Введение

TLT (time lapse technology) — новый метод культивирования и отбора эмбрионов, основанный на круглосуточном наблюдении за эмбрионами в режиме реального времени.

При культивировании in vitro в стандартных инкубаторах эмбрионы обычно оценивают и отбирают по морфологическим критериям, которые включают в себя морфологию пронуклеусов (PN) и ядрышек, количество и размер бластомеров на конкретной стадии, фрагментацию, мультинуклеацию, экспандирование бластоцисты, внутреннюю клеточную массу (ICM) и внешний вид трофэктодермы (TE) [1]. Данные параметры оценивают в определенные моменты времени. Для этих целей эмбрион вынимают из обычного инкубатора, тем самым он подвергается колебаниям температуры, pH и уровня кислорода. Система time-lapse представляет собой инкубатор с одним или несколькими встроенными инвертированными микроскопами и цифровой камерой. Оптическая система также может быть встроена внутри стандартного инкубатора. Цифровые изображения собираются через равные короткие промежутки времени в разных плоскостях в течение всего периода инкубации эмбриона, а затем преобразуются в видео. Отсутствует необходимость в прерывании условий среды эмбрионов и их пребывании за пределами инкубатора. Кроме того, технология time-lapse позволяет осуществлять непрерывный мониторинг развивающихся эмбрионов в режиме реального времени и фиксировать морфокинетические события. Данная информация позволяет лучше спрогнозировать компетентность эмбриона. Например, показано, что имплантация эмбриона связана со специфическими параметрами времени деления клеток, и был введен термин «морфокинетика» [2]. Данные этих наблюдений можно собирать и анализировать с помощью специальных алгоритмов или программного обеспечения TLT, используя их в процессе отбора эмбрионов для переноса [3, 4]. Улучшенный подход к переносу одного качественного эмбриона может позволить снизить риск многоплодной беременности при сохранении показателя клинической беременности [5—7].

Таким образом, применение TLT обеспечивает возможность культивирования эмбрионов в стабильных оптимальных условиях и более качественный их отбор для успешного исхода применения вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ).

Цель обзора — изучить эффективность применения TLT в процессе культивирования, оценки и отбора эмбрионов по сравнению со стандартными методами культивирования и отбора при проведении процедур экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) или интрацитоплазматической инъекции сперматозоида (ИКСИ).

Материал и методы

В данный систематический обзор включены публикации об исследованиях, в которых проведена оценка эффективности применения TLT при переносе эмбрионов в программах ЭКО и ИКСИ за период 1998—2022 гг. Наш систематический обзор написан по чек-листу PRISMA.

PRISMA — это основанный на фактах минимальный набор элементов отчетности для написания систематических обзоров и метаанализов. PRISMA фокусируется на составлении отчетов об обзорах, оценивающих рандомизированные исследования, но также может использоваться в качестве основы для составления отчетов о систематических обзорах других типов исследований, в частности, оценок вмешательств. В анализ включены рандомизированные и нерандомизированные оригинальные клинические исследования (проспективные контролируемые, проспективные когортные, ретроспективные и т.д.) и исследования «серия случаев», которые включали минимум 10 пациентов. Рассматривались публикации только на английском языке. Для электронного поиска использованы следующие базы данных: PubMed, ClinicalTrials.gov и Cochrane Library. Ключевые слова: (Time-lapse) AND (ivf OR icsi), (Time-lapse) AND (reproductive outcomes) AND (pregnancy) AND (embryo), MeSH — медицинские предметные рубрики: («Time-Lapse Imaging»[Mesh]) AND «Fertilization in Vitro»[Mesh]. Два исследователя независимо друг от друга выполнили электронный поиск публикаций. Подходящие по названию исследования оценены по абстракту и полному тексту публикации. Исключены дубликаты. Скрининг публикаций в полном тексте проводился двумя исследователями независимо друг от друга для включения публикаций в качественный анализ. Любые разногласия в процессе отбора статей для качественного синтеза устранялись путем консенсуса после совместного обсуждения. Списки литературы подходящих исследований просмотрены с целью поиска дополнительной литературы. Данные из включенных исследований собирались независимо двумя авторами с использованием стандартной процедуры извлечения данных (авторы, год публикации, дизайн исследования, характеристика пациентов, вмешательство и исходы). Основной анализ данного систематического обзора направлен на оценку эффективности применения TLT при переносе эмбрионов в программах ЭКО и ИКСИ. Критериями включения для данного систематического обзора были: 1) пары с бесплодием с переносом эмбрионов в программах ЭКО и ИКСИ; 2) возраст женщин 18—50 лет. Статьи, в которых рассматривались пациенты с заболеваниями матки, гидросальпинксом, эндометриозом и привычным невынашиванием, исключены. Оценка предвзятости включенных исследований выполнена с использованием The Cochrane Handbook for Systematic Reviews of Interventions [8]. Два исследователя проводили оценку предвзятости независимо друг от друга согласно шкалам, рекомендованным обществом Cochrane. Разногласия в процессе оценки предвзятости устранялись путем консенсуса или с привлечением третьего автора. Для оценки риска систематической ошибки в рандомизированных контролируемых исследованиях использована шкала RoB2 [9], а в нерандомизированных исследованиях (проспективных контролируемых, проспективных когортных или ретроспективных исследованиях и др.) — шкала ROBINS-I [10].

Результаты

Поиск релевантных исследований в трех крупных базах данных выявил 442 статьи (рис. 1): 249 в PubMed, 152 в Cochrane Library, 41 в ClinicalTrial.gov. Исключено 87 статей, которые являлись дубликатами. Скринингу подверглись 355 статей, 306 из которых исключены по несоответствию заголовкам и аннотациям. Далее полнотекстовые версии 49 статей проанализированы на предмет соответствия критериям включения и исключения. После оценки полнотекстовых статей из них исключены: обзор — 1, отсутствие релевантных критериев включения — 17, абстракты конференций — 6, протоколы исследований — 13. Проведен ручной поиск ссылок (n=399) в подходящих статьях для выявления дополнительных исследований, которые могут представлять интерес. Из них 4 релевантных статьи соответствовали критериям включения и вошли в систематический обзор. Таким образом, 16 исследований использованы для качественного анализа: 9 рандомизированных исследований, 1 псевдорандомизированное исследование, 3 проспективных когортных исследования, 3 ретроспективных исследования (табл. 1—3) [4, 11—25].

Рис. 1. PRISMA Flow-диаграмма.

Таблица 1. Культивирование в инкубаторе time-lapse и стандартном инкубаторе, оценка и отбор эмбрионов по технологии time-lapse и морфологическим критериям

Таблица 2. Культивирование в инкубаторе time-lapse и стандартном инкубаторе, оценка и отбор эмбрионов по морфологическим критериям

Таблица 3. Культивирование в инкубаторе time-lapse, оценка и отбор эмбрионов по технологии time-lapse и по морфологическим критериям

В 6 исследованиях выполнено сравнение культивирования эмбрионов в инкубаторе time-lapse и стандартном инкубаторе (табл. 1). Оценка и отбор эмбрионов при этом в группе вмешательства проведены с помощью компьютерной программы или по специальному алгоритму с использованием параметров, полученных в инкубаторе time-lapse. В группе контроля эмбрионы оценивались и отбирались по морфологическим критериям. Статистически значимое увеличение (p<0,05) частоты клинической беременности при использовании инкубатора time-lapse обнаружено в четырех исследованиях [4, 11, 12, 15]. В отношении частоты живорождения в двух исследованиях [12, 15] показано статистически статистически значимое улучшение показателя в группе time-lapse.

В 9 исследованиях сравнивалось культивирование эмбрионов в инкубаторе time-lapse и стандартном инкубаторе, при этом оценка и отбор эмбрионов в обеих группах проводились по морфологическим критериям (табл. 2). В двух исследованиях [15, 20] показано статистически значимое увеличение частоты клинической беременности при использовании инкубатора time-lapse. В двух исследованиях [15, 23] увеличение частоты живорождения в группе вмешательства было статистически значимым. Однако в ретроспективном исследовании, выполненном M. Mascarenhas и соавт., не выявлена статистически значимая разница в частоте живорождения в двух группах [13].

Согласно Cochrane Handbook, рецензенты оценили риск систематической ошибки в каждом из включенных исследований с использованием RoB 2 для рандомизированных контролируемых исследований и ROBINS-I для нерандомизированных. Инструмент Rob 2 включает: риск систематической ошибки при процессе рандомизации; ошибку, связанную с отклонением от намеченного вмешательства; ошибку пропуска данных; ошибку измерения результатов, ошибку представления результатов.

Каждый пункт классифицирован как высокий, вызывающий некоторое беспокойство или указывающий на низкий риск систематической ошибки.

Инструмент ROBINS-I включает: ошибку конфаудинга; ошибку отбора участников исследования; ошибку классификации воздействий; ошибку, связанную с отклонением от намеченного вмешательства; ошибку пропуска данных; ошибку измерения результатов, ошибку представления результатов. Каждый пункт классифицирован как критический, серьезный или указывающий на низкий риск систематической ошибки.

Любые разногласия разрешались путем обсуждения. Инструменты визуализации созданы приложением ROBVIS [26]. Инструмент RoB 2 показал в основном низкий риск общей систематической ошибки для рандомизированных исследований (рис. 2).

Рис. 2. RoB2.0 для рандомизированных исследований.

Согласно инструменту ROBINS-I, общий риск систематической ошибки для нерандомизированных исследований был на границе между умеренным и серьезным (рис. 3).

Рис. 3. ROBINS-I для нерандомизированных исследований.

Обсуждение

На сегодняшний день инкубаторы time-lapse являются самым совершенным поколением инкубаторов, позволяющих методом покадровой съемки добиться культивирования эмбрионов in vitro без интервенции, сопровождающейся колебаниям температуры, pH и уровня кислорода [27]. При этом особенностью технологии time-lapse являются уникально разработанные морфокинетические параметры, позволяющие оценивать эмбрионы по специальному алгоритму [3].

I. Rubio и соавт., C. Siristatidis и соавт., A. Barrie и соавт., Y. Guo и соавт. обнаружили более высокие показатели клинической беременности и живорождения у пациенток, чьи эмбрионы контролировались с помощью инкубаторов time-lapse, по сравнению с теми, чьи эмбрионы контролировались с помощью стандартной морфологической оценки [4, 11, 12, 15].

В проспективном рандомизированном двойном слепом контролируемом исследовании I. Rubio и соавт. [4] включены 843 бесплодные пары, подвергшихся ИКСИ. В группе контроля использованы стандартные методы морфологической оценки, в группе вмешательства — TLT. При анализе цикла лечения частота продолжающейся беременности статистически значимо увеличилась на 51,4% (95% ДИ 46,7—56,0) в группе TLT по сравнению с 41,7% (95% ДИ 36,9—46,5) в группе контроля. Для частоты наступления беременности различия не были статистически значимыми: 61,6% (95% ДИ 56,9—66,0) по сравнению с 56,3% (95% ДИ 51,4—61,0). Результаты на перевод были схожими: статистически значимые различия в частоте продолжающихся беременностей 54,5% (95% ДИ 49,6—59,2) по сравнению с 45,3% (95% ДИ 40,3—50,4) и статистически незначимые в частоте наступления беременности на уровне 65,2% (95% ДИ 60,6—69,8) по сравнению с 61,1% (95% ДИ 56,2—66,1). Ранняя потеря беременности статистически значимо снижена в группе TLT на 16,6% (95% ДИ 12,6—21,4) по сравнению с 25,8% (95% ДИ 20,6—31,9). Частота имплантации статистически значимо увеличена на 44,9% (95% ДИ 41,4—48,4) по сравнению с 37,1% (95% ДИ 33,6—40,7). Так, согласно авторам, стратегия культивирования и отбора эмбрионов в интегрированной системе мониторинга EmbryoScope улучшает репродуктивные результаты в программах ВРТ.

Однако в Кокрейновском обзоре, опубликованном в 2019 г., авторы не обнаружили убедительных доказательств того, что TLT более или менее эффективен в отношении клинических исходов, чем обычные методы инкубации эмбрионов [28].

В нашем систематическом обзоре учитывались такие исходы, как частота наступления клинической беременности, живорождения и выкидышей, а также отмечено, что в ряде отдельных исследований оценено «качество» эмбрионов с точки зрения морфокинетики при использовании time-lapse алгоритмов отбора. В то же время выявлено статистически значимое увеличение частоты клинической беременности при применении time-lapse инкубатора и морфокинетической оценки по сравнению с обычным инкубатором, что обнаружено в четырех из пяти исследований.

Учитывая небольшой временной промежуток между первым исследованием (1998) и более современными, следует сказать о наличии значимой неоднородности, которая не позволяет составить метаанализ в данном систематическом обзоре. Еще одним ограничением данного обзора является большая вариабильность и разнородность оцениваемых критериев, применительно к которым их сравнение не целесообразно. Тем не менее следует отметить, что необходимо дальнейшее изучение алгоритмов time-lapse в морфокинетической оценке эмбрионов и проспективный пересмотр самих программ по их отбору. Кроме того, применение инкубаторов time-lapse для определения анеуплоидии является основной задачей для будущих исследований, поскольку наличие анеуплоидий является ведущим хромосомным фактором при перинатальных потерях на ранних сроках.

Выводы

Учитывая опыт клинического применения и научно-практические данные, можно отметить отсутствие единых морфологических критериев, позволяющих судить о качестве эмбрионов. Кроме того, не исследовано влияние внешних факторов, таких как колебания температуры, pH и уровня кислорода, при изъятии эмбрионов из инкубатора. Невозможно изолированно оценивать влияние покадровой съемки в инкубаторе на условно качественные эмбрионы, поскольку нет единых маркеров «дефектов». Помимо морфокинетических критериев, необходимо учитывать биохимические процессы, влияющие на морфологию эмбриона, которые также пока не изучены. Так, к примеру, мы можем судить о качестве пронуклеусов и ядрышек, внутренней клеточной массе косвенно, только за счет количественного показателя. Систематический обзор благодаря выбранной нами методологии помог суммировать клинические исследования, опубликованные на английском языке, и это позволило дать ответ на вопросы об эффективности применения time-lapse инкубаторов и использования time-lapse алгоритмов.

Таким образом, есть необходимость в проведении большего количества рандомизированных контролируемых исследований для клинической оценки наступления беременности и ранних перинатальных потерь, а также морфокинетических параметров.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Адамян Л.В.

Сбор и обработка материала — Пивазян Л.Г., Крылова Е.И., Обосян Л.Б., Саркисова А.И., Никифорова П.О.

Статистический анализ данных — Пивазян Л.Г., Крылова Е.И., Обосян Л.Б., Саркисова А.И., Никифорова П.О.

Написание текста — Пивазян Л.Г., Крылова Е.И., Обосян Л.Б., Саркисова А.И., Никифорова П.О.

Редактирование — Адамян Л.В., Пивазян Л.Г., Крылова Е.И., Обосян Л.Б., Саркисова А.И., Никифорова П.О.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.