Раннее выявление генетических мутаций и предупреждение рождения детей с врожденной и наследственной патологией остается актуальной проблемой общества и современной медицины. Последние десятилетия ознаменованы активным развитием новых технологий и методов исследования в области профилактики генетических нарушений плода. Это вызвано несколькими основными факторами: 1) в структуре перинатальной смертности и заболеваемости новорожденных врожденная и наследственная патология занимает 2-3-е место [1]; 2) изменилось репродуктивное поведение человека. Зачастую возраст перворожениц стал превышать 35 лет; 3) изменилась экологическая обстановка во всем мире; 4) можно предположить, что благодаря достижениям в области вынашивания стали рождаться дети с определенными хромосомными мутациями; 5) широкое применение в медицинской практике методов вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ), которые также могут способствовать передаче мутаций потомству, являющихся причиной бесплодия.

Такие опасения вызваны результатами исследования кариотипа у 430 детей, рожденных в программе ЭКО/ИКСИ: у 15 (3,5%) из них были хромосомные изменения, в то время как в контрольной группе из такого же числа детей, рожденных естественным путем, не было выявлено ни одного случая хромосомной патологии [2].

Кроме того, с 2002 г. в печати стали появляться работы, в которых авторы сообщают о случаях рождения в программе ЭКО детей с возникшими de novo заболеваниями геномного импринтинга: синдромами Видемана-Беквита, Энгельмана и др., которые не диагностируются стандартными цитогенетическими методами пренатальной диагностики и для выявления которых во время беременности требуется достаточно сложное комплексное обследование [3, 6, 19, 24].

В современных условиях назрела необходимость создания новых подходов к разработке методов профилактики врожденной и наследственной патологии с целью рождения здорового потомства у пациенток, включенных в программу ВРТ.

Новым и особенно перспективным направлением в клинической практике в плане исключения рождения генетически больного ребенка должна стать преимплантационная генетическая диагностика (ПГД), большим преимуществом которой является исследование эмбриона до момента переноса его в организм матери [15, 22].

В настоящее время большинство медицинских центров для ПГД применяют молекулярно-цитогенетический (FISH) и молекулярный (полимеразная цепная реакция - ПЦР) методы исследования.

Метод FISH - метод быстрого проведения генетического анализа и дает возможность получить результат в короткое время [20]. С помощью этого метода по флюоресценции зондов можно определить структурные перестройки хромосом и выявить число копий хромосом в интерфазных ядрах. Однако этим методом можно оценить ограниченное количество хромосом. Большинство клиник используют набор реактивов (зонды), которые позволяют проанализировать хромосомы Х, Y, 13, 18, 21 (самые частые анеуплоидии) [21].

Применяя технику ПЦР, можно диагностировать заболевания, связанные с доминантными и рецессивными мутациями в уникальных генах, определять антигены системы HLA, а также резус-принадлежность эмбрионов.

Все вышесказанное еще раз указывает на необходимость поиска новых методов диагностики эмбрионов с целью исключения у них генетической патологии и широкого внедрения этих методов в медицинскую практику не только у пациентов с нарушением репродуктивной функции, но и у фертильных супружеских пар с высоким риском рождения потомства с генетическими изменениями.

Одним из современных генетических методов исследования является метод сравнительной геномной гибридизации (Comparative Genomic Hybridization - CGH). Принцип метода основан на конкурентной гибридизации in situ двух геномных образцов (один получен из анализируемой ткани (или единичных клеток), второй - из контрольной) с array платформой (ДНК-проба, нанесенная на стекло, так называемый чип). Геномные образцы предварительно мечены разными флуорохромами. Заключение о количестве копий хромосомного материала делают по интенсивности свечения флуорохромов в каждом участке хромосомы. Важные преимущества метода - одновременно одна реакция гибридизации позволяет осуществить скрининг генома на предмет анеуплоидий и несбалансированных хромосомных перестроек; не требуется предварительное культивирование материала, приготовление хромосомных препаратов. Эти преимущества позволили применять данный метод в ПГД. Исследование полностью автоматизировано и в настоящее время может быть осуществлено в течение 24 ч.

Однако данный метод имеет и ряд ограничений, связанных с феноменом мозаицизма и хаотичным хромосомным набором в эмбрионе на ранних стадиях эмбриогенеза. Кроме того, данный метод не позволяет выявить плоидность клеток. Результаты FISH-исследования бластомеров показали, что 10-15% клеток могут быть гаплоидными или полиплоидными [13]. Кроме того, данный метод не всегда пригоден для диагностики у пациентов, имеющих в кариотипе сбалансированную транслокацию (если размер транслоцируемого участка хромосомы менее 2-5 млн пар нуклеотидов, зависит от array платформы).

Для проведения ПГД методом CGH могут быть использованы полярные тельца, бластомеры и клетки трофэктодермы [9, 16-18, 26]. Для диагностики используют различные array платформы: CytoChip Version 3.0; 24Sure Version 2.0; 24sure; 24sure+; metaphase chromosomes on a microscop slide [4, 8, 25, 27].

Исследование методом CGH можно разделить на несколько этапов:

1) полная геномная амплификация полученной клетки (Whole genom amplificarion -WGA);

2) контроль качества полученной исследуемой ДНК;

3) мечение контрольной и исследуемой ДНК;

4) концентрация ДНК перед гибридизацией;

5) гибридизация исследуемой и контрольной ДНК с array платформой;

6) отмывка образца после гибридизации;

7) сканирование array платформы с образцами, анализ результата.

В настоящее время сформулированы основные показания для ПГД:

- пары, у которых в анамнезе были случаи рождения детей с наследственной и врожденной патологией;

- пары, в кариотипе которых имеются сбалансированные хромосомные аберрации;

- пары, возраст женщины в которых превышает 35 лет;

- пары, в анамнезе которых были две и более неудачные попытки ЭКО;

- пары, у которых в анамнезе были случаи пузырного заноса, невынашивание беременности;

- пары с мужским фактором бесплодия.

В настоящее время оценке исходов программ ВРТ, где проводилась ПГД методом CGH, уделяется много внимания. Это связано с тем, что в печати имеются работы с противоречивыми данными об уровне имплантации и исходов программ ВРТ с ПГД методом FISH.

По мнению одних авторов, скрининг эмбрионов не увеличивает шансы наступления беременности, по мнению других, способствует этому. В своем обзоре J. Harper [14] предполагает, что это может быть связано именно с методом FISH, который не позволяет анализировать анеуплоидии одновременно всех хромосом.

Ученые Колорадского центра репродуктивной медицины исследовали методом CGH 287 бластоцист от 45 пациенток (средний возраст женщин 37,7 го­да) (см. таблицу).

В исследовании Z. Yang и соавт. [27] уровень выявленной анеуплоидии в ядрах трофэктодермы составил 44,9%, при этом моносомии - 35,1%; трисомии - 20,0% (см. таблицу).

Наступление беременности после диагностики составило 70,9% в группе контроля, в которой переносились эмбрионы визуально хорошего качества без ПГД, - 45,8%.

По мнению S. Alfarawati и соавт. [5], морфология эмбрионов на стадии бластоцисты не может являться точным критерием генетического здоровья эмбрионов. Хотя авторы и отмечают слабую ассоциацию морфологии с анеуплоидией, они считают, что нельзя быть до конца уверенными при переносе бластоцист, полагаясь только на этот критерий. В своем исследовании авторы показали, что 56,7% бластоцист были с анеуплоидией (см. таблицу).

Кроме того, внимание репродуктологов направлено на селекцию и перенос одного единственного здорового эмбриона в полость матки и получение беременности одним плодом, так как вынашивание многоплодной беременности связано с акушерскими осложнениями.

Многие авторы делают заключение, что скрининг эмбрионов полезен для достижения этой цели. При переносе 2-3 эмбрионов после ПГД W. Schoolcraft и соавт. [25] отметили, что в 57% наблюдений наступает многоплодная беременность (см. таблицу).

Z. Yang и соавт. [27] в своей работе рекомендуют селективно переносить как можно меньше эмбрионов с учетом возраста женщины, анамнеза и проведенных ранее циклов, при этом предварительно следует проводить ПГД. При переносе только одного эмбриона после ПГД беременность получена в 70,9% случаев (см. таблицу).

Исследователи отметили высокий уровень имплантации эмбрионов у пациенток с ранее неудачными попытками ВРТ в анамнезе. Так. W. Schoolcraft и соавт. [25] отметили, что из 90 перенесенных эмбрионов после ПГД методом CGH имплантировалось 65 (72,2%), а в группе контроля этот показатель составил всего 46,5% (в 6,5 нед беременности по данным ультразвукового исследования).

Супружеские пары программы ВРТ с изменениями в кариотипе представляют самую сложную группу нуждающихся в преимплантационной диагностике пациентов.

Носители сбалансированных хромосомных транслокаций в кариотипе имеют высокий риск рождения детей с хромосомной патологией, у них часто наблюдается невынашивание беременности из-за появления у потомства несбалансированных транслокаций. Проведение ПГД у этой группы пациенток представляется самой трудоемкой диагностикой. Для диагностики каждого вида хромосомных транслокаций FISH-методом требуется приготовление индивидуальных зондов в условиях лаборатории, проводящей диагностику.

При проведении ПГД у пациенток с изменениями в кариотипе необходимо учитывать тот факт, что у них формируются гаметы с мутациями de novo, использование которых в программе ЭКО, ИКСИ может привести к рождению ребенка с хромосомной патологией. Следовательно, помимо исследования эмбрионов на анеуплоидии хромосом, вовлеченных в транслокации, необходимо дополнительно исследовать их на самые распространенные хромосомные нарушения (синдромы Дауна, Патау, Эдвардса).

ПГД у пациентов с нарушением в кариотипе является одним из главных звеньев в алгоритме профилактических мероприятий по предотвращению не только рождения больного ребенка в таких семьях, но и возникновения беременности больным плодом.

Пользу одновременного исследования 24 хромосом у пациентов с аберрациями кариотипа отметили F. Fiorentino и соавт. [8]. Они проводили ПГД методом CGH в 28 циклах у 24 пар с 18 различными перестройками хромосом. Возраст женщин был меньше 43 лет (средний возраст 37 лет). Из 200 подвергшихся биопсии эмбрионов 3-го дня развития у 187 (93,5%) был получен результат. Пригодные для переноса эмбрионы были диагностированы в 17 (60,7%) циклах, всего было перенесено 22 эмбриона. У 12 (70,6%) пар наступила клиническая беременность, при этом уровень имплантации составил 63,6% (2 двойни, 10 одноплодных беременностей). На момент написания статьи 3 детей были рождены, остальные беременности были сроком гестации более 20 нед. Диагностика методом CGH показала, что 16% эмбрионов были нормальными или сбалансированными по всем хромосомам; 17,1% были несбалансированными по хромосомам, вовлеченным в транслокацию, и нормальными по остальным хромосомам; 39,6% были одновременно несбалансированными и имели анеуплоидии хромосом, не вовлеченных в транслокацию.

P. Colls и соавт. [7] считают, что метод CGH больше подходит для ПГД у пациентов с транслокациями в кариотипе. Это заключение было сделано после обследования 402 эмбрионов у супружеских пар с различными аберрациями в кариотипе. Результат был получен у 98,1% эмбрионов. Анализ результатов показал, что 20,2% ядер были нормальными или сбалансированными; 22,9% - несбалансированными, но эуплоидными; 30,6% - несбалансироваными и анеуплоидными и 26,4% - сбалансированными, но с анеуплоидией. На основании полученных данных авторы считают необходимым обследовать эмбрионы одновременно на транслокации и анеуплоидии хромосом, не вовлеченных в аберрацию. Похожие результаты были получены

S. Alfarawati и соавт. [5] Уровень пригодных для переноса эмбрионов составил 22,3%. Патология распределилась следующим образом: 21,5% эмбрионов были несбалансированными только по хромосомам, вовлеченным в транслокацию; 27,3% - несбалансированными и анеуплоидными; 28,9% - сбалансированными, но с анеуплоидией. Частота наступления беременности на цикл в данном исследовании составила 26,3, а на перенос эмбриона - 45,5%.

Анализ результатов проведения ПГД методом CGH в нашей лаборатории показал, что у этой категории пациентов до 30% случаев могут быть циклы без переносов эмбрионов. Следует отметить, что отмена переноса может быть не только по причине того, что в эмбрионах несбалансированные варианты генетического материала хромосом, вовлеченных в транслокацию, но и по причине анеуплоидий других хромосом, не вовлеченных в транслокацию. Уровень анеуплоидий хромосом у пациентов с транслокациями достигал 38%, сочетанная патология (несбалансированная транслокация+анеуплоидии по другим хромосомам) - 25%.

ПГД методом FISH у пациенток с невынашиванием беременности может снизить частоту спонтанных выкидышей до общепопуляционных показателей. У пациенток с выкидышами в анамнезе уровень спонтанных абортов удалось снизить до 16,7%, против ожидаемых 36,5%, у женщин старше 35 лет - до 12%, против ожидаемых 44,5% [23].

Проведенные собственные исследования позволили нам прийти к заключению, что исследование хориона неразвивающейся беременности после программ ВРТ является также необходимым важным этапом.

Нами были исследованы методом CGH хорионы неразвивающихся беременностей после программы ЭКО у пациенток с нормальным кариотипом. Результаты показали, что синдром Тернера встречался в 31,6% наблюдений от общей патологии, анеуплоидии по аутосомам составили 68,4%. Следует отметить, если бы этим пациенткам до переноса эмбрионов была проведена ПГД методом FISH стандартным набором для генетического скрининга, то в 42% наблюдений был бы перенос эмбрионов с генетической патологией, так как хромосомная патология, выявленная в неразвивающемся хорионе, была представлена хромосомами, не включенными в этот набор.

Ряд авторов [10] считают, что исследование первых и вторых полярных телец методом CGH может служить надежным предиктором плоидности зиготы.

Кроме того, применение метода CGH открывает новые возможности в понимании процессов сегрегации хромосом во время мейоза в стимулированных циклах. A. Handyside и группа ученых исследовали первое и второе полярные тельца, зиготы у возрастных женщин программы ВРТ и показали ошибки материнского происхождения. Данные указывают на то, что анеуплоидии возникали как в мейозе I, так и в мейозе II. Однако на долю вторых приходилась бо`льшая половина, в зиготах же в основном наблюдалась анеуплоидия сразу нескольких хромосом [11, 12].

В настоящее время прогресс в развитии микроманипуляционной техники и методов лечения нарушений репродуктивной функции, к сожалению, опережает разработку и внедрение методов профилактики рождения здорового потомства. С учетом того, что среди пациентов с нарушенной репродуктивной функцией генетическая патология встречается чаще, чем в популяции, профилактические мероприятия должны стать неотъемлемой частью при проведении программы ВРТ. В связи с вышесказанным разработкам в области преимплантационной диагностики в последнее время уделяется большое внимание.

Особенностью преимплантационной диагностики является то, что в семьях с высоким риском рождения больного ребенка появляется возможность перейти от вероятностного прогнозирования исхода беременности к однозначному.

Преимплантационная диагностика может стать альтернативой пренатальной диагностике для фертильных супружеских пар, имеющих высокий риск рождения ребенка с наследственной или врожденной патологией, которые в случае обнаружения у плода генетической патологии выступают против медицинского аборта по моральным, религиозным или другим мотивам.

Все вышесказанное указывает на то, что метод CGH может быть успешно применен в преимплантационной диагностике на разных стадиях развития эмбриона и полярных тельцах.