Рак молочной железы (РМЖ) занимает лидирующие позиции среди онкологических заболеваний как в мире, так и в России. По данным за 2022 г. в мире зарегистрировано 2 296 840 новых случаев РМЖ, что составляет 46,8 случая на 100 тыс. населения. Смертность от этого заболевания составила 12,7 случая на 100 тыс. человек. В России за 2022 г. зарегистрировано 68 297 новых случаев РМЖ, а смертность в течение первого года составила 2,3% [1, 2].
Одним из рекомендуемых методов лечения при размере первичной опухоли до 5 см (T1-T2) является секторальная резекция или лампэктомия [3].
Несмотря на низкий уровень хирургических рисков, такое вмешательство может привести к эстетической деформации тканей молочной железы, ее асимметрии и рубцовым изменениям, что негативно влияет на социальную адаптацию и психоэмоциональное состояние пациенток. Для устранения подобных дефектов используются различные методы восстановления [4—6]. Встречаются публикации о применении различных имплантируемых материалов — гиалуроновой кислоты, полиакриламидного и силиконового гелей [7—9]. Встречаются работы по применению липофилинга в онкопластической практике [10].
Внимание привлекли клинические сообщения по успешному применению гетерогенных коллагенсодержащих композиций в реконструкции тканей [11]. При анализе доступной литературы [12] найдены единичные результаты исследований по онкологической безопасности подобного материала на моделях рака шейки матки in vitro. Данных литературы по результатам исследований онкологической безопасности гетерогенной коллагенсодержащей композиции на модели рака молочной железы in vivo мы не обнаружили — это и послужило целью проведения нашего исследования.
Материал и методы
Данное исследование выполнено, опираясь на ряд нормативных документов [13—16]. Для экспериментального исследования были выбраны наиболее доступные в нашей стране гетерогенные коллагенсодержащие композиции (ГКСК) в форме геля в двух исполнениях: Long (размер микрочастиц сшитой фракции коллагена составляет 150—300 мкм) и Medium (размер микрочастиц сшитой фракции коллагена 70—150 мкм).
В работе мы использовали опухолевую модель рака молочной железы мышей линии 4T1 (Клетки получены из Американской коллекции типовых клеточных культур ATCC (American Type Culture Collection)). Клетки прививали самкам мышей Balb/c категории SPF — specified pathogen free (НПП «Питомник лабораторных животных» — филиал ФГБУН «Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова» РАН, Пущино).
Животных содержали в экспериментально-биологической клинике с виварием, оснащенной операционными, манипуляционными и помещениями для раздельного содержания мелких лабораторных животных, в условиях постоянно действующей приточно-вытяжной вентиляции, постоянного температурного режима (24°C), при относительной влажности воздуха (50—60%) и со свободным доступом к воде и пище.
Эксперименты на мышах проводили с соблюдением принципов гуманности и требований, сформулированных в директивах Совета европейского сообщества 2010/63/EU «Об использовании животных для экспериментальных исследований», а также согласно заключению комиссии по биоэтическому контролю за содержанием и использованием лабораторных животных в научных целях ФГБУ «НМИЦ радиологии», протокол №2-ДИ-00057.
Животные были разделены на группы с различными режимами введения гелей, представленными в табл. 1.
Таблица 1. Распределение групп экспериментальных животных (мыши)
| Группа | Число животных в группе, серия 1/серия 2 | Вводимое вещество | Доза однократная, мл/суммарная, мл | Кратность введения |
| Группа без хирургического вмешательства | ||||
| 1-я | 8/8 | Гель Medium | 0,3/0,3 | 1 |
| 2-я | 8/8 | »» | 0,1/0,3 | 3 |
| 3-я | 8/8 | Гель Long | 0,3/0,3 | 1 |
| 4-я | 8/8 | »» | 0,1/0,3 | 3 |
| 5-я | 10/8 | Физиологический раствор (0,9% NaCl) | 0,3/0,3 | 1 |
| Группа с хирургическим вмешательством | ||||
| 6-я | 8/8 | Гель Medium | 0,3/0,3 | 1 |
| 7-я | 8/8 | Гель Long | 0,3/0,3 | 1 |
| 8-я | 8/8 | Физиологический раствор (0,9% NaCl) | 0,3/0,3 | 1 |
Методика культивирования. Клетки линии 4T1 культивировали в среде RPMI 1640 с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС) и 2 мМ L-глутамина в инкубаторе с атмосферой 5% CO₂ при 37°C. Опухолевые клетки, достигшие 75—80% конфлюентности после 3—4-го пассирования, обрабатывали раствором Версена для отделения от поверхности флаконов, а затем подсчитывали в камере Горяева для определения необходимой прививочной дозы, которая составила 1,0.10⁶ клеток. Суспензию клеток (0,1 мл) инокулировали подкожно в правую боковую поверхность туловища каждой мыши в 0-й день эксперимента.
Начиная с 1-го дня после инокуляции клеток всех животных ежедневно осматривали, а объем всех опухолей измеряли через каждые 4 дня с использованием цифрового штангенциркуля. Расчет объема опухоли выполняли по формуле:
V=a. b². 0,52,
где a и b — два взаимно перпендикулярных диаметра опухоли. Учитывая эллипсовидную формулу опухоли, 2 размера приблизительно сопоставимы, соответственно, в формуле данный размер во второй степени [17]. Возможную погрешность в измерениях и такую разницу принимали во внимание при статистическом анализе. Как только клинически объем опухоли достигал 100±20 мм³, во всех исследуемых группах данный срок составил 8 сут, у животных, включенных в группу с хирургическим вмешательством, проводили хирургическую резекцию около половины первичного опухолевого узла. В ходе микрохирургического вмешательства формировали подкожный паратуморальный карман около опухоли для введения ГКСК. Этот карман создавали с целью минимизации давления имплантируемого материала на оставшуюся часть опухоли. В сформированный паратуморальный карман при помощи шприца вводили 0,3 мл ГКСК или физиологический раствор.
В экспериментальных группах без хирургического вмешательства при помощи шприца ГКСК вводили подкожно, паратуморально. Аналогичным способом вводили физиологический раствор (0,9% NaCl). В группах с однократной дозой 0,1 мл ГКСК использовали трехкратно через день. Там, где разовая доза была 0,3 мл, ГКСК или физиологический раствор вводили одномоментно.
В ходе эксперимента оценивали динамику роста первичного опухолевого узла, время удвоения объема опухоли после введения ГКСК, определяли параметры торможения роста опухоли (ТРО) и торможения роста метастазов (ТМ) и на завершающем этапе эксперимента определяли массу опухолевого узла.
Наблюдение за животными проводили в течение 43 дней, начиная с 0-го дня эксперимента, т.е. с момента инокуляции клеток опухоли. Выполняли регулярный контроль объема опухоли и общего состояния животных. По завершении эксперимента все животные были подвергнуты эвтаназии с использованием CO₂-камеры. После эвтаназии осуществляли аутопсию мышей и забор тканей для последующего гистологического анализа.
Морфологическому исследованию подвергали первичные опухоли, регионарные лимфатические узлы и легкие. Оценивали такие параметры, как тип опухолевого роста, наличие метастазов в легких и лимфатических узлах, их частоту встречаемости, а также любые морфологические изменения, связанные с введением коллагенсодержащего материала по сравнению с использованием физиологического раствора. Полученные гистологические препараты фиксировали в нейтральном забуференном 10% формалине, после стандартной гистологической обработки биологический материал заключали в парафин. Нарезку с получением срезов толщиной 4—5 мкм выполняли на ротационном микротоме Leica RM 2125 RTS (Leica, Германия) с последующей окраской гематоксилином и эозином. Микроскопическое исследование проводили при помощи светового микроскопа BX 51 (Olympus, Япония) с системой фоторегистрации материала и анализа изображений для изучения опухолевого роста, возможных изменений в структуре тканей и взаимодействия имплантируемого геля с окружающими тканями. Также оценивали признаки воспалительной реакции, характерные для иммунного ответа на внедрение чужеродного материала.
Критерием оценки влияния ГКСК на первичный опухолевый узел является торможение роста опухоли (ТРО), который рассчитывается по формуле:
ТРО=[(Vк — Vоп)/Vк]. 100%,
где Vоп и Vк — средний объем опухоли в опытной и контрольной группах соответственно.
Одним из параметров для оценки метастазирования является уровень торможения метастазирования (ТМ), рассчитываемый по формуле:
ТМ=[Mк–Моп]/Мк.100%,
где Моп и Мк — средняя масса метастазов в пересчете на одну мышь в опытной и контрольной группах [18].
Для оценки статистической значимости выявленных различий был применен критерий Стьюдента (t-критерий).
Результаты
Были проанализированы следующие параметры: размер (объем) и масса опухолевых узлов, наличие метастазов в легких и в лимфатических узлах, а также морфологические изменения в окружающих тканях.
Измерение размеров и массы опухоли
При сравнении всех групп и обеих серий эксперимента, включая контрольную группу, получавшую физиологический раствор, значимых различий в объеме, массе опухолей и динамике роста (рис. 1) не выявлено (табл. 2). При подсчете ТРО достоверного негативного влияния ГКСК на первичный очаг не выявлено (табл. 3). Это свидетельствует, что использование коллагенсодержащего геля не влияет на рост опухолей в данной экспериментальной модели (p>0,05).
Рис. 1 Динамика роста карциномы 4Т1 после воздействия ГКСК.
а — серия 1, группы без хирургического лечения; б — серия 1, группы с хирургическим лечением; в — серия 2, группы без хирургического лечения; г — серия 2, группы с хирургическим лечением;
По оси абсцисс — сутки после инокуляции. По оси ординат — объем опухоли (в мм3).
Таблица 2. Средние значения объема первичной опухоли, ее массы в день выведения из эксперимента, сроки удвоения размера опухоли
| Параметр | Экспериментальная группа без хирургического вмешательства | Экспериментальная группа с хирургическим вмешательством | ||||||
| 1-я | 2-я | 3-я | 4-я | 5-я | 6-я | 7-я | 8-я | |
| Серия 1 | ||||||||
| Среднее значение объема, мм3 | 1453±272 | 1434±272 | 1447±232 | 1420±356 | 1473±313 | 1138±133 | 1175±104 | 1198±186 |
| Среднее время удвоения опухоли, сут | 13,5±1,9 | 14,5±2,9 | 13,5±1,5 | 13,4±1,3 | 11,9±1,5 | 18,3±1,2 | 18,7±2,5 | 17,5±3,0 |
| Среднее значение массы, г | 0,88±0,32 | 1,27±0,44 | 1,25±0,55 | 1,04±0,48 | 1,14±0,43 | 1,27±0,18 | 0,97±0,07 | 1,27±0,34 |
| Серия 2 | ||||||||
| Среднее значение объема, мм3 | 1455±289 | 1432±266 | 1445±244 | 1422±319 | 1468±327 | 1135±145 | 1172±99 | 1192±201 |
| Среднее время удвоения опухоли, сут | 13,6±1,5 | 14,1±2,3 | 13,4±1,6 | 13,8±1,15 | 12,0±1,8 | 18,1±1,4 | 18,8±2,1 | 17,5±2,7 |
| Среднее значение массы, г | 0,99±0,13 | 1,39±0,3 | 1,28±0,284 | 1,08±0,288 | 1,17±0,244 | 0,99±0,479 | 0,86±0,62 | 1,31±0,134 |
Примечание. Здесь и в табл.3: различия между опытными и контрольными группами по всем показателям недостоверны; p>0,05.
Таблица 3. Результаты расчета торможения роста опухоли в различных группах, %
| Экспериментальная группа | Время после инокуляции опухолевого материала, сут | ||||||||||||
| 8 | 10 | 13 | 15 | 18 | 20 | 23 | 25 | 27 | 32 | 37 | 41 | ||
| Серия 1 | |||||||||||||
| С хирургическим вмешательством | 1-я | 2,9 | 7,4 | 9,5 | 12 | 15,3 | 11,6 | 10,4 | 6,6 | 2,9 | 0,7 | 0,4 | 1,35 |
| 2-я | 0,9 | 10,5 | 20,5 | 16,3 | 12,3 | 9,8 | 6,2 | 3,7 | 2 | 5,5 | 4,4 | 2,6 | |
| 3-я | 1,9 | 8 | 10 | 14,8 | 9,1 | 1,5 | 1,6 | 3 | 2,9 | 4,4 | 4,2 | 1,7 | |
| 4-я | 0 | 3,1 | 10 | 9,2 | 10,7 | 6,5 | 5,7 | 9,1 | 9,7 | 6,9 | 7,2 | 3,5 | |
| Без хирургического вмешательства | 6-я | 0,9 | 2,5 | 0,9 | 10 | 21 | 5,7 | 6 | 2 | 3,1 | 4,9 | 5 | 5 |
| 7-я | 5,8 | 5 | 3,7 | 4,2 | 21 | 32,3 | 24,6 | 8,2 | 2,2 | 2,6 | 4,7 | 1,9 | |
| Серия 2 | |||||||||||||
| С хирургическим вмешательством | 1-я | 4,8 | 3,7 | 10 | 13,5 | 15,5 | 11,9 | 10,4 | 6,3 | 4,5 | 1,1 | 0,6 | 0,8 |
| 2-я | 1,9 | 10 | 19 | 16,7 | 12,8 | 10,8 | 5,2 | 3 | 2,2 | 5,6 | 4,4 | 2,4 | |
| 3-я | 0,9 | 9,4 | 10 | 15,6 | 9,5 | 1,1 | 0,3 | 3,8 | 3,9 | 4,9 | 4,9 | 1,5 | |
| 4-я | –2,9 | –0,6 | 10 | 13,2 | 10,3 | 7 | 5,7 | 9,2 | 9,8 | 6,8 | 7,9 | 3,1 | |
| Без хирургического вмешательства | 6-я | –7,1 | –11 | 0,9 | 5,8 | 18,4 | 6,7 | 3,8 | 3,4 | 4,1 | 5,1 | 5,2 | 4,7 |
| 7-я | 3 | –11 | 10 | 2,9 | 23,2 | 31,4 | 22,6 | 8,6 | 2,2 | 3 | 4,7 | 1,6 | |
Гистологические исследования
При проведении гистологических исследований материалов, забранных после выведения животных из эксперимента (43-и сутки после инокуляции) в опухолевых узлах выявлено наличие крупных плотных новообразований с выраженным инвазивным ростом, сопровождающимся обширными полями спонтанного некроза в центральной области опухолей. При сравнении всех групп достоверной разницы в строении опухолевого узла не выявлено (рис. 2, а; 3, а; 4, а, б; 5, а, б).
Рис. 2. Морфологическая характеристика первичного опухолевого очага аденокарциномы 4Т1 и органов, пораженных метастазами, у мышей Balb/c при паратуморальной имплантации коллагенсодержащего геля (Long) — 43-й день.
а — фрагмент опухолевого узла с введенным гелем; б — фрагменты введенного материала; в — метастаз опухоли в легком; г — метастаз в паховом лимфатическом узле; окраска гематоксилином и эозином; а, в — ×40; б — ×200; г — ×100.
Рис. 3. Морфологическая характеристика первичного опухолевого очага аденокарциномы 4Т1 и органов, пораженных метастазами, у мышей Balb/c при паратуморальной имплантации коллагенсодержащего геля (Medium) — 43-й день.
а — фрагмент опухолевого узла с введенным гелем; б — фрагмент введенного материала; в — метастаз опухоли в легком; г — метастазы в паховом лимфатическом узле; окраска гематоксилином и эозином; а, б, в — ×40; г — ×100.
Рис. 4. Морфологическая оценка легких, регионарных лимфатических узлов и ложа опухоли после хирургического удаления опухолевого узла и паратуморальной имплантации коллагенсодержащего геля (Long и Medium) у мышей Balb/c — 43-й день.
а, б — ложе опухоли, имплантированный материал не обнаружен; в — легкое; г — паховый лимфатический узел; окраска гематоксилином и эозином; а — ×100; б–г – ×40.
Рис. 5. Морфологическая характеристика первичного опухолевого очага аденокарциномы 4Т1 и органов, пораженных метастазами, у мышей Balb/c при паратуморальном введении 0,9% раствора NaCl — 43-й день.
а, б — фрагменты опухолевых узлов; в — метастаз опухоли в легком; г — метастаз в паховом лимфатическом узле; окраска гематоксилином и эозином; а, б, в — ×40; г — ×100.
В единичных образцах тканей из групп ГКСК (4 в Long и 2 в Medium) были обнаружены небольшие фрагменты введенного геля, окруженные соединительной тканью, что свидетельствует о его инкапсуляции (рис. 2, б, 3, б). В то же время в группах с выполненным хирургическим вмешательством с введением геля коллагеновый материал не обнаружен (рис. 4, а, б).
Оценка метастазирования
Морфологическое исследование легких и регионарных лимфатических узлов выявило наличие очагов метастазов во всех исследуемых группах. При сравнении всех групп независимо от введенного ГКСК или физиологического раствора не обнаружено достоверной разницы в частоте и распространенности метастатических поражений (рис. 2, в, г; 3, в, г; 4, в, г; 5, в, г). Расчет ТМ в экспериментальных группах не выявил влияния ГКСК на процесс метастазирования. Очаги метастазов в легких и регионарных лимфатических узлах наблюдались в равной степени во всех группах, что свидетельствует об отсутствии влияния коллагенсодержащих гелей на процесс метастазирования в данной модели опухоли (табл. 4, 5).
Таблица 4. Частота метастазирования в легкие и лимфатические узлы в различных группах, %
| Группа | Серия 1 | Серия 2 | |||
| Метастазирование | |||||
| в лимфатические узлы | в легкие | в лимфатические узлы | в легкие | ||
| Без хирургического вмешательства | 1-я | 100 | 38 | 100 | 33 |
| 2-я | 100 | 25 | 100 | 27 | |
| 3-я | 100 | 13 | 100 | 15 | |
| 4-я | 100 | 38 | 100 | 35 | |
| 5-я | 100 | 44 | 100 | 43 | |
| С хирургическим вмешательством | 6-я | 100 | 33 | 100 | 38 |
| 7-я | 100 | 33 | 100 | 31 | |
| 8-я | 100 | 50 | 100 | 47 | |
Таблица 5. Результаты расчета торможения метастазирования в легкие и лимфатические узлы в различных группах, %
| Группа | Серия 1 | Серия 2 | |||
| Торможение метастазирования | |||||
| в лимфатические узлы | в легкие | в лимфатические узлы | в легкие | ||
| Без хирургического вмешательства | 1-я | 18 | 0 | 16 | 1 |
| 2-я | 6 | 25 | 7 | 24 | |
| 3-я | 6 | 25 | 6 | 26 | |
| 4-я | 13 | 0 | 12 | 0 | |
| С хирургическим вмешательством | 6-я | 5 | 40 | 5 | 39 |
| 7-я | 28 | 40 | 24 | 40 | |
Обсуждение
Согласно опубликованным статистическим данным [1, 2], РМЖ — одна из самых распространенных нозологий среди злокачественных новообразований. Наиболее часто при этом заболевании выполняется хирургический этап лечения, однако при органосохранных операциях всегда есть риск развития рубцовой деформации, а также асимметрии молочных желез [4]. Это в значительной мере может повлиять на психоэмоциональное состояние пациенток. Имеются различные методы коррекции подобных деформаций молочной железы, наиболее распространенный из которых липофилинг. Суть данной методики заключается в использовании объема клеток собственного жира, взятого из донорских зон. Однако такой метод коррекции несет ряд негативных моментов: увеличение частоты общехирургических осложнений, повторная анестезия, риск развития деформаций в донорской области, непрогнозируемое рассасывание объема липоаспирата. Чтобы избежать этих проблем проводятся исследования и поиски новых методов устранения дефектов, одним из которых является использование гетерогенных коллагенсодержащих композиций, что и стало основой для нашего исследования.
Новые методы лечения в обязательном порядке проходят всесторонние исследования для оценки биобезопасности. Для применения методов у онкологических больных дополнительно необходимо изучать онкологическую безопасность. Такие исследования проводятся многопланово: in vitro, in vivo и ограниченные клинические исследования [19].
В настоящем исследовании мы предприняли попытку оценить влияние гетерогенных коллагенсодержащих композиций на динамику роста опухолей и метастазирование на модели РМЖ 4T1 у мышей. Основная цель — определить, оказывает ли коллагенсодержащий гель в различных вариантах влияние на первичную опухоль и процесс метастазирования.
В ходе выполнения нашего исследования принимали во внимание данные доступной литературы, при этом наибольший интерес представила работа M.Silva и соавт. [20], посвященная онкологической безопасности липоаспирата для аутологичной реконструкции молочной железы на животной модели (лабораторные животные: NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ, поставщик — лаборатория Джексона — Бар Харбор, Мэн, США. Перевиваемая клеточная культура MCF-7). В этой работе применялось паратуморальное введение липоаспирата в экспериментальных группах, а в контрольной группе — 0,9% NaCl. Отличие нашей методики от таковой при изучении липофилинга является в том, что мы добавили к эксперименту фактор хирургической агрессии (мы разрушали капсулу опухоли и выполняли резекцию ½ объема образования). Также формировали тканевые карманы для исключения влияния фактора механического сдавления гелем или физиологическим раствором самой опухоли.
Известны работы по изучению влияния высокомолекулярной гиалуроновой кислоты на размер популяции стволовых клеток на модели РМЖ линии mcf-7 [21] и гетерогенной коллагенсодержащей композиции на клетки рака шейки матки линии HeLa и по оценке перспективности ее применения в онкологической практике [12]. Согласно полученным авторами данным установлено, что в результате исследования гиалуроновой кислоты отмечалась пролиферация стволовых клеток РМЖ, что потенциально может вызвать рост полирезистентной опухоли. Это исследование показывает, что при введении гиалуроновой кислоты при устранении малых пострезекционных дефектов сохраняется риск прогрессирования основного заболевания.
Описаны результаты [12] изучения гетерогенной коллагенсодержащей композиции при анализе онкологической безопасности в отношения клеточной культуры рака шейки матки. Согласно полученным данным, на клеточных моделях карциномы шейки матки HeLa отрицательного влияния композиции не выявлено. Подобное исследование in vitro является одним из первичных этапов определения онкологической безопасности. Эксперименты in vitro позволяют оценить воздействие ГКСК на опухолевые клетки, но не отражают полную действительность взаимодействия исследуемых гелей с опухолью и окружающими тканями. В нашей работе мы изучали влияние гелей в различных комбинациях на РМЖ на модели in vivo, что позволяло учитывать не только взаимодействие с опухолевыми клетками, но и с микроокружением опухоли, а также оценить процесс метастазирования.
Выводы
Полученные результаты позволяют сделать следующие выводы:
1. При статистическом анализе объема и массы первичного опухолевого узла, динамики роста опухоли, времени удвоения опухолевого узла, а также при расчете торможения роста опухоли достоверной разницы получено не было, что указывает на отсутствие влияния ГКСК на первичную опухоль.
2. Оценка торможения и частоты метастазирования опухоли в лимфатические узлы и легкие не показала достоверной разницы между опытными и контрольными группами, что позволяет предположить нейтральность ГКСК в отношении процесса метастазирования.
3. Морфологическая картина развития опухолевого процесса показала отсутствие разницы в строении патологической ткани и ткани микроокружения между экспериментальными и контрольными группами.
4. В ходе эксперимента изучен фактор хирургической агрессии. Отрицательного влияния ГКСК на первичную опухоль и метастазирование не отмечено.
5. Полученные экспериментальные результаты показывают отсутствие прямого отрицательного влияния гетерогенной коллагенсодержащей композиции на карциному молочной железы линии 4T1 у мышей.
Участие авторов:
Концепция и дизайн исследования — Морозова Н.Б., Давыдов Д.В., Карпечкин М.О.
Сбор и обработка материала — Карпечкин М.О., Морозова Н.Б., Хохлова В.А.
Статистическая обработка —Карпечкин М.О., Морозова Н.Б.
Написание текста — Карпечкин М.О.
Редактирование — Давыдов Д.В., Морозова Н.Б.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.