Введение
При оценке эффективности выполняемого in vitro эмбриологического этапа экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) наиболее значимыми показателями являются процент получаемых качественных бластоцист от числа образованных зигот, а также частота так называемых «незавершенных» циклов. «Незавершенными» мы обозначаем те циклы, в которых не удается получить ни одной бластоцисты из-за остановки развития эмбрионов на разных сроках или все сформировавшиеся бластоцисты не отвечают характеристикам, позволяющим использовать их для переноса или криоконсервации.
На результаты эмбриологического этапа ЭКО потенциально могут оказывать влияние факторы, связанные с особенностями культивирования, определяемыми применяемой аппаратурой. Используя традиционные CO2 инкубаторы, морфологическая оценка оплодотворенных эмбрионов ограничивается несколькими дискретными моментами, что не позволяет получить полный объем информации о разных этапах развития эмбрионов [1].
В последние годы в практику эмбриологических лабораторий все более активно внедряют инкубаторы, использующие технологию time-lapse (TLT), суть которой заключается в возможности отслеживания морфокинетических параметров эмбриогенеза в режиме реального времени, не прибегая к нарушению условий, обеспечивающих постоянство среды в рабочей камере инкубатора [2, 3]. Преимуществом TLT-инкубаторов перед традиционными планшетными аналогами является удобство в применении, поскольку эмбриологам не приходится выполнять манипуляции, связанные с необходимым извлечением эмбрионов для оценки их качества [4, 5]. При этом пропускная способность TLT-инкубаторов существенно превышает (по нашим данным, в 2,5 раза) производительность традиционных инкубаторов. Исключение стресса для развивающихся эмбрионов, связанного с их извлечением из инкубатора, улучшает условия для эмбриогенеза, что служит увеличению частоты формирующихся качественных бластоцист и тем самым сокращает долю «незавершенных» циклов. В свою очередь, улучшение результатов эмбриологического этапа создает предпосылку и к улучшению исходов ЭКО, оцениваемых частотой наступления беременности (ЧНБ) [6, 7]. Это связано с тем, что при получении достаточного большого числа качественных бластоцист появляется возможность выбора для переноса тех из них, которые обладают наилучшими не только морфологическими (гарднеровскими), но и морфокинетическими характеристиками, которые учитывает искусственный интеллект, заложенный в программном обеспечении современных TLT-инкубаторов [8, 9].
Согласно многоцентровым исследованиям, проведенным в последние годы, качество бластоцисты вне зависимости от количества бластомеров, считается низким при наличии фрагментации эмбриона с оценкой «C» [10, 11].
При анализе эмбриогенеза на этапе культивирования in vitro следует принимать во внимание, что определяемые показатели могут зависеть не только от технических особенностей применяемых инкубаторов, но и от факторов, связанных с самой пациенткой. Так, хорошо известно, что на показатель ЧНБ оказывают негативное влияние:
— поздний репродуктивный возраст (старше 36 лет) [11, 12];
— бедный ответ на гонадотропины (созревание менее 3 фолликулов к моменту введения триггера овуляции) в цикле, в котором осуществляется культивирование эмбрионов [13, 14];
— повторные неудачи имплантации (≥3 безуспешных попыток ЭКО в анамнезе) [15—17].
Однако представляется неясным, насколько эти же факторы могут ухудшать наиболее важные показатели эмбриогенеза (т.е. снижать частоту качественных бластоцист и увеличивать частоту «незавершенных» циклов) при культивировании эмбрионов в обычных планшетных боксах и в инкубаторах с TLT-системой. Таким образом, ответ на этот вопрос мог бы наглядно продемонстрировать в какой степени использование TLT-инкубаторов вместо их традиционных планшетных аналогов позволяет улучшать показатели эмбриогенеза в когортах пациенток с наличием указанных факторов, негативно влияющих на исходы ЭКО. Данные наблюдения являются актуальными для получения более четкого представления о том, каким именно пациенткам в первую очередь следует рекомендовать для культивирования эмбрионов именно TLT-инкубаторы.
Цель работы — изучить влияние разных способов культивирования эмбрионов на частоту получаемых качественных бластоцист, частоту незавершенных циклов у пациенток позднего репродуктивного возраста, пациенток с бедным ответом на гонадотропины и пациенток с повторными неудачами имплантации.
Материал и методы
Для решения поставленных в исследовании задач были проанализированы результаты выращивания бластоцист с применением традиционной технологии и TLT-инкубатора (EmbrioSkope+ производства Vitrolife A/S, Denmark). При оценке зависимости показателей эмбриогенеза от использованной технологии культивирования определяли:
— частоту полученных качественных бластоцист (по классификации Гарднера с оценкой на уровне 2BB—6AA) от числа зигот;
— частоту «незавершенных» циклов, которые либо вообще не обеспечили получение ни одной бластоцисты (вследствие остановки развития эмбрионов на разных сроках), либо все полученные бластоцисты были плохого качества (по классификации Гарднера с оценкой ниже 2BB), что не допускало использования ни одной из них для переноса в матку в текущем цикле или для криоконсервации.
Перечисленные показатели эмбриогенеза определяли:
— в общем числе выполненных циклов культивирования эмбрионов: в 1563 циклах с использованием традиционной технологии (ТТ) и в 386 циклах с применением TLT-инкубатора;
— в циклах культивирования эмбрионов, полученных от женщин с хорошим прогнозом успеха ЭКО по показателю ЧНБ, т.е. пациенток младше 36 лет с адекватным ответом на гонадотропины и без повторных неудач имплантации в анамнезе: в 542 циклах с использованием ТТ и в 104 циклах с применением TLT-инкубатора;
— в циклах культивирования эмбрионов, полученных от женщин с бедным ответом на гонадотропины: в 383 циклах с использованием ТТ и в 122 циклах с применением TLT-инкубатора;
— в циклах культивирования эмбрионов, полученных от женщин с повторными неудачами имплантации: в 275 циклах с использованием ТТ и в 150 циклах с применением TLT-инкубатора;
— в циклах культивирования эмбрионов, полученных от женщин старше 36 лет: в 761 цикле с использованием ТТ и в 231 цикле с применением TLT-инкубатора.
Бедный ответ на гонадотропины констатировали при созревании не более 3 фолликулов к моменту введения триггера овуляции. Повторные неудачи имплантации по данным анамнеза подтверждали у женщин с 3 и более выполненными ранее безуспешными попытками ЭКО, сопровождавшимися переносом эмбрионов.
Собранный фактический материал обрабатывали с использованием методов вариационной статистики. Различия частот анализируемого признака при парных сравнениях считали достоверными при уровне значимости p<0,05.
Результаты
В общей (неселективной) популяции инфертильных женщин культивирование эмбрионов с использованием традиционного и TLT-инкубаторов (табл. 1) обеспечивало сопоставимые результаты получения качественных бластоцист, определяемых от числа полученных зигот (23,6 и 29,4%, p=0,352). Также в неселективной популяции пациенток с бесплодием применение традиционного и TLT-инкубаторов не сопровождалось статистически значимым различием по частоте «незавершенных» циклов, в которых не удавалось получить пригодные к переносу бластоцисты (18,7 и 15,5%, p=0,147).
Таблица 1. Результаты культивирования эмбрионов при применении традиционной технологии и TLT-инкубатора в общей (неселективной) популяции инфертильных женщин
| Параметры | Традиционное культивирование | Культивирование с применением TLT | p |
| Количество циклов | 1563 | 386 | — |
| % оплодотворения | 70,8 | 69,9 | 0,735 |
| Количество полученных зигот | 1107 | 270 | — |
| Количество полученных качественных бластоцист | |||
| абс. | 265 | 72 | — |
| % от числа зигот | 23,6 | 29,4 | 0,352 |
| Циклы, не сопровождавшиеся получением качественных бластоцист | |||
| абс. | 292 | 60 | — |
| % от числа всех циклов | 18,7 | 15,5 | 0,147 |
Как и в неселективной популяции, в когорте женщин с хорошим прогнозом успеха ЭКО применение TLT-инкубатора вместо традиционного культивирования (табл. 2) не приводило к достоверному увеличению качественных бластоцист, полученных из зигот (33,8 против 32%, p=0,861) и к уменьшению доли «незавершенных» циклов (8,7 против 9,4%, p=0,807). Аналогичная закономерность, т.е. отсутствие статистически подтверждаемого различия в результатах при использовании традиционного и TLT-инкубаторов по показателям доли полученных качественных бластоцист и частоты «незавершенных» циклов наблюдалась также в когортах женщин с бедным ответом на гонадотропины (табл. 3) и с повторными неудачами имплантации (табл. 4). Однако в группе инфертильных женщин старше 36 лет использование TLT-инкубатора вместо традиционного культивирования (табл. 5) сопровождалось достоверным (p<0,05) увеличением частоты качественных бластоцист (25,8 против 19,3%) и уменьшением частоты «незавершенных» циклов (17,7 против 24,4%).
Таблица 2. Результаты культивирования эмбрионов при применении традиционной технологии и TLT-инкубатора в когорте женщин с хорошим прогнозом успеха ЭКО
| Параметры | Традиционное культивирование | Культивирование с применением TLT | p |
| Количество циклов | 542 | 104 | — |
| % оплодотворения | 72,7 | 71,2 | 0,748 |
| Количество полученных зигот | 394 | 74 | — |
| Количество полученных качественных бластоцист | |||
| абс. | 126 | 25 | — |
| % от числа зигот | 32,0 | 33,8 | 0,861 |
| Циклы, не сопровождавшиеся получением качественных бластоцист | |||
| абс. | 51 | 9 | — |
| % от числа всех циклов | 9,4 | 8,7 | 0,807 |
Таблица 3. Результаты культивирования эмбрионов при применении традиционной технологии и TLT-инкубатора в когорте инфертильных женщин с бедным ответом на гонадотропины
| Параметры | Традиционное культивирование | Культивирование с применением TLT | p |
| Количество циклов | 383 | 122 | — |
| % оплодотворения | 67,4 | 67,2 | 0,975 |
| Количество полученных зигот | 258 | 82 | — |
| Количество полученных качественных бластоцист | |||
| абс. | 44 | — | — |
| % от числа зигот | 17,1 | 23,2 | 0,221 |
| Циклы, не сопровождавшиеся получением качественных бластоцист | |||
| абс. | 91 | 23 | — |
| % от числа всех циклов | 23,8 | 18,9 | 0,254 |
Таблица 4. Результаты культивирования эмбрионов при применении традиционной технологии и TLT-инкубатора в когорте инфертильных женщин с повторными неудачами имплантации
| Параметры | Традиционное культивирование | Культивирование с применением TLT | p |
| Количество циклов | 275 | 150 | — |
| % оплодотворения | 67,3 | 70,7 | 0,471 |
| Количество полученных зигот | 185 | 106 | — |
| Количество полученных качественных бластоцист | |||
| абс. | 36 | — | — |
| % от числа зигот | 19,5 | 21,7 | 0,648 |
| Циклы, не сопровождавшиеся получением качественных бластоцист | |||
| абс. | 58 | 30 | — |
| % от числа всех циклов | 21,1 | 20,0 | 0,791 |
Таблица 5. Результаты культивирования эмбрионов при применении традиционной технологии и TLT-инкубатора в когорте инфертильных женщин старше 36 лет
| Параметры | Традиционное культивирование | Культивирование с применением TLT | p |
| Количество циклов | 761 | 231 | — |
| % оплодотворения | 70,2 | 70,1 | 0,99 |
| Количество полученных зигот | 534 | 162 | — |
| Количество полученных качественных бластоцист | |||
| абс. | 103 | 44 | — |
| % от числа зигот | 19,3 | 25,8 | 0,034 |
| Циклы, не сопровождавшиеся получением качественных бластоцист | |||
| абс. | 186 | 41 | — |
| % от числа всех циклов | 24,4 | 17,7 | 0,031 |
Полученный материал был использован для графического сопоставления результатов культивирования эмбрионов у женщин с наличием и отсутствием принимаемых во внимание факторов, потенциально оказывающих негативное влияние на эмбриогенез. Обработанные данные наглядно демонстрируют, что в группах женщин старше 36 лет, с бедным ответом на гонадотопины и с повторными неудачами имплантации процент получаемых качественных бластоцист был заметно ниже (рис. 1), а процент «незавершенных» циклов — выше (рис. 2), чем у женщин контрольной группы. Данная закономерность не зависела от типа использованного инкубатора, но при этом имела тенденцию к более заметному ухудшению результатов при применении традиционного культивирования вместо инновационной технологии с непрерывным контролем развития эмбрионов. Это означает, что применение TLT-инкубатора вместо традиционного планшетного бокса позволяет ослабить негативное влияние на происходящий in vitro эмбриогенез таких факторов, как поздний репродуктивный возраст, бедный ответ на гонадотропины и повторные неудачи имплантации. Заслуживает внимания, что в когорте женщин старше 36 лет применение при культивировании эмбрионов TLT-инкубатора вместо традиционного планшетного бокса обеспечивало статистически подтверждаемое ослабление негативного влияния фактора позднего репродуктивного возраста на эмбриогенез. Это проявлялось в увеличении на 6% (p=0,034) доли полученных качественных бластоцист и снижении на 7% (p=0,031) частоты «незавершенных» циклов в сравнении с показателями, отмечаемыми при традиционном культивировании.
Рис. 1. Влияние изучавшихся факторов на % получаемых из зигот качественных бластоцист при культивировании эмбрионов с применением традиционной технологии и TLT-инкубатора.
Рис. 2. Влияние изучавшихся факторов на частоту циклов, не сопровождавшихся получением качественных бластоцист, при культивировании эмбрионов с применением традиционной технологии и TLT-инкубатора.
Обсуждение
Практика последних лет показывает, что использование инновационных инкубаторов с TLT-системой способна облегчить работу эмбриологов и улучшить лабораторную логистику за счет появившейся возможности непрерывного фото документирования, позволяющего оценивать развитие эмбрионов в любой момент времени без необходимости их извлечения из культуральной среды в течение рабочего процесса [2—5]. Теоретически такие особенности функционирования TLT-инкубаторов, предупреждающие повреждения эмбрионов при оценке их развития и обеспечивающие более надежный отбор наиболее качественных бластоцист (на основе не только гарднеровских, но и морфокинетических критериев) для их последующего переноса или криоконсервирования, должны были бы улучшить исходы программ ЭКО по показателю ЧНБ. Однако до настоящего времени так и не было получено убедительных данных, подтверждающих это предположение. Более того, S. Armstrong и соавт. сообщили, что проведенный ими метаанализ 9 рандомизированных контролируемых исследований, оценивающий влияние на ЧНБ технологий культивирования эмбрионов с применением традиционных и TLT-инкубаторов, не подтвердил существенных различий между ними [18]. Сопоставимые результаты были представлены D.C. Kieslinger и соавт., отметившие отсутствие различий в ЧНБ в общей популяции пациенток [19]. К аналогичному заключению пришли A. Ahlström и соавт., которые в двойном слепом контролируемом рандомизированном исследовании также наблюдали сопоставимость результатов по показателям ЧНБ и частоте преждевременных потерь беременности у женщин, эмбрионы которых культивировались в традиционных условиях и с применением TLT [20].
По нашему мнению, проблема с подтверждением клинической пользы TLT в основном связана с тем, что при оценке результатов применения традиционных и TLT-инкубаторов в сравниваемые группы исследователи включали самое разное количество больных с особенностями клинического статуса, которые сами по себе негативно влияют на терапевтические исходы ЭКО. С учетом этого обстоятельства мы сравнивали влияние использованных технологий (т.е. традиционного и TLT-инкубаторов) на показатели эмбриогенеза не только в общей (неселективной) популяции больных бесплодием, но и в когортах, выделенных с учетом наличия таких факторов, как поздний репродуктивный возраст, бедный ответ на гонадотропины и повторные неудачи имплантации. В качестве контрольной группы при этом выступали пациентки без наличия указанных факторов, что позволяло рассматривать их как пациенток с хорошим прогнозом успеха ЭКО по показателю ЧНБ.
Полученные нами данные продемонстрировали, что у женщин с хорошим прогнозом успеха ЭКО использованный тип инкубатора действительно практически никак не влиял на показатели эмбриогенеза. Именно этот факт, по нашему мнению, и является объяснением результатов наблюдений тех авторов, которые сообщают о том, что у пациенток с бесплодием, среди которых вполне возможно преобладали пациентки с хорошим прогнозом успеха ЭКО, наблюдаемая разница по показателю ЧНБ при применении традиционной и TLT оказывалась несущественной.
Иная картина наблюдалась в когортах пациенток, выделенных с учетом наличия потенциально негативных факторов для реализации терапевтического потенциала ЭКО. Согласно полученным данным, у женщин в позднем репродуктивном возрасте, у пациенток с наличием бедного ответа и повторными неудачами имплантации исследуемые показатели эффективности эмбриогенеза (частота образования качественных бластоцист и частота «незавершенных» циклов) были заметно хуже, чем у пациенток контрольной группы. Эта закономерность проявляла себя при использовании как обычного, так и TLT-инкубатора. Тем не менее применение TLT-инкубатора вместо стандартного планшетного аналога позволяло «смягчить» (т.е. ослабить) негативное влияние на эмбриогенез каждого из 3 указанных факторов. В особенности заметным (статистически подтверждаемым) такой «смягчающий» эффект оказался при культивировании с использование TLT в когорте женщин старшего репродуктивного возраста.
Полученные нами данные позволяют констатировать, что клиническая польза TLT наиболее заметно проявляется при культивирование эмбрионов, полученных от женщин старше 36 лет. Вероятно, это связано с тем, что при увеличении возраста прогрессирующие изменения обменных процессов в репродуктивной системе в наибольшей степени снижают резистентность эмбрионов к стрессу, происходящему при извлечении эмбрионов из постоянных условий культивирования при применении традиционных планшетных инкубаторов. Поскольку особенности функционирования TLT-инкубаторов освобождают от необходимости извлечения эмбрионов из рабочей камеры на протяжении всего рабочего цикла, именно это обстоятельство и является объяснением наблюдаемого улучшения результатов культивирования с использованием TLT.
У пациенток с бедным ответом на гонадотропины и повторными неудачами имплантации применение TLT вместо традиционного культивирования также улучшало определявшиеся показатели эмбриогенеза, хотя и не так заметно, как у женщин в позднем репродуктивном возрасте. Тем не менее с учетом указанной тенденции, по нашему мнению, можно полагать целесообразным приоритетное использование TLT-инкубаторов при выполнении эмбриологического этапа программ ЭКО и у этих групп больных.
Что касается пациенток с хорошим прогнозом успеха ЭКО, т.е. женщин в оптимальном репродуктивном возрасте с адекватным ответом на гонадотропины и без подтвержденных ранее повторных неудач имплантации, то для культивирования эмбрионов, полученных у таких пациенток, тип применяемого инкубатора (традиционный или TLT), по нашему мнению, не имеет существенного значения. Данное положение вытекает из собственных наблюдений, согласно которым у таких пациенток сравниваемые технологии культивирования не сопровождались сколько-нибудь заметными различиями в определявшихся показателях эмбриогенеза.
Заключение
Применение TLT-инкубаторов вместо традиционных планшетных аналогов по критерию ожидаемого улучшения наиболее значимых показателей эмбриогенеза (увеличения частоты получаемых из зигот качественных бластоцист и снижения частоты «незавершенных» циклов) в наибольшей степени оправдано при культивировании эмбрионов, полученных от женщин старшего репродуктивного возраста (>36 лет). В меньшей степени, но также полезным оказывается выбор в пользу использования TLT-инкубатора при культивировании эмбрионов, полученных от женщин с бедным ответом на гонадотропины и с повторными неудачами имплантации. Для пациенток без указанных особенностей репродуктивного статуса, связанных с возрастом, чувствительностью к гонадотропинам и рецептивностью переносимых эмбрионов (и имеющих по этой причине хороший прогноз успеха ЭКО по показателю ЧНБ) тип применяемого инкубатора (т.е. использующего или нет TLT) не имеет практического значения, оцениваемого по влиянию на важнейшие показатели эмбриогенеза.
Участие авторов:
Концепция и дизайн исследования — Краснопольская К.В., Самойлова А.А.
Сбор и обработка материала — Самойлова А.А., Ершова И.Ю., Исакова К.М.
Статистическая обработка — Бочарова Т.В., Ершова И.Ю., Исакова К.М.
Написание текста — Самойлова А.А., Конеева Ц.О.
Редактирование — Краснопольская К.В.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.