Одним из наиболее распространенных типов злокачественных новообразований у женщин является рак молочной железы (РМЖ), прогрессирование которого приводит к высоким показателями смертности [1]. В России численность больных РМЖ лидирует среди женского населения по показателям заболеваемости и смертности (22,1 и 15,8%, соответственно) [2]. Одну из основных проблем лечения РМЖ составляет высокий риск развития локорегионарных рецидивов. Поиск дополнительных информативных критериев прогноза развития рецидивов у больных РМЖ в отдаленном послеоперационном периоде представляет важную задачу современной онкомаммологии.

Вероятными молекулярными критериями, связанными с развитием рецидивов, могут быть протеасомы, представляющие собой мультисубъединичные структуры, содержащие протеолитическое ядро (20S- протеасому) и регуляторные субчастицы. Протеасомы обладают тремя протеолитическими активностями (химотрипсин-, каспаза- и типсинподобной), расщепляя до 80% внутриклеточных белков [3]. Функционирование 20S-протеасомы обеспечивает деградацию частично развернутых белков, которые могут проникать в отверстие ее каталитической камеры [4]. В основном деградация белков осуществляется после присоединения к ним убиквитиновой метки в 26S-протеасоме, образующейся в результате связывания 20S-протеасомы с одним или двумя регуляторными комплексами 19S, которые осуществляют АТФ-зависимое разворачивание убиквитинированного субстрата и его доставку в протеолитическую камеру 20S [5].

Основная функция протеасом — поддержание протеостаза и обеспечение нормального протекания клеточных процессов. Протеасомы играют важную роль в регуляции клеточного цикла, дифференцировки, апоптоза, транскрипции, клеточной подвижности, передачи сигналов [6—9]. Протеасомная деградация жизненно важна для всех клеток и организмов, а ее дисфункция или недостаточность связана с различными заболеваниями человека [10]. Так, развитие злокачественных опухолей приводит к увеличению активности и изменению субъединичного состава протеасом в опухоли по сравнению с соответствующей нормальной тканью, что обусловлено высокой пролиферативной и метаболической активностью клеток неоплазмы [11]. Повышение активности протеасом обнаружено в тканях рака эндометрия, яичников, желудка, кишечника [12—14].

В ткани РМЖ также обнаружено повышение химотрипсинподобной активности протеасом по сравнению с неизмененной тканью [15, 16]. Повышенная экспрессия генов ряда субъединиц протеасом может служить прогностическим фактором течения заболевания при РМЖ [17]. Вероятно, протеасомы принимают участие в прогрессировании РМЖ, а их активность может быть связана с прогнозом течения заболевания.

Цель работы — изучение прогностической роли активности протеасом у больных РМЖ.

Материал и методы

В исследование включено 65 больных с морфологически верифицированным диагнозом инвазивного РМЖ со стадией процесса T1—3N0—3M0, проходивших лечение на базе НИИ онкологии Томского НИМЦ за период 2007—2012 гг. Возраст пациенток составил от 28 до 75 лет (средний 53 года). Больные получали комбинированное лечение, включающее интраоперационную лучевую терапию (ИОЛТ) на ложе удаленной опухоли с помощью малогабаритного бетатрона МИБ-6Э, однократная доза составила 10 Гр (24,8 Гр по изоэффекту). Из 65 включенных в исследование больных РМЖ люминальный А-подтип опухоли был выявлен у 24 (37%) пациенток, люминальный В рак — у 29 (44,6%) и трижды негативный молекулярный подтип РМЖ — у 12 (18,4%). При оценке распространенности первичной опухоли РМЖ были получены следующие данные: категория T1, отражающая размер опухоли, регистрировалась у 44,6% пациенток, T2 — у 50,8%, Т3 — у 4,6%. По данным гистологического исследования, поражение регионарных лимфатических узлов N1 выявлено у 38,5% пациенток, N2-3 — у 7,7%, и у 53,8% пациенток отсутствовало поражение регионарных лимфатических узлов (табл. 1).

Таблица 1. Клинико-морфологическая характеристика больных РМЖ

Изучение показателей 10-летней безрецидивной выживаемости показало, что локорегионарные рецидивы возникли у 7,7% пациенток. Работа проведена с разрешения этического комитета НИИ онкологии Томского НИМЦ в соответствии с «Правилами клинической практики в Российской Федерации», утвержденными Приказом Минздрава РФ №266 от 19.06.03. Всеми пациентками было дано информированное согласие на проведение исследования.

Изучение протеасом проводилось в опухолевой и неизмененной тканях, взятых во время радикального хирургического вмешательства с осуществлением дальнейшей гистологической верификации. Химотрипсинподобную и каспазаподобную активность (ХПА и КПА соответственно) протеасом определяли в осветленных гомогенатах после центрифугирования в течение 60 мин при 100 00 g и 4 °C. Определение ХПА и КПА проводили по гидролизу флуорогенных олигопептидов: для ХПА использовали Suc-LLVY-AMC, для КПА — Cbz-LLG-AMC [15]. Образовавшийся продукт регистрировали на флуориметре Hitachi-850 (Япония) при длине волны возбуждения 380 нм и эмиссии 440 нм. За единицу активности протеасом принимали количество фермента, при котором гидролизуется 1 нмоль соответствующего субстрата в течение 1 мин. Удельную активность протеасом выражали в единицах активности на 1 мг белка. Содержание белка определяли по методу Лоури.

Статистическую обработку результатов проводили с помощью программ IBM SPSS Statistics v.20.0 и Statistica 10.0. Проверку нормальности распределения исследуемых выборок осуществляли с использованием критерия Колмогорова—Смирнова. Значимость различий между группами определяли с помощью непараметрических критериев Краскела—Уоллиса и Манна—Уитни для независимых выборок. Результаты в таблицах представлены в виде Me [Q1; Q3], где Me — медиана, Q1 и Q3 — нижний и верхний квартили. Продолжительность жизни (общую и безрецидивную) исчисляли в месяцах с момента проведенной радикальной мастэктомии или секторальной резекции молочной железы до времени последнего посещения пациенткой онколога или выявления исхода (летальный либо развитие локорегионарных рецидивов) на этапах динамического наблюдения. Сроки наблюдения за больными составили от 42 до 120 мес. Кривые кумулятивной выживаемости строились по методу Каплана—Мейера. Для оценки прогностической значимости признаков в отношении 10-летней общей и безрецидивной выживаемости у больных РМЖ был использован обобщенный критерий Гехана—Вилкоксона. Различия считали статистически значимыми при p<0,05.

Результаты

В результате исследования показано, что у больных РМЖ в опухолевой ткани медианные значения ХПА и КПА протеасом были выше в 2,52 и в 2,53 раза соответственно по сравнению с неизмененной тканью (табл. 2).

Таблица 2. Изменение активности протеасом в неизмененной и опухолевой тканях у больных с ИОЛТ при РМЖ

Примечание. Значимость различий с группой «неизмененная ткань» — р.

Проводя анализ изменений активности протеасом в тканях, была зафиксирована сильная вариабельность изучаемых показателей в опухоли и неизмененной ткани, что, вероятно, обусловлено интенсивностью процессов протеолиза как в опухоли, так и за ее пределами. Поэтому были введены коэффициенты соответствующей активности протеасом, которые могли быть применимы для каждой вошедшей в исследование пациентки. Для определения индивидуального уровня локального протеолиза в опухоли были оценены коэффициенты химотрипсинподобной и каспазаподобной активностей протеасом: кХПА, кКПА соответственно. Коэффициенты рассчитывались как отношение соответствующей активности в опухолевой ткани к активности в неизмененной ткани. Показано, что в ткани РМЖ кХПА был равен 2,45 (1,28; 3,84), а кКПА — 2,19 (1,42; 4,13). Впоследствии при проведении анализа выживаемости медианные значения данных коэффициентов послужат референсной величиной, разделяющей соответствующие значения на высокие и низкие.

Одним из проявлений прогрессирования РМЖ является выявленный локальный рецидив на месте удаленной опухоли или в регионарных лимфатических узлах. Изучение связи показателей протеасомной системы в ткани первичной опухоли с распространенностью РМЖ на регионарные лимфатические узлы показало значимое изменение КПА протеасом (χ²=7,18; df=2; p=0,03). В табл. 3 приведены межгрупповые различия активности и коэффициентов активности протеасом в зависимости от лимфогенного метастазирования.

Таблица 3. Изменение активности протеасом при РМЖ в зависимости от распространенности опухолевого процесса на регионарные лимфатические узлы (N) у больных с ИОЛТ

Примечание. * — значимость различий достоверна по сравнению с больными без метастазов в регионарных лимфатических узлах РМЖ (N0), p<0,05.

Так, при наличии лимфогенных метастазов медианное значение КПА протеасом в опухолевой ткани было на 35,9% ниже (критерий N2-3) по сравнению с опухолями без метастазов (критерий N0) (p=0,04). Статистически значимых изменений ХПА, кХПА и кКПА в зависимости от критерия N не выявлено (см. табл. 3). Отсутствие различий в изучаемых показателях между группами больных со стадиями T1-3N0M0 и T1-3N1M0, вероятно, связано с тем, что эти группы пациенток имеют более благоприятный прогноз течения заболевания, чем со стадией T1-3N2M0. Ранее также было установлено отсутствие статистически значимых различий по активности протеасом в группах пациенток с РМЖ со статусом регионарных лимфатических узлов N0 и N1 [16].

Учитывая важную роль протеасом в этих важных патофизиологических процессах, обусловливающих лимфогенное метастазирование, проведено изучение связи активности этих протеаз с возникновением локорегионарных рецидивов в отдаленном периоде. В изучаемой выборке в течении 10-летнего периода рецидивы развились у 7,7% пациенток с РМЖ. Кроме того, выявлено, что показатели 10-летней безрецидивной выживаемости различались в зависимости от значений ХПА и кКПА протеасом в опухоли (Log-rank Test: p=0,04 и p=0,04 соответственно). Прогноз заболевания в отношении развития рецидивов в отдаленном периоде был значительно хуже при высоком значении ХПА в опухоли и кКПА. При ХПА протеасом в опухолевой ткани более 39,66 Ед/ мг белка показатели 10-летней безрецидивной выживаемости составили 71%, тогда как при низкой активности ХПА — 100% (p=0,04) (рис. 1).

Рис. 1. Показатели 10-летней безрецидивной выживаемости в зависимости от значения химотрипсинподобной активности протеасом в ткани опухоли больных РМЖ.

При значении кКПА более 2,19, кумулятивный показатель 10-летней безрецидивной выживаемости составил 62,2%, тогда как при низком значении данного коэффициента тот же показатель был 100% (p=0,04) (рис. 2).

Рис. 2. Показатели 10-летней безрецидивной выживаемости в зависимости от значения коэффициента каспазаподобной активности протеасом в ткани больных РМЖ.

Таким образом, у больных РМЖ высокая ХПА протеасом в опухоли (более 39,66 Ед/мг белка) и высокое значение кКПА протеасом (более 2,19 Ед/мг белка) связаны с неблагоприятным прогнозом и появлением рецидивов в течение 10 лет после оперативного вмешательства. Эти данные подтверждают важную роль протеасом в прогрессировании РМЖ, что дает возможность лучше понять сущность процессов, лежащих в основе развития злокачественных опухолей.

Обсуждение

Актуальным направлением современной онкологии считается поиск молекулярных маркеров прогноза развития локорегионарных рецидивов при РМЖ, которые являются частой причиной летальности больных. Вероятно, участие протеасом в появлении метастазов в регионарных лимфатических узлах связано с их вовлеченностью в такие ключевые процессы онкогенеза, как пролиферативная активность, апоптоз, неоангиогенез [6, 7, 18]. В представленной работе показана связь ХПА и кКПА протеасом с развитием локорегионарных рецидивов РМЖ. Предложенные молекулярные критерии являются универсальными, информативными и могут быть использованы для гетерогенной в прогностическом плане группы злокачественных опухолей.

Наши данные о возможности использования показателей протеасомной системы в качестве прогностических маркеров отдаленных исходов согласуются с другими недавними исследованиями. Так, в работе D. Elfadl и соавт. [19] показано, что в тканях больных РМЖ низкая экспрессия 26S-протеасом, оцененная методом иммуногистохимии, была статистически значимо связана с радиорезистентностью, проявляющейся в развитии локорегионарных рецидивов в течение 4 лет после органосохраняющей терапии, по сравнению с пациентками, чувствительными к проведению лучевой терапии, у которых в течение 10 лет после хирургического вмешательства не было выявлено признаков рецидивирования. Используя общедоступные базы данных cBioPortal, Oncomine и Kaplan-Meier plotter, другая группа авторов изучала связь между экспрессией генов семейства PSMA, кодирующих α-субъединицы ядра протеасомы, и показателями безрецидивной выживаемости при РМЖ. Показано, что ткани РМЖ имеют более высокий уровень экспрессии генов семейства PSMA по сравнению с нормальной тканью молочной железы. Кроме того, высокие уровни экспрессии PSMA2, PSMA3, PSMA4, PSMA6 и PSMA7 коррелируют с худшей безрецидивной выживаемостью больных РМЖ, в то время как высокие уровни экспрессии PSMA5 и PSMA8 связаны с хорошим прогнозом [20]. Также в настоящее время в литературе представлены данные о возможности использования показателей протеасомной системы как прогностических маркеров опухолей разных локализаций. В частности, обсуждается роль протеасом в качестве прогностических маркеров при раке желудка [21], раке поджелудочной железы [22]. Кроме того, ранее проведенное исследование [23], в которое было включено 117 больных люминальным РМЖ, показало, что активность ХПА выше 35,9 Ед/мг белка и значение кКПА более 2,21 Ед/мг белка ассоциировано с неблагоприятным прогнозом 5-летней безметастатической выживаемости. При работе с общедоступными базами данных (Oncomine, GEPIA2, the Human Protein Atlas, the Kaplan-Meier plotter, METABRIC TCGA и GTEx) рядом исследователей [24, 25] установлена возможность использования определения генов, кодирующих различные субъединицы протеасом, в качестве прогностических маркеров более чем при 33 локализациях рака. Приведенные выше сведения указывают на перспективность использования показателей протеасомной системы не только в качестве дополнительных прогностических маркеров, но и вероятных терапевтических мишеней при многих формах рака.

Заключение

Анализ активности протеасом в связи с течением заболевания указывает на важную роль ХПА и кКПА протеасом в прогрессировании опухолевого процесса у больных РМЖ. Полученные данные свидетельствуют о возможности использования активности протеасом в тканях молочной железы в качестве дополнительных прогностических критериев при оценке возможного исхода заболевания у больных РМЖ в 10-летнем периоде, что позволит корректировать лечение и увеличивать продолжительность жизни пациенток.

Работа выполнена в рамках Государственного здания №075-01184-22-04 в Томском НИМЦ.

Участие авторов

Концепция и дизайн исследования — И.В. Кондакова, Е.А. Усынин

Сбор и обработка материала — Н.А. Алайчиев, Е.А. Сиденко

Статистическая обработка — А.В. Дорошенко

Написание текста — Е.Е. Середа, Г.В. Какурина

Редактирование — И.В. Кондакова, Е.А. Усынин

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.