Введение
Пандемия COVID-19, вызванная коронавирусом тяжелого острого респираторного синдрома 2-го типа (SARS-CoV-2), с 2019 г. изменила мир, в котором мы живем. Общий уровень смертности, по данным ВОЗ, на 10.04.23 составил 6 893 190 человек (https://covid19.who.int).
РНК-вирусы имеют более высокую частоту мутаций по сравнению с ДНК-вирусами В связи с постоянной циркуляцией вирусов новые варианты появляются из-за селективного давления и продолжающейся репликации вируса в человеческой популяции [1]. Известно, что SARS-CoV-2 эволюционирует со скоростью ~1,1·10–3 замен на сайт в год [2]. Адаптивные мутации в вирусном геноме могут влиять на патогенность вируса (например, замена всего одной аминокислоты может способствовать уклонению от иммунной системы хозяина) [3]. В настоящее время во всем мире циркулируют многочисленные варианты, которые в конце 2020 г. ВОЗ предложила классифицировать следующим образом: варианты, вызывающие озабоченность (VOC), варианты, представляющие интерес (VOI), и варианты, находящиеся под наблюдением (VUM) [4—5].
Оригинальный штамм SARS-CoV-2 с течением времени эволюционировал, с тех пор было описано пять новых вызывающих озабоченность вариантов (VOC), включая Alpha (B.1.1.7), Beta (B.1.351), Gamma (P.1), Delta (B.1.617.2), и 26 ноября 2021 г. ВОЗ включила в эту классификацию Omicron (B.1.1.529) [6—7].
В июле 2022 г. в Российской Федерации были отменены ограничительные мероприятия, связанные с пандемией COVID-19, открыты наземные границы России с другими государствами. Уральский Федеральный округ (УрФО) и соседний Приволжский Федеральный округ (ПФО) являются одними из наиболее развитых индустриальных субъектов Российской Федерации, имеют большую плотность населения, высокую внешнюю и внутреннюю миграционную активность, что может способствовать активному распространению коронавирусной инфекции, появлению новых вариантов вируса SARS-CoV-2 благодаря его высокой мутационной изменчивости.
На сегодняшний день секвенирование остается одним из основных методов и играет важную роль в исследовании функций вируса, в разработке новых реагентов, методологий для прогнозирования или мониторинга масштабов заражения, для создания новых, более совершенных вакцин.
Материал и методы
Сбор образцов и данных
Образцы из носоглотки/ротоглотки были собраны в период с мая 2022 г. по декабрь 2022 г., подтверждены положительными результатами ПЦР РНК SARS-CoV-2 (значения Ct 6—28,3). Собранные пробы транспортированы в термоконтейнерах с охлаждающими элементами, после чего сразу же использованы для экстракции вирусных нуклеиновых кислот.
Выделение РНК и ОТ-ПЦР
Вирусную РНК экстрагировали из 1127 образцов набором «Рибо-Преп» («АмплиСенс», Россия) согласно инструкции производителя. Реакцию обратной транскрипции проводили с использованием комплекта «Реверта-L» («АмплиСенс», Россия) в соответствии с инструкцией производителя.
ПЦР
Праймеры к гену S были подобраны в соответствии с рекомендациями информационного бюллетеня для организаций Роспотребнадзора, осуществляющих секвенирование последовательностей геномов SARS-CoV-2 (приложение №9 к Приказу Роспотребнадзора от 19.02.21 №56 (в редакции Приказа Роспотребнадзора от 08.07.21 №377), они представлены в табл. 1.
ПЦР проводили в объеме 25 мкл. Реакционная смесь содержала 5 мкл готовой смеси 5X ScreenMix («Евроген», Россия), 30 нг кДНК, концентрацию определяли на спектрофотометре NanoDrop (Thermo Fisher Scientific, США) по соотношению поглощения на длинах волн 260 нм и 280 нм, прямого и обратного праймера по 0,2 мкМ («ДНК-Синтез», Россия).
Продукты ПЦР разделяли с помощью электрофореза в 1,5% агарозном геле в присутствии бромистого этидия и визуализировали с помощью УФ-излучения. Фрагменты ДНК вырезали из агарозного геля и очищали набором реактивов Cleanup Standard («Евроген», Россия).
Секвенирование
Для дифференциации геновариантов и выявления мутаций осуществляли секвенирование фрагментов гена S по методу Сэнгера. Реакцию секвенирования проводили набором BigDye Terminator v3.1 cycle sequencing kit (Applied Biosystems, США), праймеры, использованные в работе, представлены в табл. 1, очистку продуктов реакции проводили методом осаждения Ethanol/EDTA (Amresco, США) в соответствии с протоколом набора BigDye Terminator v3.1 cycle sequencing kit (Applied Biosystems, США). Очищенные ампликоны в объеме 10 мкл секвенировали на приборе Applied Biosystems 3500 series genetic Analyzer (Thermo Fisher Scientific, США).
Таблица 1. Последовательности праймеров, используемые в исследовании
| Протокол Университета Женевы | ||
| Название | Последовательность 5’—3’ | Длина праймера |
| R47 | CATATGAGTTGTTGACATGTTCAG | 24 |
| F47 | TATCAGGCCGGTAGCACAC | 19 |
| CACV_51_R | GAGGGAGATCACGCACTAAA | 20 |
| CACV_55_F | ATGGAACCATTACAGATGCTGTAG | 24 |
| Протокол ARTIC V4.1. | ||
| SARS-CoV-2_72_LEFT 2 | GTGATGTTCTTGTTAACAACTAAACGAAC | 29 |
| SARS-CoV-2_73_RIGHT 1 | ACCTAGTGATGTTAATACCTATTGGCA | 27 |
| SARS-CoV-2_76_LEFT 2 | GCTGATTATTCTGTCCTATATAATTCCGC | 29 |
| SARS-CoV-2_77_RIGHT | CACTGACACCACCAAAAGAACATG | 24 |
Биоинформационный анализ
Сборку и анализ данных фрагментного секвенирования осуществляли в программе UGENE и выравнивали относительно эталонной последовательности SARS-CoV-2 Wuhan-Hu-1 (NC_045512.2). Fasta-файл загружали в базу данных VGARus.
Перед множественным выравниванием геномные последовательности отфильтрованы по качеству в Python (версия 3.10.2) и выравнены на эталонную последовательность SARS-CoV-2 Wuhan-Hu-1 (NC_045512.2) в программе MEGA X.
Филогенетические деревья построены с помощью веб-инструмента Nextclade v. 213.0 относительно последовательности Wuhan-Hu-1 (NC_045512.2) [12].
Описательную статистику производили с применением языка программирования Python с использованием библиотек: pandas, matplotlib.
Результаты
Описание когорты больных COVID-19
Эпидемическая ситуация в части COVID-19 в мире на 2022 г. оставалось непростой: по данным ВОЗ, на начало мая было зарегистрировано 514 млн подтвержденных случаев COVID-19 и более 6 млн смертей [13]. К концу года (по состоянию на декабрь 2022 г.) во всем мире было зарегистрировано более 649 млн подтвержденных случаев COVID-19 и более 6,6 млн смертей [14].
Среди больных (n=903) в трех выбранных для исследования субъектах РФ большинство составляли женщины — 552 (61,00%), мужчин — 351 (39,00%) (p<0,05). Данные о занятости были доступны только для 324 человек, при этом значительную часть выборки составили пенсионеры — 174 (53,70%), работающих — 125 (38,58%), учащихся — 22 (6,79%), неработающих — 3 (0,93%).
Доля вакцинированных против COVID-19 больных составила n=285 (31,56%), из них женщин — 193 (67,72%), мужчин — 92 (32,28%) (p<0,05). Средний возраст заболевших привитых женщин — 58 лет, мужчин — 56 лет. Число лиц, не вакцинированных против новой коронавирусной инфекции, составило 618 (68,44%), из них женщин — 359 (58,09%), мужчин — 259 (41,75%), при этом средний возраст непривитых женщин — 52 года, мужчин — 42 года.
Анализ данных о клинической картине заболевания показал, что респираторные симптомы наблюдались в 80,06% случаев, или у 723 пациентов из 903 больных новой коронавирусной инфекцией, бессимптомное течение заболевания отмечено у 7 (0,78%) больных, у 136 (15,06%) больных клиническая форма заболевания была неизвестна, а у 13 (4,10%) пациентов выявлена внебольничная пневмония.
Генетические варианты SARS-CoV-2, циркулирующие в Свердловской и Челябинской областях, Пермском крае
Для анализа было взято 903 сиквенса, полученных в период с мая по декабрь 2022 г. На основе полученных данных с использованием библиотеки matplotlib были построены графики распределения частот геноварианта SARS-COV-2 для каждого субъекта РФ (Свердловской и Челябинской областей, Пермского края) во времени. Анализ графиков (рис. 1) показал, что в период с мая по сентябрь 2022 г. во всех трех субъектах РФ преобладала линия варианта Omicron BA.2 (клада 21L по номенклатуре Nextstrain), с октября по декабрь 2022 г. — варианты Omicron BA.4/BA.5 (клада 22A/22B по номенклатуре Nextstrain) постепенно вытесняли Omicron BA.2.
Рис. 1. Гистограммы частот геновариантов для Свердловской, Челябинской областей и Пермского края с мая 2022 г. по декабрь 2022 г. по данным национальной базы VGARus.
а — гистограмма частот для Свердловской области; б — гистограмма частот для Челябинской области; в — гистограмма частот для Пермского края.
Филогенетический анализ Nextclade объединил всемирную базу данных с нашими данными для каждого субъекта. Были идентифицированы пять различных филогенетических клад: 20I, 21L, 21K, 22B, 22D, краткое описание вариантов представлено в табл. 2.
Таблица 2. Краткое описание вариантов SARS-CoV-2
| Наименование | Классификация ВОЗ | Место обнаружения | Дата | Летальность | Трансмиссивность | Специфические мутации в RBD | Влияние вариантов на эффективность вакцины | ||
| ВОЗ | PANGOLIN | Nextstrain | |||||||
| Alpha | B.1.1.7 | 20I | VOC | Великобритания | Сентябрь 2020 | ↑ | ↑ | E484K, S494P, N501Y | Без снижения для Спутника V, Covaxin, BBIBP-CorV; снижение в 1,5—4,1 раза для CoronaVac; отсутствует / минимальное снижение (в 0—3,3 раза) для BNT162b2 [15] |
| Omicron | BA.1 | 21K | VOC | Южная Африка | Ноябрь 2021 | ↓ | ↑ | S371L, G446S, Q393R, G496S | Снижение нейтрализации антител [16—18] |
| BA.2 | 21L | VOC | Декабрь 2021 | ↓ | ↑ | S371F, T376A, D405N, R408S | |||
| BA.4/BA.5 | 22/22B | VOC | Январь 2022 / Февраль 2022 | ↓ | ↑ | L452R, F486V, R493Q | |||
| BA.2.75 | 22D | VOC | Индия | Май 2022 | ↓ | ↑ | 339H, G446S и N460K, R493Q | Снижение нейтрализации антител [19] | |
Клада 20I наблюдалась только в Челябинской области и была относительно ранней с точки зрения времени дивергенции в сравнении с остальными (рис. 2, 3). Наконец, клады 21L, 22В продемонстрировали наибольшее географическое разнообразие интродукции и наблюдались во всех трех субъектах РФ (см. рис. 2—4). В исследуемый период из ранних вариантов был идентифицирован только Alpha (20I), он составлял всего ~3%, остальная доля приходилась на Omicron (~97%).
Рис. 2. Филогенетическое дерево Nextclade образцов из когорты Свердловской области, наложенное на глобальный набор образцов.
Рис. 3. Филогенетическое дерево Nextclade образцов из когорты Челябинской области, наложенное на глобальный набор образцов.
Рис. 4. Филогенетическое дерево Nextclade образцов из когорты Пермского края, наложенное на глобальный набор образцов.
Обсуждение
Мутационный ландшафт варианта Omicron SARS-CoV-2
Учитывая тот факт, что любые мутации могут повлиять на взаимодействие вирусного RBD с рецептором хозяина, информация о мутациях играет ключевую роль при разработке новых терапевтических средств. Избирательность и сродство спайка к его основному рецептору, ACE2, остаются решающими факторами, определяющими контагиозность и вирулентность SARS-CoV-2. Стоит отметить, что контагиозность зависит не только от способности вируса связываться с рецептором, но и от способности накапливаться в эпителии верхних дыхательных путей, где происходит его первичная репродукция.
Выравнивание последовательностей с использованием алгоритма ClustalW в программе MEGA X показало, что наибольший интерес представляют результаты мутаций в RBD-области, поскольку они расположены близко или рядом с межфазной областью RBD S-белка, который тесно участвует в прикреплении вириона к рецептору ACE2. В основном распространенными мутациями в RBD-области были: G339D, S371F, S373P, S375F, T376A, D405N, R408S, R408I, K417N, N440K, L452R, S477N, T478K, E484A, E484Q, G485R, F486V,R493Q, Q498R, N501Y, Y505H (рис. 5).
Рис. 5. Наиболее распространенные мутации SARS-CoV-2 в RBD-области.
Линия BA.2
В 8 секвенированных последовательностях была обнаружена мутация в 484-м сайте, где произошла замена остатков глицина глутамином. Глутамин в своей структуре содержит карбоксамид (-CONH2), который может взаимодействовать с остатками ACE2 через карбонильные и аминогруппы, способные образовывать водородные связи и pi-pi-взаимодействия, мутация E484Q может приводить к образованию более стабильного комплекса ACE2-RBD по сравнению с мутацией E484K [9]. Мутация G485R, где нейтральный остаток аминокислоты глицина заменился положительно заряженным остатком аргинина, наблюдалась у нескольких изолятов вируса. Ранее было показано, что мутация G485R вызвала снижение вируснейтрализующей активности антител [8]. При проведении анализа мутаций в полученных нами последовательностях мы обнаружили, что вариант (R408I) в домене, связывающем рецептор (RBD), мутировал с положительно заряженного остатка аргинина на нейтральный и меньшего размера остаток изолейцина.
Линия ВА.5
Линии ВА.4/5 по сравнению с линией BA.2 содержали дополнительные мутации в RBD-области: замена лейцина аргинином в 452-й сайте увеличивает сродство вариантов ВА.4/5 за счет электростатической комплементарности [11]. Мутация F486V приводит к потере взаимодействия с гидрофобным карманом в hACE2, нарушается спайковое сродство к вирусному рецептору, в то время как мутация реверсии R493Q улучшила сродство рецепторов, так как данная мутация восстанавливает водородную связь с H34 и избегает отталкивания заряда K31, по-видимому имея противоположный эффект F486V [10].
Заключение
Фрагментное секвенирование по методу Сэнгера позволило оценить динамику геновариантов SARS-CoV-2, циркулирующих на территориях Свердловской, Челябинской областей и Пермского края, и выявить превалирование варианта Omicron в исследуемых регионах в период с мая по декабрь 2022 г., что соответствует данным по РФ. Доля субварианта Omicron BA.2 преобладала в период исследования с мая по сентябрь 2022 г.. Стремительное распространение субвариантов BA.4/BA.5 наблюдалось в период с октября по декабрь 2022 г. Анализ молекулярного сходства последовательностей SARS-CoV-2 показал присутствие нетипичных мутаций в некоторых образцах, а также увеличение числа мутаций между вариантами, в особенности в RBD-области. Аминокислотные замены привели к изменению конформации S-белка, что, в свою очередь, повысило аффинность связывания RBD с ACE2 и повлияло на более легкое течение заболевания и повышенную контагиозность по сравнению с более ранними вариантами SARS-CoV-2.
Финансирование. Работа выполнена по целевой субсидии в рамках федерального проекта «Санитарный щит — безопасность для здоровья (предупреждение, выявление, реагирование)», а также в рамках выполнения научно-исследовательской работы «Интегрированный подход к изучению эпидемиологических и молекулярно-генетических особенностей гриппа и ОРВИ при тяжелых клинических формах в период массовой вакцинопрофилактики» (рег. №121041500044-2).
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.