3 | — | 1/1,2 |
| Всего | 23/82,1 | 19/63,3 | 25/96,2 | 67/79,8 |
| Выключен: | ||||
| 10 | 2/7,1 | 2/6,7 | — | 4/4,8 |
| 9 | — | 1/3,3 | — | 1/1,1 |
| 8 | 2/7,1 | 1/3,3 | — | 3/3,6 |
| 5 | — | 2/6,7 | — | 2/2,4 |
| 7 | 1/3,6 | 3/10,0 | 1/3,8 | 5/6,0 |
| 11 | — | 2/6,7 | — | 2/2,4 |
| Всего | 5/17,9 | 11/36,7 | 1/3,8 | 17/20,2 |
Наиболее распространенным CT-паттерном, демонстрирующим функциональный статус «включен», оказался шестикратно повторяющийся CT-динуклеотид с частотой 57,1% (48/84). Кроме того, среди исследованных штаммов были обнаружены комбинации CT-повторов — 5+2 (13,1%), 8 (3,6%), 9 (2,4%), 2+3 (1,2%), 2+6 (1,2%), 5+3 (1,2%), демонстрирующих функциональный статус гена.
CT-повторы в числе 7 или 10 наиболее часто определялись при нефункциональном статусе («выключен») гена oipA (7 повторов CT — 6%; 10 повторов CT — 4,8%). Среди статуса oipA «выключено» также были обнаружены следующие паттерны повторения CT: 9 (1,1%), 8 (3,6%), 5 (2,4%), 11 (2,4%).
Функциональный статус «включен» гена oipA выявлялся у 96,2% (25/26) пациентов с язвой ДПК, у 82,1% (23/28) пациентов с атрофическим гастритом и у 66,3% (19/30) с поверхностным гастритом. Показано, что наличие гена oipA HP в функциональном состоянии «включен» является фактором риска развития язвы ДПК (p<0,003, ОШ=14,5, ДИ — 1,7—122,1). У пациентов с атрофическим гастритом значимой связи между статусом гена oipA и клиническим заболеванием не наблюдалось. Среди пациентов с язвой ДПК статус oipA «выключен» был обнаружен только в одном образце (3,8%).
В табл. 2 показана связь между генами острова патогенности и функциональным статусом гена oipA у 55 образцов ДНК H. pylori, выделенных из биопсийного материала желудка.
Таблица 2. Статус гена oipA H. pylori в зависимости от наличия генов острова патогенности cag PAI
| Гены cag-PAI | Статус гена oipA | p-значение | Коэффициент корреляции | |
| включен, % | выключен, % | |||
| cagM | 69,1 | 0 | <0,001 | 0,8 |
| cagA | 88 | 38 | <0,001 | 0,5 |
| cagT | 90,5 | 23 | <0,001 | 0,9 |
| cagL | 93 | 39 | <0,001 | 0,4 |
| cagE | 57 | 15 | <0,01 | 0,7 |
| cagH | 83 | 0 | <0,001 | 0,5 |
| cag-Empty | 0 | 46 | <0,001 | 0,5 |
Была выявлена статистически значимая связь между наличием генов острова патогенности и функциональным статусом oipA. Показано, что большинство образцов, содержащих гены острова патогенности, имеют функциональный статус гена oipA — «включен». Образцы с отсутствием генов острова патогенности не были выявлены при включенном гене oipA.
Показано, что статус гена oipA «включен» наиболее тесно коррелировал с присутствием генов cagM и cagT (r=0,8 и 0,9 соответственно). Высокая положительная корреляция также наблюдалась между геном oipA в рамке считывания и наличием гена cagE (r=0,7).
Таким образом, статус гена oipA «включен» прогностически неблагоприятен в сочетании с наличием в геноме бактерии важных факторов патогенности H. pylori.
Высокая вариабельность генома HP позволяет микроорганизму адаптироваться к изменениям окружающей среды [9]. Одним из механизмов генетического разнообразия является фазовая вариация, которая выражается в переключении фаз экспрессии белка «все или ничего» (включено/выключено) [3]. Изменчивость гена oipA опосредуется различным количеством повторов CT-динуклеотидов в 5’-области, которые влияют на функциональный статус гена, приводя к образованию функционального белка или формированию стоп-кодона при сдвиге рамки считывания [10].
Наши результаты так же, как и данные других авторов, показывают, что простая оценка наличия/отсутствия гена oipA не позволяет правильно оценить влияние гена и его белкового продукта на развитие более тяжелого течения и клинического исхода заболевания [11].
Проведенное нами исследование показало высокую распространенность (79,8%) гена oipA с функциональным статусом «включен». По данным литературы, частота выявления бактерий с наличием гена в таком статусе в странах Европы, таких как Нидерланды, Германия, Италия, Болгария, составляет 58—80% [4, 12—14]. Очень высокая распространенность включенного гена oipA — более 80% — наблюдается в Китае, Сингапуре, Индии и Бразилии [15—18].
Среди образцов со статусом включенного гена oipA наиболее часто были паттерны, содержащие 6 CT-повторов (57,1%), среди нефункционального — 7 CT-повторов (6%). Эти данные согласуются с результатами, полученными другими исследователями, где паттерны с 6 CT-повторами и паттерны с 7 CT-повторами были в основном связаны с «включенным» и «выключенным» статусом генов oipA соответственно [13, 17, 19].
Наши данные показали, что статус oipA «включен» достоверно ассоциирован с повышенным риском развития язвы ДПК по сравнению с поверхностным гастритом (p<0,003, ОШ=14,5, ДИ — 1,7—122,1), связь между статусом oipA «включен» и риском развития атрофического гастрита не достигла статистической значимости.
Многие исследования показали, что экспрессия oipA положительно коррелировала с развитием язвы ДПК как у азиатских (88%), так и у западных штаммов (59—70,5%) [4, 14, 20, 21].
Наиболее важной детерминантой вирулентности HP является остров патогенности cagPAI, содержащий около 27 генов, включая ген онкобелка cagA. Наше исследование показало корреляцию наличия генов острова патогенности со статусом oipA «включен». Эти результаты согласуются с данными, полученными в других исследованиях, в которых была выявлена ассоциация между статусом гена oipA «включен» и наличием некоторых генов cagPAI — cagA [4, 19], cagL [22], cagE [23].
Исследования, проведенные Horridge D.N. с соавт., показали, что при статусе гена oipA «выключен» наблюдается значительное снижение продукции ИЛ-8 даже в присутствии функционального cagPAI. Также экспрессия oipA не вызывает значительной секреции ИЛ-8 эпителиальными клетками желудка при инфицировании cagPAI-отрицательным штаммом. Это доказывает, что cagPAI не может индуцировать секрецию ИЛ-8 независимо от oipA. Исследования указывают на возможную роль гена oipA (в статусе «включен») в транслокации онкобелка cagA в эпителиальные клетки желудка. Авторы предполагают, что необходимо присутствие обоих факторов патогенности для продуцирования хозяином провоспалительных цитокинов [24].
Заключение
Способность регулировать экспрессию генов патогенности, в том числе и oipA, является адаптивным механизмом, необходимым для успешной колонизации желудка, и способствует многолетнему инфицированию, которое является отличительной чертой патогенеза H. pylori. Изучение механизмов селективного отбора является ключевым для понимания условий, влияющих на экспрессию фазово-вариабельных генов.
Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с участием людей или животных в качестве объектов исследований.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.