Вульварная интраэпителиальная неоплазия (VIN) представляет собой поражение многослойного плоского эпителия без разрушения базальной мембраны, характеризующееся расстройством созревания клеток, потерей ими полярности ядер, наличием на различных уровнях патологических митозов. Главным индуктором процесса являются вирус герпеса и вирус папилломы человека. Согласно сводным данным, связь инвазивного плоскоклеточного рака вульвы и cancer in situ в 20—30% случаев «обязана» вирусной составляющей [1]. Результаты популяционных исследований, посвященных влиянию вирусной инфекции на заболеваемость VIN (согласно Международной классификации болезней (N90.2) тяжелой степени и инвазивного рака вульвы, позволили уточнить возможность раннего выявления патологии и адекватной коррекции на доклинической манифестации болезни. С этих позиций представляется актуальным изучение частоты снижения вирусной нагрузки и восстановления местного влагалищного иммунитета у больных VIN на фоне противовирусной терапии.

Цель исследования — изучение изменений местного влагалищного иммунитета и экспрессии вируса папилломы человека (ВПЧ) высокого канцерогенного риска у больных VIN II—III на фоне комбинированного лечения инозином пранобексом и широкополосной малоинвазивной радиохирургии.

Работа выполнена на базе Краснодарского центра ООО «Современные диагностические технологии» (Краснодар) в период 2016—2017 гг.

Дизайн исследования построен по принципу клинического исследования в параллельных группах: 1-я группа — основная (n=37) — больные VIN II—III степени (верифицированной на основании морфологического исследования), которым с целью лечения произведено широкополосное радиоволновое хирургическое иссечение вульвы в сопровождении противовирусной терапии; 2-я группа клинического сравнения (n=21) — больные VIN II—III степени, у которых лечение VIN II—III реализовано только радиохирургическим методом. Обследование пациенток соответствовало этическим нормам Хельсинкской декларации Всемирной медицинской ассоциации (World Medical Association Declaration of Helsinki, 1975, 1983, 1989, 2000, 2008); основам законодательства Российской Федерации «Об охране здоровья граждан, правила проведения клинической практики в РФ» (приказ СЗ РФ № 266 от 19.07.03; приказ Росздравнадзора № 2325-Пр/06 от 17.10.06). Все женщины подписали письменное информированное согласие. В соответствии с приказом Министерства здравоохранения РФ № 572н от 01.11.12 «Об утверждении Порядка оказания медицинской помощи по профилю «Акушерство и гинекология (за исключением использования вспомогательных репродуктивных технологий)», с изменениями и дополнениями от 17.01.14, 11.06.15, 12.01.16, обследование пациенток проведено по плану, включавшему сбор клинико-анамнестических данных, отделяемого секрета из влагалища. Полученные результаты прошли математико-статистическую обработку.

Критерии включения: репродуктивный возраст, наличие вульварной интраэпителиальной неоплазии тяжелой степени без малигнизации (VIN II—III), вирусоносительство, отсутствие микстинфекции.

Критерии исключения: атрофические процессы вульвы, рак вульвы, участие пациентки в другом исследовании, отказ от исследования, аллергические реакции на инозин пранобекс, прием интерферонов местного и системного характера, наличие у пациенток кардиостимулятора (противопоказание к радиохирургии).

Определение концентрации цитокинов в вагинальном содержимом проводилось с использованием диагностических наборов производства фирмы «Протеиновый контур» (Санкт-Петербург). Исследуемые образцы инкубировали в лунках микропланшета, покрытых моноклональными антителами к определяемым провоспалительным, обеспечивающим мобилизацию воспалительного ответа цитокинам: интерлейкинам (IL-1β, -2 и противовоспалительному цитокину, ограничивающему развитие воспаления IL-4. Детекция проводилась на многоканальном фотометре Labsystems, при длине волны 405 и 450 нм. Чувствительность тест-системы составила 10 пг/мл для IL-1β, 5 пг/мл для IL-2, 15 пг/мл для IL-4. Полученные результаты преобразовывались в гистограмму.

Детекция вируса и количественный подсчет выполнены на аппарате Appied-Biosystems (Сингапур) с одноименными тест-системами по методике амплификации маркерного возбудителя.

Противовирусная терапия проводилась препаратом инозин пранобекс (Гроприносин), с химической формулой: инозина (1,9-дигидро-9-р-β-рибофуранозило-6Н-пурин-6-ОН) и соли 4-ацетамидобензойной кислоты с N, N-диметиламино-2-пропанолом в молярном соотношении 1:3. Лечение начиналось за 1 неделю (7 дней) до предполагаемого малоинвазивного лечения вульвы и продолжалось в послеоперационном периоде еще 3 нед (21 день) перорально по 500 мг 3 раза в сутки. Препарат имеет широкий спектр действия, подавляет репликацию ДНК- и РНК-вирусов посредством связывания с рибосомой клетки и изменения ее стереохимического строения, а также блокирует их репродукцию путем повреждения генетического аппарата. Иммуномодулирующее действие выражается в стимуляции функции Т-лимфоцитов (в частности Т-хелперов), естественных клеток-киллеров. Препарат увеличивает продукцию интерлейкинов, стимулирует фагоцитоз и синтез антител. Таким образом, препарат обладает бифункциональными свойствами: доказанной противовирусной и иммуномодулирующей активностью [2].

Широкополосное радиоволновое хирургическое иссечение вульвы проведено на аппарате Сургитрон, с генерирующей радиоволной в диапазоне 3,8—4,0 МГц. Работа выполнялась в режиме полностью выпрямленной волны — одновременно разрез и коагуляция (50 и 50% соответственно).

Частота посещений больными в течение исследования составила 4 раза за весь период наблюдения: подпись информационного согласия и включение в исследование; забор материала (лабораторный этап); широкополосное радиохирургическое иссечение пораженных участков (хирургический этап); контроль лабораторных исследований (лабораторный этап).

Математическую обработку проводили с использованием математического пакета Statistica 6.0 и медико-биологической программы BioStat Professional. Для параметров, имеющих нормальное распределение, использовались среднее арифметическое (М) и стандартное отклонение (σ), а для параметров, имеющих отклонение от нормального распределения, — медиана (Ме) и ошибка средней (m); в скобках указаны значения процентилей Q1 — 25%, Q2 —75%. Для каждого наблюдаемого параметра условно выделены два интервала — широкий (M±2SD, 10—90%) и узкий (M±SD, 25—75%). Для параметров, имеющих нормальное распределение, используются M±2SD и M±1SD интервалы, а для параметров, имеющих отклонение от нормального распределения, — интервалы 10—90% и 25—75%. Статистическая достоверность полученных данных после проверки на нормальность определялась с применением параметрического t-критерия Стьюдента. Оценка нормальности распределения полученных результатов по каждой величине осуществлялась с помощью критерия Колмогорова—Смирнова с поправкой Лиллиефорса, критерия Шапиро—Вилка (W), вычисления эксцесса и асимметрии. При распределении признаков, не соответствующих нормальному, использованы непараметрические критерии: U-критерий Манна—Уитни (Z-критерий стандартизованный). Критическое значение уровня значимости принимается равным 5% (р<0,05). При значениях р<0,00099 использовалось обозначение p<0,001.

Для сравнения качественных признаков применен критерий линейной корреляции Пирсона (r). Для всех результатов исследований различия считались достоверными при уровне значимости 95,0% (р<0,05), при значении рассчитываемого критерия в диапазоне 94,0—90,0% проявление исследуемого признака рассматривалось как тенденция.

Больные, включенные в исследования, были сопоставимы по соматическому и гинекологическому статусу. Средний возраст пациентов составил M_ср=33,91±0,8 года (медиана 6,1 года).

У всех обследуемых больных титр ВПЧ находился до начала лечения на уровне клинически значимых значений и в целом составил в 1-й группе больных M_ср=5,1±0,09 (σ=0,6); во 2-й группе больных M_ср=5,2±0,2 (σ=0,6).

Следует отметить, что лабораторная диагностика VIN достаточно затруднена. В нашем исследовании произведена детекция ВПЧ реакцией амплификации возбудителя (полимеразная цепная реакция — ПЦР), и на основании определения уровня цитокинов в вагинальном содержимом давалась оценка местному иммунитету [3].

Цитокины — небольшие пептидные информационные молекулы. Они регулируют межклеточные и межсистемные взаимодействия, определяют выживаемость клеток, стимуляцию или подавление их роста, дифференциацию, функциональную активность и апоптоз, а также обеспечивают согласованность органов и систем организма как в нормальных условиях, так и в ответ на патологические воздействия. Количественная оценка IL-1 при первичном обследовании позволила определить особенности его секреции в исследуемых группах. Наблюдался высокий уровень не связанного с мембраной одного из основных регуляторных молекул IL-1β (преобладающей формой IL-1 является IL-1β) в обеих группах (без достоверных различий между группами) как результат локального иммунного ответа влагалищного биотопа на внедрение ВПЧ (табл. 1).

Биологические свойства IL-1 ярко демонстрируют его полифункциональность. IL-1 играет одну из центральных ролей в воспалительной реакции, а также в регуляции функций практически всех типов клеток и продукции ростовых факторов и других цитокинов, вовлеченных в воспалительный процесс, что подтвердилось и в нашем исследовании [4].

Проявившийся высокий уровень IL-2 в вагинальном секрете объясняется (сравнение также не определило достоверных различий между группами) стимуляцией IL-1 продукции IL-2. Являясь одним из основных медиаторов воспалительных реакций, IL-1 стимулирует пролиферацию Т-клеток, увеличивает на Т-клетках экспрессию рецептора IL-2 и выработку ими IL-2. Продуцентами IL-2 являются Th1-клетки. Известно, что здоровый женский тракт имеет Th-2-среду. В случае возникновения воспалительного процесса происходит сдвиг в сторону Th-1 составляющих местного иммунитета [5, 6].

Наличие достоверной положительной корреляционной взаимосвязи высокой силы между выраженностью вирусной нагрузки и секрецией IL-1β подтверждает снижение местного иммунного статуса влагалища женщин в обследуемых группах (во всех сравнениях p<0,01) (табл. 2).

Секреция IL-4 в обеих группах до начала лечения характеризовалась выраженным снижением уровня лимфокина (см. табл. 1). Сравнение медианных показателей не обнаружило достоверных различий в группах. IL-4 продуцируется преимущественно активированными Тh2-лимфоцитами, а также моноцитами, макрофагами, В-лимфоцитами, NK-клетками, кератиноцитами, тучными клетками и др., под действием провоспалительных цитокинов [7]. Основная функция IL-4, как и других противовоспалительных цитокинов, состоит в изменении иммунного ответа с Th1 на Th2. IL-4 — мощный противовоспалительный и иммуносупрессивный фактор, ингибирующий избыточный синтез провоспалительных цитокинов, активированными макрофагами и Тh1-лимфоцитами, что приводит к ослаблению избыточного влияния медиаторов воспаления [8—12]. Выявленное снижение секреции IL-4 во влагалищном содержимом подтверждает явный сдвиг баланса Th1/Th2-лимфоцитов в сторону усиления активности Th1-лимфоцитов и активности моноцитов/макрофагов с высокой секрецией провоспалительных цитокинов, что также проявилось отрицательной корреляционной зависимостью средней силы между показателями секреции IL-β и IL-4 (табл. 3).

Оценка содержания интерлейкинов во влагалищном содержимом у больных обеих групп после проведенного широкополосного радиоволнового хирургического лечения с терапией противовирусным препаратом инозин пранобекс (гроприносин) — 1-я группа, а также только широкополосной радиоволновой хирургией — 2-я группа — представлена в табл. 1. Минимальный уровень провоспалительного цитокина IL-1β обнаружен у женщин 1-й группы, которым в до- и послеоперационном периоде проводили системную терапию Гроприносином. Сравнение показателей в 1-й группе до лечения и после сочетанного лечения VIN свидетельствовало об очевидном снижении провоспалительного спектра иммунологической составляющей влагалищного биотопа (U=7,4; p<0,001). При этом достоверно снижался уровень IL-1β и у пациентов 2-й группы (U=4,9; p<0,01), тогда как межгрупповой анализ медианных показателей позволил констатировать преобладание IL-β во 2-й группе по сравнению с 1-й группой (U=6,3; р<0,001). Показатели секреции данного цитокина во 2-й группе значительно (в 4,2 раза) превышали аналогичные показатели в 1-й группе.

Представленные различия свидетельствовали о снижении воспалительных реакций у больных 1-й группы и, как итог, — демонстрировали более эффективную элиминацию вируса из полового тракта у женщин и лучший прогноз основного заболевания, в отличие от больных 2-й группы, которым проведено только радиохирургическое иссечение патологических тканей вульвы.

Различие подкреплялось показателями ПЦР. В частности, вирусная нагрузка у пациенток 1-й группы достоверно (p<0,001) снизилась до М_ср=0,81±0,06 (σ=0,39), тогда как во 2-й группе отмечено также достоверное (p<0,001) снижение, но до клинически значимых показателей М_ср=2,9±0,2 (σ=0,8), и, как итог, — сдвиг местного иммунитета в сторону Th2-среды.

Уменьшение выработки IL-1 соответствовало активному снижению секреции IL-2 у больных в обеих группах. При этом имелся ряд принципиальных особенностей. Во-первых, секреция IL-2 в 1-й группе достоверно отличалась от исходных показателей (U=7,4; p<0,001). Во-вторых, уровень секреции лимфокина у пациенток 1-й группы (сочетанное применение радиоволновой хирургии и инозин пранобекса) был ниже такового у пациенток 2-й группы, которым было проведено только широкополосное иссечение ткани вульвы (U=4,98; p<0,01). Секреция IL-2 у больных 2-й группы тоже достоверно уменьшилась после лечения (U=4,98; p<0,01), однако статистически значимая динамика была менее активной, чем у пациенток 1-й группы.

Выраженное угнетение секреции IL-β отразилось в повышении секреции лимфокина IL-4 — в 1,9 раза от исходных показателей у больных 1-й группы (U=6,9; р<0,001). Тогда как медианные показатели IL-4 у больных 2-й группы характеризовались лишь тенденцией к повышению (U=1,5), а уровень IL-4 в 1-й группе больных значительно превышал показатели у пациенток 2-й группы (U=6,9; p<0,001).

Обращал на себя внимание и факт благоприятного течения послеоперационного периода у всех больных, включенных в исследование. Полное заживление раневой поверхности наблюдалось к 7-м суткам послеоперационного периода и не требовалось применения местной аппликационной, ранозаживляющей терапии, что свидетельствовало о стерилизующем эффекте широкополосной электрической радиоволны. Примененное малоинвазивное иссечение вульвы на аппарате Сургитрон способствовало не только раннему заживлению раны, но и отсутствию послеоперационных рубцов, а полученные макропрепараты имели высокое качество, удовлетворяющее проведению адекватной морфологической оценки.

Полученные результаты исследования расширили понимание роли ВПЧ в формировании VIN, показав принципиальное звено патогенеза заболевания — вирусную этиологию и нарушение местного иммунитета. Анализ иммунной системы на основании оценки интерлейкинов позволил выделить роль провоспалительных цитокинов в формировании VIN и показать угнетение Th2-среды у больных, отягощенных ВПЧ. Приведенные данные ясно показывают, что нельзя ограничить понятие защитных реакций только участием неспецифических механизмов резистентности и специфического иммунного ответа, необходимо учитывать все звенья иммунной системы [13, 14].

Выраженное снижение экспрессии ВПЧ и, как следствие, благоприятный исход заболевания у больных 1-й группы являются результатом влияния противовирусного препарата инозин пранобекс в комплексном лечении VIN. Достоверные различия между показателями больных 2-й группы, получивших только широкополосную радиохирургию, по нашему мнению, связаны с отсутствием у данной группы пациенток в программе лечения препаратов направленной противовирусной и иммуномодулирующей активности.

У больных репродуктивного возраста, отягощенных VIN, имеется высокая вирусная нагрузка. VIN сочетается с выраженным угнетением Th2 содержимого влагалищного биотопа женщины. Проведение широкополосного радиоволнового иссечения пораженных участков вульвы на аппарате Сургитрон приводит к благоприятному исходу в виде раннего первичного заживления послеоперационной раны, отсутствия рубцовых изменений в месте оперативного вмешательства. Сочетание широкополосной радиоволновой хирургии и противовирусного, иммуномодулирующего препарата Гроприносин (инозин пранобекс) снижает вирусную нагрузку в 6,4 раза; отмечен выраженный сдвиг иммунного статуса влагалищного биотопа в сторону Th2-среды (p<0,001). Для достижения положительного эффекта лечения VIN инозин пранобекс предпочтительно применять на до- и послеоперационном этапах в сочетании с широкополосным радиоволновым хирургическим иссечением пораженных участков вульвы.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.