Введение
Непрерывное усовершенствование препаратов, персонификация лечебных протоколов, модификация методов культивирования эмбрионов позволяют увеличить уровень успеха в терапии мужского и женского бесплодия. Однако это не позволяет избежать неудачных исходов программ вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ), так как частота наступления беременности не превышает 35% [1] даже при наличии оптимальных ультразвуковых, траскриптомных параметров прегравидарного эндометрия и эуплоидного хромосомного набора переносимого эмбриона.
Клетки кумулюса (КК) представляют собой специализированные соматические клетки, которые окружают растущий ооцит, обмениваются с ним множеством сигнальных молекул и участвуют в его созревании, овуляции и оплодотворении [2, 3]. По мере роста фолликула недифференцированные гранулезные клетки примордиального фолликула специализируются и становятся КК, окружающими ооцит, и муральными гранулезными клетками, формирующими стенку фолликула. Лучистый венец образован наиболее близко расположенными к ооциту КК, которые посредством многочисленных щелевых контактов обмениваются с ооцитом сигнальными молекулами для развития и поддержания активности обоих типов клеток.
Созревание яйцеклетки включает в себя ряд ядерных и цитоплазматических изменений, которые приводят к образованию зрелой яйцеклетки. Яйцеклетка возобновляет первое мейотическое деление и проходит стадию зародышевого пузырька через созревание до остановки в метафазе мейоза II. Во время созревания яйцеклетки и на протяжении всего раннего развития эмбриона вплоть до стадии бластоцисты митохондрии являются основным источником АТФ, поскольку гликолиз ограничен. Митохондрии относятся к наиболее распространенным органеллам в организме. В то время как митохондрии являются основными генераторами АТФ во время созревания яйцеклетки, яйцеклетка может получать метаболическую поддержку от окружающих ее высокогликолитических КК, обеспечивая их метаболическими субстратами.
КК аспирируются вместе с ооцитами во время трансвагинальной пункции преовуляторных фолликулов в цикле ЭКО и могут быть использованы для оценки компетентности ооцита [4]. Используемые в практике методики оценки качества ооцита основываются исключительно на его морфологии, поскольку более инвазивные методы не позволяют сохранить способность ооцита к оплодотворению. Показано, что продуцируемые КК факторы позволяют использовать их для дозревания незрелых ооцитов в условиях in vitro [5]. Примером негативного регуляторного воздействия КК является секреция ими чрезмерного количества микроРНК miR-155 у пациенток с синдромом поликистозных яичников. Показано, что микроРНК miR-155 негативно влияет на ядерное и цитоплазматическое созревание ооцитов [6], что является одной из причин получения большого количества незрелых ооцитов в протоколах экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) у пациенток с синдромом поликистозных яичников. Транскриптомный анализ КК, окружающих зрелые и незрелые ооциты, показал различную экспрессию в них ряда генов, ответственных за регуляцию клеточного цикла, метаболизма стероидов, апоптоза и воспаления [7].
Дисфункция митохондрий может приводить к серьезным нарушениям клеточной активности. В отличие от других органелл митохондрии содержат собственную кольцевую митохондриальную ДНК (мтДНК), кодирующую 13 пептидов, 22 тРНК и 2 рРНК — 12S и 16S, что в совокупности обеспечивает функционирование белковых комплексов окислительного фосфорилирования [8]. Нарушение функции митохондрий КК может быть причиной дисфункции морфологически нормального ооцита, что клинически проявляется в нарушении его оплодотворения или остановке развития эмбриона на ранних этапах дробления [9].
В отличие от ядра митохондрия содержит множество копий ДНК, количество которых отражает активность процессов окислительного фосфорилирования [10]. В митохондрии нет аналогичных ядру мощных систем репарации ДНК, поэтому повышение копийности мтДНК выступает в роли защитного фактора, понижающего пенетрантность мутаций мтДНК. Существующие методики оценки копийности мтДНК с помощью полимеразной цепной реакции являются инвазивными, что делает их непригодными для изучения функционального состояния митохондрий ооцита. Для КК же любые инвазивные методики оптимальны, но статистически значимые различия копийности мтДНК в КК, окружающие зрелый и незрелый ооцит, не получены [11].
Цель исследования — изучить прогностическое значение маркеров митохондриальной дисфункции КК в получении эмбрионов оптимального качества (ЭОК) в протоколах ВРТ.
Материал и методы
Дизайн исследования
Представленное исследование является одноцентровым, обсервационным, проспективным, выборочным.
Критерии соответствия
Критериями включения являлись: 1) женский фактор бесплодия; 2) возраст пациенток от 18 до 45 лет; 3) нормозооспермия у партнера. Критериями исключения являлись: 1) общие противопоказания к проведению процедуры ЭКО; 2) программы ЭКО с донорскими ооцитами.
Условия проведения
Исследование проведено на базе отделения вспомогательных репродуктивных технологий ФГБНУ «Научно-исследовательский институт акушерства, гинекологии и репродуктологии им. Д.О. Отта» Минобрнауки России (Санкт-Петербург).
Продолжительность исследования
Набор материала осуществляли в течение 2 мес — с марта по апрель 2021 г. Исследование проводили в период с апреля по май 2021 г.
Описание медицинского вмешательства
ЭКО проводили с применением протокола с антагонистами ГнРГ. Для стимуляции созревания фолликулов применяли препараты рекомбинантного фолликулостимулирующего гормона (ФСГ): Гонал-Ф («Merck Serono S.p.A.», Италия), Пурегон («Organon», Нидерланды), Фоллитроп («LG Chem Ltd.», Республика Корея), Перговерис («Merck Serono S.A.», Швейцария) и человеческий менопаузальный гонадотропин, выделенный из мочи постменопаузальных женщин: Мериоферт («IBSA», Швейцария) и Хумог («Bharat Serums & Vaccines Ltd.», Индия). При достижении как минимум двумя фолликулами размера 18 мм осуществляли стимуляцию овуляции с помощью рекомбинантного хорионического гонадотропина человека (ХГЧ): Прегнил («Organon», Нидерланды), Овитрель («Merck Serono S.p.A.», Италия). Через 34—36 ч после введения ХГЧ выполняли трансвагинальную пункцию фолликулов с аспирацией ооцит-кумулюсных комплексов.
С помощью хирургического скальпеля от ооцит- кумулюсных комплексов отрезалась часть КК для дальнейшего исследования. Образец КК помещали в пробирку с культуральной средой, содержащей HEPES-буфер. Далее содержимое пробирки ресуспензировали путем пипетирования микродозатором от 20 с до 20 мин до состояния, при котором конгломерат КК превращался в однородную взвесь.
В каждую лунку шестилуночного планшета («Corning Inc.», США) добавляли 2,0 мл среды DMEM/F12 с 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 1% стрептомицина. Затем в лунки планшета помещали стерильное покровное стекло 24×24 мм толщиной 0,17 мм, после чего в них добавляли суспензию КК в количестве 0,5 мл и инкубировали при температуре 37 °C в 5% CO2 в течение 20 ч. Клетки осаждались на помещенном в лунку покровном стекле. После инкубации содержимое в каждой лунке заменяли бессывороточной средой DMEM/F12 с добавлением митохондриального красителя Mitotracker CMTMRos на 45 мин. Фиксацию препаратов выполняли в 10% растворе нейтрального забуференного формалина в течение 10 мин. После фиксации стекла промывали бессывороточной средой и трижды отмывали в PBS. Затем покровные стекла с клетками монтировались на предметные стекла при помощи глицерина 90%. Края стекол фиксировали лаком.
Все этапы визуализации осуществлялись при помощи лазерного сканирующего конфокального микроскопа Leica TCS SP5 II SMD FLCS («Leica Microsystems (Schweiz) AG», Швейцария) с использованием объектива HC PL APO 63x/1,30 GLYC CORR CS2.
В режиме объемного сканирования на каждом препарате снималось от 20 до 30 КК, при этом каждая клетка снималась крупным планом с опцией цифрового увеличения.
Измерение интенсивности флюоресценции накопленного в митохондриях красителя осуществляли в программе ImageJ с помощью команды Measure.
Деконволюцию изображений проводили с помощью программы Huygens Professional по алгоритму CMLE с использованием теоретически рассчитанной функции рассеивания точки. Сегментация и морфометрический анализ изображений осуществлялись в программе Bitplane Imaris с использованием модуля Filament Tracer. Оценивались следующие параметры: 1) средняя длина митохондрий (рис. 1 на цв. вклейке) со всеми отростками (Filament Length), при этом для исключения ошибок сегментации структуры длиной <0,7 мкм не включались в анализ; 2) среднее количество митохондрий; 3) время затухания флюоресценции митохондриального красителя (рис. 2 на цв. вклейке), измеряемое с помощью FLIM-микроскопии. На каждом препарате снято 4—5 полей зрения. Сканирование осуществлялось до момента, пока для самой яркой точки изображения детектором не была подсчитана 1000 фотонов. Данные импортировались в программу ImageJ с помощью расширения PTU reader и анализировались с применением расширения FLIMj; 4) интенсивность флюоресценции.
Рис. 1. Результаты визуализации морфологии митохондрий в клетках кумулюса, окрашенных Mitotracker Orange CMTMRos.
Оба изображения представлены после процедуры деконволюции в виде максимальной проекции. а — пример клетки с фракционированной митохондриальной сетью; б — пример клетки с цельной митохондриальной сетью.
Рис 2. Результаты визуализации распределения фракций красителя Mitotracker Orange CMTMRos с разным временем затухания флуоресценции в клетках кумулюса.
а — пример клеток с малой долей окисленного красителя; б — пример клеток со значительной долей окисленного красителя.
Основной исход исследования
Основным исходом считалось получение ЭОК на 5-й день развития не ниже 2ВВ.
Дополнительные исходы исследования
Анализ в подгруппах
В зависимости от морфологических характеристик эмбрионов сформированы две группы: 1-я группа (ЭОК не получены) и 2-я группа (получен хотя бы 1 ЭОК 2ВВ и выше).
Методы регистрации исходов
Для морфологической оценки эмбрионов на 5-е сутки развития применялась шкала Гарднера [12]. ЭОК считали эмбрион на стадии бластоцисты на 5-е сутки развития качеством 2ВВ и выше.
Статистический анализ
Принципы расчета размера выборки. Размер выборки предварительно не рассчитывался.
Методы статистического анализа данных. Статистическая обработка данных выполнена с помощью программы для статистического анализа SPSS Statistics. Для обнаружения различий между группами применяли t-критерий Стьюдента. Различия считались статистически значимыми при уровне значимости p<0,05. Данные представлены в виде среднего и стандартного отклонения.
Результаты
Объекты (участники) исследования
В исследовании принимали участие 115 женщин, проходивших лечение бесплодия в отделении вспомогательных репродуктивных технологий ФГБНУ «НИИ АГИР им. Д.О. Отта» (Санкт-Петербург). Всем пациенткам выполнено ЭКО по стандартной методике в протоколе с антагонистами гонадотропин-рилизинг-гормона (ГнРГ). В зависимости от получения ЭОК женщины разделены на 2 группы: пациентки, у которых ЭОК не получены (1-я группа, n=30), и пациентки, у которых получен хотя бы 1 ЭОК (2-я группа, n=85). Средний возраст и индекс массы тела (ИМТ) пациенток 1-й группы составили 35,17±5,83 года и 25,67±4,69 кг/м2, соответственно. Средний возраст и ИМТ пациенток 2-й группы составили 35,94±4,99 года и 23,06±3,74 кг/м2 соответственно. Статистически значимых различий между группами по возрасту и ИМТ не было. У пациенток 2-й группы среднее количество ЭОК составило 2,18±1,43.
Основные результаты исследования
Между1-й и 2-й группами не обнаружены статистически значимые различия по затуханию флюоресценции, интенсивности флюоресценции, среднему количеству митохондрий и их средней длине.
Корреляционный анализ показал наличие ряда статистически значимых корреляций между исследуемыми параметрами (см. таблицу).
Результаты корреляционного анализа
| Параметр | Возраст | ИМТ | Суммарная доза ГТ | Эффективная доза ГТ | Средняя длина МХ | Среднее количество МХ | Интенсивность флюоресценции | Среднее время затухания флюоресценции |
| Возраст | NS | NS | NS | NS | NS | –0,33* | NS | |
| ИМТ | NS | NS | NS | NS | 0,48* | NS | ||
| Суммарная доза ГТ | NS | –0,35* | NS | –0,41* | NS | |||
| Эффективная доза ГТ | NS | NS | –0,38* | NS | ||||
| Средняя длина МХ | NS | 0,36* | –0,34* | |||||
| Среднее количество МХ | NS | 0,44* | ||||||
| Интенсивность флюоресценции | ||||||||
| Среднее время затухания флюоресценции |
Примечание. Представлены значения коэффициента ранговой корреляции Спирмена (r); * — p<0,05; NS — p>0,05. ГТ — гонадотропины; МХ — митохондрии; ИМТ — индекс массы тела.
Увеличение количества митохондрий статистически значимо уменьшает шансы на получение ЭОК (ОШ=0,995, ДИ 0,923—0,988, p=0,008). Увеличение средней длины митохондрий статистически значимо уменьшает шансы на получение ЭОК (ОШ=0,820, ДИ 0,677—0,994, p=0,043).
Дополнительные результаты исследования
Нежелательные явления
В ходе проведения исследования нежелательные явления не зарегистрированы.
Обсуждение
Резюме основного результата исследования
Полученные данные свидетельствуют о том, что митохондриальная дисфункция КК может быть причиной снижения компетенции ооцита и приводить к получению меньшего количества эмбрионов оптимального качества. При этом статистически значимых нарушений функции митохондрий между исследуемыми группами не было.
Обсуждение основного результата исследования
Мембранный потенциал митохондрий оценивался по интенсивности флюоресценции красителя Mitotracker Orange CMTRos, который имеет катионную природу и под действием митохондриального мембранного потенциала закачивается в митохондрии. Интенсивность флюоресценции прямо коррелирует с мембранным потенциалом митохондрий [13]. Таким образом, ослабление интенсивности флюоресценции свидетельствует о снижении мембранного потенциала митохондрии и уменьшении синтеза ею АТФ. Полученные данные означают, что суммарная доза гонадотропинов и эффективная доза гонадотропинов в расчете на зрелый ооцит отрицательно коррелируют с интенсивностью флюоресценции митохондрий. Это свидетельствует об отрицательном влиянии высоких доз гонадотропинов на активность митохондрий в КК. В контексте интереса к протоколам ЭКО с «мягкой» овариальной стимуляцией [14] подтверждение негативного влияния более высоких доз гонадотропинов на активность митохондрий является еще одним аргументом к понижению дозы используемых в протоколах ЭКО гонадотропинов. Кроме негативного влияния гонадотропинов на качество эмбрионов, также отмечается их возможный вклад в снижение рецептивности эндометрия [15] и возникновение эпигенетических модификаций у потомков [16].
В метаболически активных клетках митохондрии существуют не в виде отдельных органелл, а образуют конгломераты — митохондриальные сети (см. рис. 1). Физиология этих митохондриальных сетей основывается на балансе процессов слияния митохондрий (фузии) и их разобщения [17]. Слияние митохондрий позволяет им обмениваться неповрежденным геномом и компенсировать снижение активности процессов окислительного фосфорилирования из-за накопления мутаций в мтДНК, вызванных активными формами кислорода. Разобщение митохондрий необходимо в процессах деления митохондрий, апоптоза и элиминации поврежденных митохондрий для их последующей митофагии. В данном исследовании обнаружена отрицательная корреляция между суммарной дозой гонадотропинов и средней длиной митохондрий, что может свидетельствовать о фракционировании митохондриальной сети, нарушении баланса слияния-разобщения митохондрий и являться одним из молекулярных механизмов негативного влияния высоких доз гонадотропинов на компетентность ооцита.
Отмечается отрицательная корреляция интенсивности флюоресценции митохондрий с возрастом пациенток, что соотносится со снижением овариального резерва, ухудшением качества ооцитов и резким снижением репродуктивного потенциала, наблюдаемым после 38 лет. Наблюдаемые закономерности иллюстрируют прогрессирующую дисфункцию митохондрий, сопровождающую процессы естественного старения [18].
В данном исследовании обнаружена положительная корреляция между ИМТ и интенсивностью флюоресценции, что свидетельствует об увеличении активности митохондрий с повышением массы тела и противоречит наблюдаемой при ожирении митохондриальной дисфункции [19]. В то же время, по данным V. Gorshinova и соавт. (2017), в КК пациенток с ожирением наблюдается снижение митохондриального мембранного потенциала [20]. При этом в работе K. Kumar и соавт. (2021) [21] отмечено неожиданное повышение копийности мтДНК в сравнении с пациентками с нормальной массой тела, что авторы связали с компенсаторным повышением активности митохондрий в условиях стресса. Однако у пациенток с избыточной массой тела таких компенсаторных изменений не наблюдалось, и количество мтДНК у них оказалось ниже, чем у пациенток с нормальной массой тела.
Возможно, наблюдаемая корреляция связана с ошибкой в интерпретации соответствия митохондриального мембранного потенциала и активности митохондрий в плане синтеза АТФ, поскольку митохондриальный мембранный потенциал также задействован в процессах митофагии и Ca2+-сигналинга [22].
Отношение шансов свидетельствует о том, что увеличение количества митохондрий и их средней длины является прогностически неблагоприятным для получения ЭОК. Увеличение количества митохондрий может свидетельствовать о сдвиге баланса слияния-разобщения митохондрий в сторону фракционирования митохондриальной сети, в то время как увеличение средней длины митохондрий можно расценить как их компенсаторное слияние для донации поврежденным митохондриям неповрежденного генома.
Параметр среднего времени затухания флюоресценции позволяет судить об уровне окислительного стресса в образце, поскольку для окисленных активными формами кислорода молекул красителя характерны более высокие значения среднего времени затухания флюоресценции.
Среднее время затухания флюоресценции прямо коррелирует с уровнем окислительного стресса и при этом является более чувствительным параметром, чем интенсивность флюоресценции [23]. В данном исследовании обнаружено, что среднее время затухания флюоресценции увеличивается с увеличением количества митохондрий и уменьшением их средней длины, что свидетельствует об усилении окислительного стресса митохондрий при фракционировании митохондриальной сети. При этом средняя длина митохондрий отрицательно коррелирует с интенсивностью флюоресценции, что может свидетельствовать об уменьшении митохондриального мембранного потенциала при фракционировании митохондриальной сети.
Полученные данные расширяют имеющиеся представления о роли митохондриальной дисфункции в нарушении фолликулогенеза и формируют основу для поиска подходов к ее коррекции в программах вспомогательных репродуктивных технологий.
Ограничения исследования
Основным ограничением представленного исследования является размер исследуемой выборки пациентов. Вероятно, при увеличении числа включенных в исследование пациентов будут обнаружены статистически значимые различия между исследуемыми группами. При анализе митохондриальной дисфункции использовался совокупный пул КК, полученный при трансвагинальной пункции от одной пациентки, что не позволяет проследить взаимосвязь митохондриальной дисфункции КК конкретного ооцита с его зрелостью и качеством полученного из него эмбриона.
Выводы
Полученные данные свидетельствуют о том, что служащие для оценки митохондриальной дисфункции среднее количество митохондрий и средняя длина митохондрий в клетках кумулюса могут быть использованы в качестве прогностических факторов получения эмбрионов оптимального качества. При этом в исследовании оценивались усредненные значения маркеров митохондриальной дисфункции для всей совокупности полученных клеток кумулюса. Перспективной является оценка маркеров митохондриальной дисфункции КК для каждого ооцита отдельно, что, вероятно, позволит судить о наличии митохондриальной дисфункции в самом ооците и стать новым критерием выбора эмбриона для переноса в полость матки. Установлено, что высокие дозы гонадотропинов отрицательно влияют на функцию митохондрий КК, что в контексте повышения интереса к программам экстракорпорального оплодотворения с «мягкой» овариальной стимуляцией является еще одним аргументом в пользу использования данных программ.
Участие авторов:
Концепция и дизайн исследования — Тапильская Н.И., Гзгзян А.М.
Сбор и обработка материала — Объедкова К.В., Комарова Е.М., Тапильская Н.И., Гзгзян А.М., Комарова Е.М., Лесик Е.А.
Статистический анализ данных — Рыжов Ю.Р., Тапильская Н.И., Объедкова К.В.
Написание текста — Рыжов Ю.Р.
Редактирование — Тапильская Н.И., Гзгзян А.М.
Источник финансирования. Исследование поддержано государственной программой фундаментальных научных исследований №1021062512052-5-3.2.2.
Благодарности. Авторы выражают благодарность сотрудникам отделения вспомогательных репродуктивных технологий ФГБНУ «Научно-исследовательский институт акушерства, гинекологии и репродуктологии имени Д.О. Отта» Минобрнауки России (Санкт-Петербург) за помощь в проведении клинической части исследования.
Исследование проведено с использованием оборудования ресурсного центра «Развитие молекулярных и клеточных технологий» ФГБОУ ВО «Санкт-Петербургский государственный университет» Правительства Российской Федерации (Санкт-Петербург).
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.