Введение
Пандемия, вызванная новым коронавирусом SARS-CoV-2 (Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2), затронула все человечество. Реконвалесцентами данного заболевания стало целое поколение мужчин и женщин репродуктивного возраста. В настоящее время собран опыт терапии и диагностики данного заболевания, однако остается большое количество вопросов, посвященных воздействию вируса SARS-CoV-2 как на репродуктивную сферу, так и на течение и исходы беременности [1—3]. В работах, посвященных репродуктологии, выявлено отсутствие вирусной РНК SARS-CoV-2 в фолликулярной жидкости (ФЖ) или вагинальных выделениях женщин, инфицированных SARS-CoV-2 [4, 5]. В 2021 г. было проведено исследование, выявившее специфические антитела к вирусу не только в сыворотке крови, но и в фолликулах яичников после перенесенной инфекции или вакцинации [6], при этом вопрос неблагоприятного воздействия COVID-19 на функцию фолликулов до сих пор остается открытым.
Метаболомные исследования ФЖ женщин, инфицированных SARS-CoV-2, представляют большой потенциальный научный и практический интерес. Многие вопросы, связанные с метаболическими путями заболевания COVID-19, еще предстоит решить. Инфекция, вызванная SARS-CoV-2, не полностью изучена на уровне клеточных метаболитов [7—9].
ФЖ является важным компонентом роста и развития фолликула и состоит из многих веществ, секретируемых гранулезными и тека-клетками, и транссудатом из кровяного русла. Изменения ФЖ влияют на развивающийся ооцит [10], его созревание, последующее развитие раннего эмбриона и потенциал для его имплантации [11, 12]. В настоящее время известно, что пациенты с тяжелым течением COVID-19 подвержены воздействию на организм «цитокинового шторма», который вызывает системный воспалительный ответ и может оказывать повреждение любых органов и систем, включая и репродуктивную [13, 14]. Следовательно, изменения в составе плазмы могут отражаться и в составе ФЖ. Кроме того, ряд биологически активных веществ, выбрасываемых при воспалении, модулирует метаболизм липидов [15], что указывает на возможную связь между тяжестью течения COVID-19, обнаружением определенных метаболитов и исходом вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ).
Цель исследования — изучение особенностей аминокислотного профиля фолликулярной жидкости и оценка результатов программы ВРТ у женщин, проходящих лечение по программе ВРТ после перенесенного COVID-19 для выявления биомаркеров с диагностическим потенциалом.
Материал и методы
В работе были задействованы образцы фолликулярной жидкости, собранные у 237 женщин.
Данные о перенесенном COVID-19 получали со слов пациенток, подтверждали информацией, внесенной в единый государственный информационный регистр, и дополнительным определением уровня IgG к SARS-CoV-2 в сыворотке крови выше индекса позитивности (ИП). Критерием легкой формы COVID-19 была субфебрильная температура (<38 °C) при отсутствии клинических проявлений среднетяжелого течения инфекции. В качестве критериев среднетяжелой формы COVID-19 учитывали наличие температуры выше 38 °C, одышки при физической нагрузке, признаков пневмонии с минимальным или средним объемом поражения легких (КТ 1—2), отсутствие клинических проявлений тяжелого течения инфекции.
Для определения антител к SARS-CoV-2 в сыворотке крови использовали «Набор реагентов для выявления антител класса G к spike-белку SARS-CoV-2 методом иммуноферментного анализа» («ДС-ИФА-АНТИ-SARS-CoV-2-G(S)») производства НПО «Диагностические системы» (Россия), предназначенный для качественного выявления антител в сыворотке (плазме) крови человека методом иммуноферментного анализа (ИФА). Результат анализа оценивали по величине ИП, рассчитанного по формуле: ИП=ОП образца/Cut-off, где ОП образца — значение оптической плотности образца. Результат считался положительным при значении ИП >1,2, отрицательным при значении ИП <0,8, сомнительным (неопределенным) при значении ИП в диапазоне от 0,8 до 1,2.
Овариальная стимуляция проводилась в рамках протокола с использованием антагонистов гонадотропин-рилизинг гормона (антГнРГ), рекомбинантного ФСГ (рФСГ) и/или препаратов, содержащих лютеинизирующий гормон (ЛГ): комбинированного препарата рФСГ/рЛГ или человеческого менопаузального гонадотропина (чМГ). Группе пациентов с COVID-19 в анамнезе овариальную стимуляцию проводили в среднем через 6 (от 2 до 9) мес после заболевания. Дозу гонадотропинов подбирали индивидуально с учетом возраста, параметров овариального резерва и анамнеза. Введение гонадотропинов выполняли со 2—3-го дня менструального цикла. Ежедневное введение антГнРГ проводили по достижении диаметра лидирующего фолликула 14 мм и до дня введения триггера овуляции (включительно), когда диаметр лидирующего фолликула достигал 19 мм. Триггером овуляции был выбран хорионический гонадотропин человека (ХГЧ) (8000—10 000 МЕ), вводимый однократно или комбинацию ХГЧ с агонистом гонадотропин-рилизинг гормона (аГнРГ). Трансвагинальную пункцию (ТВП) фолликулов проводили спустя 36 ч после введения триггера овуляции под контролем ультразвукового исследования (УЗИ).
Оценку аспирированной фолликулярной жидкости эмбриолог осуществлял с использованием стереомикроскопа. Определялось число полученных ооцит-кумулюсных комплексов (ОКК), степень их зрелости оценивалась после проведения денудирования ооцитов. Параллельно проводилось центрифугирование, флотирование и обработка спермы партнера. Оплодотворение всех зрелых ооцитов осуществлялось с помощью метода эктракорпорального оплодотворения (ЭКО) или интрацитоплазматической инъекции сперматозоида в ооцит (ИКСИ). Нормальное оплодотворение регистрировали по наличию двух симметричных по размеру пронуклеусов в цитоплазме через 16—18 ч после оплодотворения. После оплодотворения зиготы переносились в культуральную среду (COOK, Австралия) для дальнейшего культивирования. Через 120—122 ч (на 5-е сутки) культивирования проводилась морфологическая оценка эмбрионов с учетом морфологических характеристик эмбрионов по классификации Гарднера: степени зрелости бластоцист, качества трофэктодермы и внутриклеточной массы.
На 5-е сутки культивирования осуществляли перенос одного или двух эмбрионов в полость матки с использованием мягкого катетера в стимулированном цикле. Для поддержки посттрансферного периода назначалось вагинальное введение микронизированного прогестерона (600 мг в день) или пероральный прием дидрогестерона (30 мг в день).
Наступление беременности определялось по сывороточному уровню β-ХГЧ через 14 дней после переноса эмбрионов в полость матки. При уровне β-ХГЧ, превышающем 20 МЕ/л, тест на беременность считали положительным. Через 21 день после переноса эмбрионов при визуализации плодного яйца в полости матки с помощью УЗИ регистрировали клиническую беременность.
В работе был использован стандартный набор и масс-спектрометрический протокол компании JASEM (Турция) для пробоподготовки образцов плазмы и последующего анализа 44 аминокислот. Набор содержит две различные калибровочные смеси лиофилизированных аминокислот, смесь внутренних стандартов, лиофилизированную смесь для контроля качества анализа, подвижные фазы A и B, т.н. Реагент-1 (кат. №JSM-CL-503), используемый при пробоподготовке образцов ФЖ, а также колонку для высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) аминокислот JASEM (кат. №JSM-CL-575).
Для приготовления к исследованию образцов ФЖ к 50 мкл плазмы добавляли 50 мкл раствора смеси внутренних стандартов, перемешивали на вортексе в течение 5 с, добавляли 700 мкл Реагента-1, перемешивали повторно 15 с, центрифугировали 3 мин со скоростью 3000 об./мин, после чего переносили надосадочную жидкость в виалу. Подготовка и хранение анализируемых образцов и вспомогательных растворов производились в соответствии с руководством JASEM.
Анализ образцов осуществляли с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (Agilent 1290 Infinity II) с масс-спектрометрическим детектированием (ЖХ/МС) (Agilent 6470 А).
Транзитные переходы между родительскими ионами и дочерними фрагментами для мониторируемых аминокислот, соответствующие им хроматографические времена удержания, концентрации внутренних стандартов, а также сведения о чувствительности и воспроизводимости анализа приведены в руководстве JASEM.
Сравнительный анализ аминокислотного профиля фолликулярной жидкости в зависимости от принадлежности к группе по анамнезу SARS-COV-2 производился с использованием теста Манна—Уитни для попарного сравнения групп и теста Крускалла—Уоллиса для одновременного сравнения групп. Порог значимости определялся равным 0,05. Численное описание уровней приводилось в формате «медиана (1-й квартиль; 3-й квартиль)». Модели для определения наступления беременности и для определения угрозы выкидыша строились на основе логистической регрессии, которая, учитывая взаимодействие между переменными, имела вид
,
где в качестве независимых переменных дан вектор, содержащий независимые переменные вида Ii, Ii * Ij, Ii * Ii, где Ii — значение i-го маркера (интенсивность пика аминокислоты), β — вектор коэффициентов.
Выбор переменных осуществлялся прямым последовательным выбором переменных до 9 маркеров включительно с оптимальной длиной, исходя из усредненного значения площади под операционной кривой, вычисленной в ходе кросс-валидации с 100 циклами и разбиением данных с отношением «тренировка»/»тест» 9/1. После этого производилось поэтапное исключение переменных, пока вероятность равенства нулю коэффициентов каждой из них не составляло меньше 0,05 с использованием кросс-валидации с 1000 циклами и разбиением данных с отношением «тренировка»/»тест» 9/1. Итоговые чувствительность, специфичность, пороговые значения определялись как усредненные значения, вычисленные в ходе кросс-валидации с разбиением данных.
Для аминокислот, характеризующих различия группами, различными по анамнезу и аминокислот-маркеров, задействованных в моделях, была проведена оценка их вовлеченности в метаболические пути, исходя из гипергеометрического теста с коррекцией по Бенджамини—Хохбергу, средствами MetaboAnalyst и библиотеки KEGG. Влияние метаболического пути определялось оценкой вклада маркера в путь, исходя из топологического анализа и меры относительного посредничества. К путям, связанным с анамнезом или диагнозом статистически значимо, относились пути с корректированным значением p-value (false discovery rate, FDR) меньше 0,05 и значением влияния больше 0.
Результаты
Из исследуемых 237 женщин у 68 процедура ЭКО прошла успешно. Из них у 12 в течение первого триместра произошел выкидыш. У 103 пациенток не было подтвержденной инфекции SARS-COV-2 (1-я группа — контроль), у 84 (2-я группа — основная) — диагностированный SARS-COV-2 протекал в легкой форме (1-я подгруппа), у 50 — диагностированный SARS-COV-2 протекал в тяжелой форме (2-я подгруппа) (табл. 1).
Таблица 1. Распределение результатов ЭКО между группами с различиями по анамнезу SARS-COV-2
| Результат ЭКО | Легкая форма SARS-COV-2, n | Тяжелая форма SARS-COV-2, n | Нет SARS-COV-2, n |
| Нет наступления беременности | 63 | 33 | 73 |
| Беременность наступила, роды | 18 | 11 | 27 |
| Беременность наступила, выкидыш | 3 | 6 | 3 |
На первом этапе работы был проведен анализ аминокислотного профиля фолликулярной жидкости всех пациенток, вошедших в исследование и осуществлен статистический анализ со стратификацией образцов в зависимости от перенесенного пациенткой в анамнезе COVID-19.
Было получено 20 аминокислот со статистически значимыми изменениями уровня в фоликулярной жидкости при наличии COVID-19 в анамнезе. Тест Крускалла—Уоллиса показал различия у 20 аминокислот между группами с различным анамнезом по COVID-19 (табл. 2, рис. 1 и далее на цв. вклейке).
Таблица 2. Аминокислоты со статистически значимой разницей в уровне при наличии COVID-19 в анамнезе
| Аминокислоты | Был COVID-19 | Нет COVID-19 | p |
| Лизин | 3,53e4 (1,98e4; 6,45e4) | 2,76e4 (1,64e4; 5,69e4) | 0,03 |
| Глицин | 1,71e4 (1,29e4; 2,26e4) | 2,09e4 (1,5e4; 2,63e4) | 0,002 |
| Аспарагин | 1,06e3 (6,45e2; 2,25e3) | 2,03e3 (9,04e2; 3,01e3) | <0,001 |
| Серин | 2,66e3 (1,89e3; 4,87e3) | 4,81e3 (2,32e3; 6,78e3) | <0,001 |
| Цитруллин | 5,81e3 (4,5e3; 9,87e3) | 9,28e3 (6,12e3; 1,19e4) | <0,001 |
| Аланин | 7,37e4 (5,62e4; 1,12e5) | 9,86e4 (7,4e4; 1,25e5) | <0,001 |
| Треонин | 4,57e3 (3,07e3; 8,14e3) | 7,87e3 (4,74e3; 1,04e4) | <0,001 |
| Аминобутириновая кислота | 4,99e3 (3,34e3; 8,3e3) | 7,27e3 (4,55e3; 1,14e4) | <0,001 |
| Глутамин | 3,46e4 (2,59e4; 8,44e4) | 7,76e4 (3,74e4; 9,44e4) | <0,001 |
| Тирозин | 3,2e3 (1,76e3; 9,55e3) | 8,94e3 (3,14e3; 1,18e4) | <0,001 |
| Валин | 1,09e4 (8,38e3; 1,88e4) | 1,91e4 (1,06e4; 2,53e4) | <0,001 |
| Гистидиин | 3,78e4 (3,31e4; 4,37e4) | 4,05e4 (3,64e4; 4,79e4) | 0,004 |
| Метионин | 2,39e3 (1,5e3; 3,64e3) | 3,63e3 (2,07e3; 4,56e3) | <0,001 |
| Лейцин | 4e4 (2,94e4; 6,77e4) | 6,67e4 (3,92e4; 9,29e4) | <0,001 |
| Транс-4-OH-Пролин | 3,99e4 (2,9e4; 7,69e4) | 7,84e4 (3,99e4; 1,06e5) | <0,001 |
| Триптофан | 5,02e3 (3,34e3; 1,28e4) | 1,21e4 (4,97e3; 1,47e4) | <0,001 |
| Фенилаланин | 4,26e3 (3,06e3; 9,33e3) | 9,81e3 (4,32e3; 1,18e4) | <0,001 |
| Цистин | 9,28e2 (5,19e2; 2,54e3) | 2,79e3 (8,79e2; 3,88e3) | <0,001 |
| Аспарагиновая кислота | 6,63e3 (5,13e3; 1,26e4) | 1,26e4 (6,23e3; 1,79e4) | <0,001 |
| Глутаминовая кислота | 8,12e4 (5,92e4; 1,36e5) | 1,34e5 (7,74e4; 1,82e5) | <0,001 |
Рис. 1. Уровни аминокислот со статистически значимой разницей в уровне при наличии COVID-19 в анамнезе.
Далее была проведена оценка изменения уровня аминокислот в зависимости от тяжести заболевания в подгруппах легкого и тяжелого течения COVID-19 и контроля (табл. 3, рис. 2).
Таблица 3. Уровни аминокислот, характеризующих различия в составе фоликулярной жидкости между различными категориями анамнеза по COVID-19
| Аминокислота | Не болели | Легкая форма | Тяжелая форма | p |
| Лизин | 2,76e4 (1,64e4; 5,69e4) | 3,27e4 (1,89e4; 5,82e4) | 4e4 (2,57e4; 7,22e4) | 0,04 |
| Глицин | 2,09e4 (1,5e4; 2,63e4) | 1,71e4 (1,31e4; 2,29e4) | 1,73e4 (1,2e4; 2,2e4) | 0,006 |
| Аспарагин | 2,03e3 (9,04e2; 3,01e3) | 9,95e2 (6,4e2; 2,12e3) | 1,21e3 (7,03e2; 2,35e3) | <0,001 |
| Серин | 4,81e3 (2,32e3; 6,78e3) | 2,61e3 (1,86e3; 4,88e3) | 2,73e3 (1,91e3; 4,78e3) | <0,001 |
| Цитруллин | 9,28e3 (6,12e3; 1,19e4) | 5,77e3 (4,57e3; 9,02e3) | 6,21e3 (4,38e3; 1,1e4) | <0,001 |
| Аланин | 9,86e4 (7,4e4; 1,25e5) | 6,88e4 (5,6e4; 1,07e5) | 8,13e4 (5,64e4; 1,15e5) | 0,001 |
| Треонин | 7,87e3 (4,74e3; 1,04e4) | 4,77e3 (2,99e3; 8,08e3) | 4,56e3 (3,38e3; 8,17e3) | <0,001 |
| Аминобутириновая кислота | 7,27e3 (4,55e3; 1,14e4) | 5,03e3 (3,44e3; 8,3e3) | 4,85e3 (3,34e3; 8,33e3) | <0,001 |
| Глутамин | 7,76e4 (3,74e4; 9,44e4) | 3,46e4 (2,54e4; 8,57e4) | 3,44e4 (2,92e4; 8,1e4) | 0,001 |
| Тирозин | 8,94e3 (3,14e3; 1,18e4) | 2,99e3 (1,78e3; 8,71e3) | 3,24e3 (1,75e3; 1,01e4) | <0,001 |
| Валин | 1,91e4 (1,06e4; 2,53e4) | 1,12e4 (8,5e3; 1,75e4) | 1,05e4 (8,34e3; 2,15e4) | <0,001 |
| Гистидин | 4,05e4 (3,64e4; 4,79e4) | 3,73e4 (3,29e4; 4,2e4) | 3,84e4 (3,37e4; 4,5e4) | 0,007 |
| Метионин | 3,63e3 (2,07e3; 4,56e3) | 2,39e3 (1,5e3; 3,6e3) | 2,41e3 (1,51e3; 3,71e3) | <0,001 |
| Лейцин | 6,67e4 (3,92e4; 9,29e4) | 4e4 (2,95e4; 6,42e4) | 4,03e4 (2,95e4; 7,98e4) | <0,001 |
| Транс-4-OH-Пролин | 7,84e4 (3,99e4; 1,06e5) | 3,95e4 (2,91e4; 6,97e4) | 4,03e4 (2,95e4; 9,32e4) | <0,001 |
| Триптофан | 1,21e4 (4,97e3; 1,47e4) | 5,02e3 (3,35e3; 1,25e4) | 4,82e3 (3,3e3; 1,39e4) | <0,001 |
| Фенилаланин | 9,81e3 (4,32e3; 1,18e4) | 4,34e3 (3e3; 8,42e3) | 4,08e3 (3,21e3; 1,04e4) | <0,001 |
| Цистин | 2,79e3 (8,79e2; 3,88e3) | 9,06e2 (5,18e2; 2,4e3) | 9,3e2 (5,3e2; 3,08e3) | <0,001 |
| Аспарагиновая кислота | 1,26e4 (6,23e3; 1,79e4) | 7,06e3 (5,14e3; 1,19e4) | 6,22e3 (4,97e3; 1,31e4) | <0,001 |
| Глутаминовая кислота | 1,34e5 (7,74e4; 1,82e5) | 7,86e4 (5,88e4; 1,28e5) | 8,34e4 (6,15e4; 1,54e5) | <0,001 |
Рис. 2. Уровни аминокислот, характеризующих различия между группами с разным анамнезом по COVID-19.
Аминокислоты, характеризующие анамнез по COVID-19, оказывают статистически значимое влияние на метаболизм аланина, аспарата и глутамата, биосинтез аргинина, метаболизм гистидина, биосинтез фенилаланина, тирозина и триптофана, метаболизм д-глутамина и д-глутамата, метаболизм глиоксилата и дикарбоксилата, метаболизм фенилаланина (табл. 4, рис. 3).
Таблица 4. Включенность в метаболические пути аминокислот-маркеров наличия COVID-19 в анамнезе
| Путь | Всего | Маркеры | p | FDR | Влияние |
| Аминоацил-тРНК биосинтез | 48 | 15 | <0,001 | <0,001 | 0,00 |
| Метаболизм аланина, аспарата и глутамата | 28 | 5 | <0,001 | <0,001 | 0,53 |
| Биосинтез аргинина | 14 | 4 | <0,001 | <0,001 | 0,35 |
| Биосинтез валина, лейцина и изолейцина | 8 | 3 | <0,001 | 0,001 | 0,00 |
| Метаболизм гистидина | 16 | 3 | <0,001 | 0,009 | 0,22 |
| Биосинтез Фенилаланина, тирозина и триптофана | 4 | 2 | <0,001 | 0,009 | 1,00 |
| Метаболизм азота | 6 | 2 | 0,002 | 0,02 | 0,00 |
| Метаболизм Д-глутамина и Д-глутамата | 6 | 2 | 0,002 | 0,02 | 0,50 |
| Метаболизм глиоксилата и дикарбоксилата | 32 | 3 | 0,004 | 0,04 | 0,11 |
| Метаболизм фенилаланина | 10 | 2 | 0,005 | 0,04 | 0,36 |
| Биосинтез Пантотената и CoA | 19 | 2 | 0,02 | 0,13 | 0,00 |
| Метаболизм бета-Аланина | 21 | 2 | 0,02 | 0,15 | 0,00 |
| Метаболизм глутаотина | 28 | 2 | 0,04 | 0,23 | 0,11 |
| Метаболизм порфирина и хлорофила | 30 | 2 | 0,04 | 0,25 | 0,00 |
| Метаболизм цистеина и метионина | 33 | 2 | 0,05 | 0,26 | 0,10 |
| Метаболизм Глицина, серина и треонина | 33 | 2 | 0,05 | 0,26 | 0,25 |
| Распад Валина, лейцина и изолейцина | 40 | 2 | 0,07 | 0,34 | 0,00 |
| Биосинтез убиквинона | 9 | 1 | 0,09 | 0,44 | 0,00 |
| Метаболизм биотина | 10 | 1 | 0,10 | 0,46 | 0,00 |
| Метаболизм бутаноата | 15 | 1 | 0,15 | 0,61 | 0,00 |
| Метаболизм никотинатов и никотиамидов | 15 | 1 | 0,15 | 0,61 | 0,00 |
| Метаболизм селеновых соединений | 20 | 1 | 0,20 | 0,76 | 0,00 |
| Распад лизина | 25 | 1 | 0,24 | 0,89 | 0,00 |
| Метаболизм аргинина и пролина | 38 | 1 | 0,35 | 1,00 | 0,09 |
| Метаболизм пиримидинов | 39 | 1 | 0,35 | 1,00 | 0,00 |
| Метаболизм пиримидинов | 41 | 1 | 0,37 | 1,00 | 0,14 |
| Метаболизм тирозина | 42 | 1 | 0,37 | 1,00 | 0,14 |
| Первичный синтез желчных кислот | 46 | 1 | 0,40 | 1,00 | 0,01 |
| Метаболизм пуринов | 65 | 1 | 0,52 | 1,00 | 0,00 |
Рис. 3. График влияния на метаболические пути аминокислот-маркеров.
1 — метаболизм глиоксилата и дикарбоксилата; 2 — метаболизм гистидина.
При этом при попарном сравнении групп с использованием теста Манна—Уитни статистически значимые различия между группой здоровых пациентов и больных, перенесших легкую форму ковида, наблюдаются у 19 аминокислот (табл. 5), между группой здоровых пациентов и лиц, перенесших тяжелую форму ковида, у 19 аминокислот (табл. 6). Аминокислоты, характеризующие различия между легкой и тяжелой формой COVID-19, найдены не были.
Таблица 5. Уровни аминокислот, характеризующих различия между фолликулярной жидкостью у пациентов без COVID-19 в анамнезе и у пациентов, перенесших легкую форму COVID-19
| Аминокислота | Не болели | Легкая форма | p |
| Глицин | 2,09e4 (1,5e4; 2,63e4) | 1,71e4 (1,31e4; 2,29e4) | 0,02 |
| Аспарагин | 2,03e3 (9,04e2; 3,01e3) | 9,95e2 (6,4e2; 2,12e3) | <0,001 |
| Серин | 4,81e3 (2,32e3; 6,78e3) | 2,61e3 (1,86e3; 4,88e3) | <0,001 |
| Цитруллин | 9,28e3 (6,12e3; 1,19e4) | 5,77e3 (4,57e3; 9,02e3) | <0,001 |
| Аланин | 9,86e4 (7,4e4; 1,25e5) | 6,88e4 (5,6e4; 1,07e5) | <0,001 |
| Треонин | 7,87e3 (4,74e3; 1,04e4) | 4,77e3 (2,99e3; 8,08e3) | <0,001 |
| Аминобутириновая кислота | 7,27e3 (4,55e3; 1,14e4) | 5,03e3 (3,44e3; 8,3e3) | <0,001 |
| Глутамин | 7,76e4 (3,74e4; 9,44e4) | 3,46e4 (2,54e4; 8,57e4) | 0,001 |
| Тирозин | 8,94e3 (3,14e3; 1,18e4) | 2,99e3 (1,78e3; 8,71e3) | <0,001 |
| Валин | 1,91e4 (1,06e4; 2,53e4) | 1,12e4 (8,5e3; 1,75e4) | <0,001 |
| Гистидин | 4,05e4 (3,64e4; 4,79e4) | 3,73e4 (3,29e4; 4,2e4) | <0,001 |
| Метионин | 3,63e3 (2,07e3; 4,56e3) | 2,39e3 (1,5e3; 3,6e3) | <0,001 |
| Лейцин | 6,67e4 (3,92e4; 9,29e4) | 4e4 (2,95e4; 6,42e4) | <0,001 |
| Транс-4-OH-Пролин | 7,84e4 (3,99e4; 1,06e5) | 3,95e4 (2,91e4; 6,97e4) | <0,001 |
| Триптофан | 1,21e4 (4,97e3; 1,47e4) | 5,02e3 (3,35e3; 1,25e4) | <0,001 |
| Фенилаланин | 9,81e3 (4,32e3; 1,18e4) | 4,34e3 (3e3; 8,42e3) | <0,001 |
| Цистин | 2,79e3 (8,79e2; 3,88e3) | 9,06e2 (5,18e2; 2,4e3) | <0,001 |
| Аспарагиновая кислота | 1,26e4 (6,23e3; 1,79e4) | 7,06e3 (5,14e3; 1,19e4) | <0,001 |
| Глутаминовая кислота | 1,34e5 (7,74e4; 1,82e5) | 7,86e4 (5,88e4; 1,28e5) | <0,001 |
Таблица 6. Уровни аминокислот, характеризующих различия между фолликулярной жидкостью у пациентов без COVID-19 в анамнезе и у пациентов, перенесших тяжелую форму COVID-19
| Аминокислота | Не болели | Тяжелая форма COVID-19 | p |
| Лизин | 2,76e4 (1,64e4; 5,69e4) | 4e4 (2,57e4; 7,22e4) | 0,01 |
| Глицин | 2,09e4 (1,5e4; 2,63e4) | 1,73e4 (1,2e4; 2,2e4) | 0,003 |
| Аспарагин | 2,03e3 (9,04e2; 3,01e3) | 1,21e3 (7,03e2; 2,35e3) | 0,008 |
| Серин | 4,81e3 (2,32e3; 6,78e3) | 2,73e3 (1,91e3; 4,78e3) | 0,003 |
| Цитруллин | 9,28e3 (6,12e3; 1,19e4) | 6,21e3 (4,38e3; 1,1e4) | 0,02 |
| Аланин | 9,86e4 (7,4e4; 1,25e5) | 8,13e4 (5,64e4; 1,15e5) | 0,03 |
| Треонин | 7,87e3 (4,74e3; 1,04e4) | 4,56e3 (3,38e3; 8,17e3) | 0,008 |
| Аминобутириновая кислота | 7,27e3 (4,55e3; 1,14e4) | 4,85e3 (3,34e3; 8,33e3) | 0,004 |
| Глутамин | 7,76e4 (3,74e4; 9,44e4) | 3,44e4 (2,92e4; 8,1e4) | 0,004 |
| Тирозин | 8,94e3 (3,14e3; 1,18e4) | 3,24e3 (1,75e3; 1,01e4) | 0,007 |
| Валин | 1,91e4 (1,06e4; 2,53e4) | 1,05e4 (8,34e3; 2,15e4) | 0,01 |
| Метионин | 3,63e3 (2,07e3; 4,56e3) | 2,41e3 (1,51e3; 3,71e3) | 0,006 |
| Лейцин | 6,67e4 (3,92e4; 9,29e4) | 4,03e4 (2,95e4; 7,98e4) | 0,009 |
| Транс-4-OH-Пролин | 7,84e4 (3,99e4; 1,06e5) | 4,03e4 (2,95e4; 9,32e4) | 0,009 |
| Триптофан | 1,21e4 (4,97e3; 1,47e4) | 4,82e3 (3,3e3; 1,39e4) | 0,005 |
| Фенилаланин | 9,81e3 (4,32e3; 1,18e4) | 4,08e3 (3,21e3; 1,04e4) | 0,007 |
| Цистин | 2,79e3 (8,79e2; 3,88e3) | 9,3e2 (5,3e2; 3,08e3) | 0,003 |
| Аспарагиновая кислота | 1,26e4 (6,23e3; 1,79e4) | 6,22e3 (4,97e3; 1,31e4) | 0,001 |
| Глутаминовая кислота | 1,34e5 (7,74e4; 1,82e5) | 8,34e4 (6,15e4; 1,54e5) | 0,005 |
В качестве маркеров для прогнозирования результата ЭКО для пациентов без зарегистрированного COVID-19 были выбраны орнитин и аргинин (рис. 4). Полученная модель характеризуется точностью 67% (доверительный интервал (ДИ) 24—100%), чувствительностью 85% (ДИ 46—100%), специфичностью 69% (ДИ 30—100%) при пороговом значении 0,29 (0,12—0,48) (табл. 7).
Рис. 4. Уровни аминокислот-маркеров успеха ЭКО в случае отсутствия COVID-19 в анамнезе.
Таблица 7. Переменные модели, использованные для определения успеха ЭКО в случае отсутствия COVID-19 в анамнезе
| Переменная | Коэффициент β (ДИ β) | Критерий Вальда | p |
| Свободный член | –7,11 (–9,36— –4,86) | 6,32 | <0,001 |
| Орнитин | 7,16e-4 (4,87e-4—9,46e-4) | 6,24 | <0,001 |
| Аргинин | 1,39e-4 (6,04e-5—2,18e-4) | 3,53 | <0,001 |
| Орнитин * Аргинин | –1,60e-8 (–2,27e-8— –9,28e-9) | 4,76 | <0,001 |
В качестве маркеров для прогнозирования результата ЭКО для пациентов, перенесших легкую форму COVID-19, были выбраны метионин, серин, цитрулин, лейцин, лизин. Полученная модель характеризуется точностью 72% (ДИ 25—100%), чувствительностью 88% (ДИ 45—100%), специфичностью 76% (ДИ 35—100%) при пороговом значении 0,31 (0,01—0,83) (табл. 8).
Таблица 8. Переменные модели, использованные для определения успеха ЭКО в случае наличия легкой формы COVID-19 в анамнезе
| Переменная | Коэффициент β (ДИ β) | Критерий Вальда | p |
| Свободный член | 1,15 (–9,55e-1—3,25) | 1,09 | 0,14 |
| Метионин | –2,78e-3 (–5,12e-3— –4,51e-4) | 2,39 | 0,008 |
| Серин | 9,38e-3 (6,79e-3—1,20e-2) | 7,23 | <0,001 |
| Цитрулин | –3,89e-3 (–5,19e-3— –2,58e-3) | 5,96 | <0,001 |
| Метионин * Лейцин | 4,49e-7 (3,14e-7—5,85e-7) | 6,63 | <0,001 |
| Метионин * Серин | –4,80e-6 (–6,07e-6— –3,52e-6) | 7,53 | <0,001 |
| Метионин * Цитрулин | –5,17e-7 (–8,91e-7— –1,43e-7) | 2,76 | 0,003 |
| Лизин * Серин | –1,22e-7 (–1,58e-7— –8,47e-8) | 6,59 | <0,001 |
| Лизин * Цитрулин | 5,38e-8 (3,84e-8—6,93e-8) | 6,97 | <0,001 |
| Серин * Цитрулин | 9,20e-7 (5,26e-7—1,31e-6) | 4,67 | <0,001 |
| Лейцин * Лейцин | –1,11e-8 (–1,47e-8— –7,56e-9) | 6,23 | <0,001 |
В качестве маркеров для прогнозирования результата ЭКО для пациентов, перенесших тяжелую форму COVID-19, были выбраны гистидин, треонин, метионин, орнитин (рис. 5). Полученная модель характеризуется точностью 71% (ДИ 8—100%), чувствительностью 99% (ДИ 98—100%), специфичностью 81% (ДИ 47—100%) при пороговом значении 0,39 (0,01—0,79) (табл. 9).
Рис. 5. Уровни аминокислот-маркеров успеха ЭКО в случае тяжелой формы COVID-19 в анамнезе.
Таблица 9. Переменные модели, использованные для определения успеха ЭКО в случае наличия тяжелой формы COVID-19 в анамнезе
| Переменная | Коэффициент β (ДИ β) | Критерий Вальда | p |
| Свободный член | –3,04e1 (–4,53e1— –1,55e1) | 4,07 | <0,001 |
| Гистидин | 9,19e-4 (4,38e-4—1,40e-3) | 3,82 | <0,001 |
| Треонин | –6,04e-4 (–1,16e-3— –4,33e-5) | 2,15 | 0,01 |
| Метионин | –4,15e-3 (–6,52e-3— –1,78e-3) | 3,50 | <0,001 |
| Орнитин | 2,68e-3 (1,37e-3—4,00e-3) | 4,07 | <0,001 |
| Гистидин * Треонин | 1,72e-8 (5,74e-9—2,87e-8) | 3,00 | 0,001 |
| Гистидин * Орнитин | –7,65e-8 (–1,18e-7— –3,46e-8) | 3,65 | <0,001 |
| Метионин * Орнитин | 2,52e-7 (5,96e-8—4,45e-7) | 2,62 | 0,004 |
Аминокислоты, характеризующие успех ЭКО, включены в пути биосинтеза аминоацил-тРНК, биосинтеза валина, лейцина и изолейцина, биосинтеза аргинина, метаболизма гистидина, метаболизма бета-аланина, метаболизма глутатиона, метаболизма глицина, серина и треонина, распада лизина, метаболизма цистеина и метионина, метаболизма аргинина и пролина (табл. 10, рис. 6).
Таблица 10. Включенность в метаболические пути аминокислот-маркеров результата ЭКО при наличии в анамнезе тяжелой формы COVID-19
| Путь | Всего | Маркеры | p | FDR | Влияние |
| Биосинтез аминоацил-тРНК | 48 | 3 | <0,001 | <0,001 | 0,00 |
| Биосинтез валина, лейцина и изолейцина | 8 | 1 | 0,02 | 0,85 | 0,00 |
| Биосинтез аргинина | 14 | 1 | 0,04 | 0,85 | 0,06 |
| Метаболизм гистидина | 16 | 1 | 0,04 | 0,85 | 0,22 |
| Метаболизм бета-аланина | 21 | 1 | 0,05 | 0,87 | 0,00 |
| Метаболизма глутатиона | 28 | 1 | 0,07 | 0,87 | 0,00 |
| Метаболизм глицина, серина и треонина | 33 | 1 | 0,08 | 0,87 | 0,00 |
| Метаболизм цистеина и метионина | 33 | 1 | 0,08 | 0,87 | 0,10 |
| Метаболизм аргинина и пролина | 38 | 1 | 0,09 | 0,88 | 0,11 |
Рис. 6. График влияния на метаболические пути аминокислот-маркеров результата ЭКО.
Обсуждение
При анализе полученных результатов в двух группах (основная и контроль) было выявлено статистически значимое изменение 20 аминокислот. Однако при прицельном рассмотрении изменения уровня общего спектра аминокислот было выявлено увеличение относительной концентрации в группе с COVID-19 только для незаменимой аминокислоты Лизин. Тогда как все остальные аминокислоты относились к заменимым и уровень их в группе пациенток, перенесших COVID-19, снижался.
Исследования на экспериментальных животных показали, что Лизин обладает противовирусным действием, а его снижение может приводить к развитию иммунодефицитных состояний. Также стоит отметить такую важную функцию данной незаменимой аминокислоты, как снижение уровня триглицеридов в крови.
Среди аминокислот, продемонстрировавших свое снижение в группе пациенток, перенесших COVID-19, наибольший уровень падения относительной концентрации был зафиксирован у таких заменимых аминокислот, как глутаминовая кислота, аспарагиновая кислота, цистин и тирозин.
Объединяющим данные аминокислоты является их участие в нейромедиаторной передаче сигнала, вовлечение в процессы обучения и памяти. Предшественником тирозина является L-ДОФА, участвующая в снижении скорости синтеза нейромедитора дофамина и гормонов щитовидной железы. G. Mpekoulis и соавт. в своем исследовании 2021 г. опирались на то, что L-ДОФА-декарбоксилаза (DDC) является наиболее значительно коэкспрессируемым геном с ACE2, который кодирует ангиотензинпревращающий фермент 2 рецептора SARS-CoV-2 и интерферон-индуцируемую укороченную изоформу dACE2. Они показали связь экспрессии данных генов в ткани носоглотки, инфицированной SARS-CoV-2 и организованным противовирусным ответом инфицированного хозяина [16]. Снижение данных функций, включающих нарушение передачи возбуждения на уровне синаптической передачи, можно объединить в симптомокомплекс, известный как «постковидный синдром» [17, 18].
Описанные закономерности отражают общность метаболических процессов в организме. Перенесенная вирусная инфекция способна влиять на аминокислотный профиль практически всех структур и органов, в том числе проявляя свой отпечаток и в репродуктивном тракте.
Однако особый интерес представляло изучение метаболического профиля у данной когорты пациенток в зависимости от тяжести перенесенного вирусного заболевания. Так, после тяжелого течения COVID-19 мы также отмечали повышение относительной концентрации Лизина на фоне снижения Аминобутириновой кислоты (или гамма-аминомасляная кислота, ГАМК). ГАМК является биогенным амином, восстанавливает процессы метаболизма в головном мозге, способствует утилизации глюкозы мозгом и удалению из него токсических продуктов обмена, обеспечивает нормализацию динамики нервных процессов в головном мозге. Повышает продуктивность мышления, улучшает память, оказывает мягкое психостимулирующее действие, благоприятно влияет на восстановление движений и речи после нарушения мозгового кровообращения.
Способствует снижению и стабилизации повышенного АД и уменьшению субъективных симптомов артериальной гипертензии (головокружение, нарушение сна). ГАМК — ингибитор медиатора центральной нервной системы с потенциальными точками приложения, такими как болезнь Альцгеймера, Паркинсона, бессонница, нарколепсия, эпилепсия и пр. В 2007 г. ГАМК-ергическая система была обнаружена в эпителии дыхательных путей. M. Masoodi и соавт. наглядно продемонстрировали в своем исследовании, что метаболические сигнатуры плазмы крови специфически отличали тяжелый COVID-19 от пациентов контрольной группы. Выявленные метаболические признаки указывали на отчетливые изменения как липидного, так и аминокислотного метаболизма при COVID-19 по сравнению с плазмой контрольного пациента. Анализы, основанные на системной биологии, выявили метаболизм сфинголипидов, триптофана, тирозина, глютамина, аргинина и арахидоновой кислоты как наиболее затронутые пути у пациентов с COVID-19. Примечательно, что ГАМК была значительно снижена у пациентов с COVID-19, а уровни ГАМК в плазме позволили стратифицировать пациентов с COVID-19 с высокой чувствительностью и специфичностью. Данные показывают серьезные метаболические нарушения у пациентов с COVID-19 и предполагают использование ГАМК в качестве потенциального биомаркера и терапевтической мишени для инфекции [19].
После получения данных о влиянии тяжести перенесенного COVID-19 на аминокислотный профиль фолликулярной жидкости и связь данных изменений с общими патофизиологическими процессами в гомеостазе организма была создана прогностическая модель успеха ВРТ, в зависимости от тяжести COVID-19. В качестве маркеров для прогнозирования результата ЭКО для пациентов, перенесших тяжелую форму COVID-19, были выбраны гистидин, треонин, метионин, орнитин. Полученная модель характеризуется точностью 71% (ДИ 8—100%), чувствительностью 99% (ДИ 98—100%), специфичностью 81% (ДИ 47—100%) при пороговом значении 0,39 (0,01—0,79). Полученная модель включает разнонаправленное действие аминокислот при неудаче ВРТ — снижение гистидина и треонина на фоне повышения метионина и орнитина. Снижение гистидина и треонина, вероятно, может быть обусловлено истощением запасов данных незаменимых аминокислот за время вирусной инфекции. Гистидин является предшественником биосинтеза гистамина (рост и восстановление тканей). Реакция декарбоксилирования гистидина приводит к высвобождению гистамина и запуску процессов воспаления. Треонин — это незаменимая аминокислота, участвующая в нейропередаче сигнала в головном мозге, входит в состав иммуных белков, необходима для процесса азотного метаболизма. В экспериментальных работах с птицами дефицит данной аминокислоты приводил к прекращению яйцекладки. S. Shams и соавт. исследовали уровень свободных аминокислот в плазме у пациентов с COVID-19 и в группе контроля и также сравнили уровни аминокислот у пациентов в критическом состоянии, поступивших в отделение интенсивной терапии (ОРИТ), с пациентами не находящимися в отделении интенсивной терапии, а также у выздоровевших пациентов. Среднее значение глутаминовой кислоты, серина, глицина, треонина, фенилаланина, лейцина, лизина, аланина, аргинина, аспарагиновой кислоты и орнитина было значительно выше в случаях с COVID-19, чем в контроле. Кроме того, средний уровень глютамина у пациентов был значительно ниже, чем у контрольной группы (443,89±254,31 против 651,73±107,38, PV<0,001). Низкий уровень глютамина и изолейцина наблюдался у большинства пациентов ОРИТ и умерших соответственно. Логистический регрессионный анализ показал низкий уровень изолейцина в качестве предиктора смертности (p=0,02, EXP (B) = 16,5 и 95% ДИ 1,48—183,07). Между уровнями некоторых аминокислот, ферментами печени в сыворотке крови и концентрацией натрия была выявлена положительная и значимая взаимосвязь. Также наблюдалась значительная, но отрицательная корреляция между уровнями гистидина, скоростью оседания эритроцитов и ферритином. Фенилаланин имел очень положительную связь с сывороточным прокальцитонином у пациентов (R2 = 0,534, PV=0,015). Исследования данного коллектива авторов показали изменение концентрации аминокислот в плазме у пациентов с COVID-19 и доказали, что эти изменения более выражены у пациентов в критическом состоянии [20].
На фоне истощения запасов данных аминокислот после перенесенного COVID-19 в модели прогноза успеха ВРТ в случае неудач было зарегистрировано обратнонаправленное повышение уровня метионина и орнитина. Вероятно, данное наблюдение можно объяснить запуском компенсаторных механизмов при восстановлении гомеостатических циклов в организме после перенесенной вирусной инфекции. Метионин — незаменимая аминокислота, обладающая липотропным действием, повышает содержание фосфолипидов, являющихся предшественниками арахидоновой кислоты. Орнитин является заменимой аминокислотой, участвующей в биосинтезе мочевины. Данная аминокислота — это промежуточный продукт на пути синтеза Аргинина (незаменимая аминокислота), выступающей в роли ключевого метаболита азотистого обмена (орнитиновый цикл), субстрата NO-синтаз. Также описан противовоспалительный эффект аргинина и его связь с увеличением процессов ангиогенеза.
Ключевыми метаболическими путями, ассоциированными с перенесенным COVID-19, стал путь метаболизма гистидина, а при прогнозе успеха ЭКО у данной когорты пациенток — орнитиновый цикл и аргинин.
Статистически значимая возможность влияния аминокислот с отличающимися между исследуемыми группами концентрациями на метаболизм гистидина может демонстрировать связь между путем превращения гистидина с его декарбоксилированием и образованием гистамина, и наступлением и удачным исходом беременности после COVID-19. Гистамин необходим для оплодотворения яйцеклетки. В результате активации релизинг-факторов повышается синтез NO в яйцеклетках [21], что способствует ее оплодотворению. Гистамин участвует в процессах имплантации, воздействуя на децидуальную оболочку матки [22], и плацентации путем регуляции кровотока в плаценте [23]. Гистамин играет одну из важных ролей в создании и поддержании иммунологического статуса, оптимального для вынашивания беременности. В экспериментальных работах на животных описана возможность влияния гистамина на подавление иммунного ответа типа Th1 и Th3, при активации ответа Th2 типа в тканях плаценты [23]. Таким образом, вероятно, нарушение регуляторного баланса воспалительного ответа в момент имплантации и ранней инвазии у пациенток, перенесших COVID-19, может быть определяющим патогенетическим механизмом в реализации репродуктивных неудач.
Аргинин метаболизируется через сложный и строго регулируемый набор путей, которые остаются не до конца изученными как на уровне всего организма, так и на клеточном уровне. К метаболической сложности добавляется тот факт, что ограниченная доступность аргинина может избирательно влиять на экспрессию специфических генов, большинство из которых сами участвуют в некоторых аспектах метаболизма аргинина. Снижение концентрации аргинина в результате изменений активности аргиназы могут избирательно изменять экспрессию определенных генов [24]. Нарушение экспрессии, ассоциированное с нарушением уровня аргинина в культивируемых клетках, известно уже более 40 лет [25]. На сегодняшний день установлено влияние аргинина на процессы регуляции и инициации экспрессии и транскрипции [26, 27]. Аргинин как субстрат используется несколькими метаболическими путями, большинство из которых функционирует в рамках одной и той же клетки. Аргинин также используется клетками иммунной системы, где NOS продуцирует NO для клеточного сигналинга или окислительных бактерицидных действий [28]. Аргинин может модифицировать гемостаз путем подавления коагуляции и активации фибринолиза. В настоящее время аргинин признан физиологически важным веществом для поддержания репродуктивной функции у мужчин и женщин [29].
В нашей предыдущей работе, посвященной изменению аминокислотного профиля в системе «мать—плод» при COVID-19, по данным анализа задействованности метаболических путей маркеров-аминокислот в венозной плазме крови матерей с COVID-19 обнаружено статистически значимое изменение биосинтеза аргинина, значимое изменение путей метаболизма d-глутамина и d-глутамата и метаболизма аланина, аспарата и глутамата. Изменения метаболических процессов путем нарушения необходимого соотношения аминокислот на территории плода могут быть связаны с репликацией вируса, воспалительной реакцией хозяина и изменениями энергетического метаболизма, нарушением регуляции экспрессии и транскрипции белковых молекул [30].
Заключение
Анализ задействованности аминокислот фолликулярной жидкости в метаболические пути у пациенток после перенесенного COVID-19 в прогностических моделях наглядно продемонстрировал связь влияния уровня аргинина и его метаболитов и успеха программ ВРТ. Аргинин имеет высокий функциональный приоритет в продукции NO, а следовательно, в патофизиологии эндотелиальной дисфункции, процессов регуляции ангиогенеза и модификации систем гемостаза.
Результаты исследования указывают на вероятное нарушение регуляторного баланса воспалительного ответа в момент имплантации и ранней инвазии у пациенток, перенесших COVID-19, что может быть определяющим патогенетическим механизмом в реализации репродуктивных неудач.
Можно предположить, что перенесенный COVID-19 в тяжелой форме накануне наступления беременности может влиять на ее исход. Учитывая разработанную прогностическую модель успеха ЭКО, определение аминокислотного профиля в фолликулярной жидкости у пациенток, вступивших в программу ВРТ после перенесенного COVID-19, может стать хорошим прогностическим инструментом для персонифицированного подхода к выбору прегравидарной подготовки у данной когорты пациенток.
Финансирование. Исследование выполнено при финансовой поддержке гранта РНФ №22-15-00232.
Участие авторов:
Концепция и дизайн исследования — Ломова Н.А., Долгушина Н.В., Стародубцева Н.Л.
Сбор и обработка материала — Ломова Н.А., Чаговец В.В.
Статистическая обработка — Токарева А.О., Чаговец В.В.
Написание текста — Долгушина Н.В., Стародубцева Н.Л., Франкевич В.Е.
Редактирование — Стародубцева Н.Л., Франкевич В.Е.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.