Методы селекции сперматозоидов для процедуры интрацитоплазматической инъекции сперматозоида в программах экстракорпорального оплодотворения (обзор литературы)

Авторы:
  • Р. В. Назаренко
    ООО «Клиника профессора Здановского», Москва, Россия
  • В. М. Здановский
    ООО «Клиника профессора Здановского», Москва, Россия
Журнал: Проблемы репродукции. 2019;25(2): 83-89
Просмотрено: 878 Скачано: 100

В 2018 г. исполнилось 40 лет со дня рождения первого ребенка, зачатого с использованием метода экстракорпорального оплодотворения (ЭКО). С тех пор вспомогательные репродуктивные технологии (ВРТ) претерпели значительные изменения. Появились новые препараты и схемы их применения для гормональной стимуляции функции яичников; внедрена в рутинную практику процедура интрацитоплазматической инъекции сперматозоида (ИКСИ), в том числе с использованием сперматозоидов, полученных из яичка или его придатка; повсеместно применяется криоконсервация гамет и эмбрионов; развиваются методы преимплантационной генетической диагностики. Вместе с тем, несмотря на значительные успехи, эффективность ЭКО (порядка 30% по всему миру) не может считаться удовлетворительной ни для врача, ни для пациента. Многим супружеским парам приходится прибегать к нескольким попыткам ЭКО для достижения желанной беременности, другие пары так и не достигают цели. Все это обусловливает неустанный поиск путей повышения эффективности ЭКО, частоты наступления беременности (ЧНБ) и имплантации. На эмбриологическом этапе ЭКО внимание исследователей привлекают в том числе методы селекции сперматозоида для проведения ИКСИ. В большинстве случаев эти методы ограничиваются центрифугированием эякулята в двойном градиенте плотности и процедурой всплытия сперматозоидов (swim-up). Такие технологии позволяют отобрать фракцию наиболее подвижных живых сперматозоидов, однако не дают возможность судить о функциональной зрелости сперматозоида и его внутренней структуре. В последнее время появляется все больше работ, связывающих высокую частоту фрагментации ядерной ДНК сперматозоидов с мужским бесплодием, а также с привычным невынашиванием у женщин [1]. Несмотря на то что рутинные методы обработки эякулята и морфологические критерии селекции сперматозоида для ИКСИ позволяют минимизировать риск использования аномального сперматозоида, подобная вероятность остается, что может снижать эффективность ЭКО или приводить к прерыванию беременности на ранних сроках. Накопленный на сегодняшний день уровень знаний диктует необходимость разработки и внедрения новых методов селекции сперматозоида в процедуре ИКСИ. Рассмотренные в данном обзоре методы преследуют цель исследовать и оценить сперматозоид за пределами стандартного для большинства клиник ВРТ подхода к его селекции. Некоторые из них, например метод связывания с гиалуроновой кислотой или использование сверхвысокого увеличения, уже используются в практике, другие (конфокальная Рамановская спектроскопия) являются исключительно экспериментальными. Все перечисленные ниже методы являются неинвазивными, недеструктивными, не используют флуоресцентных меток и красителей.

Метод связывания сперматозоидов с гиалуроновой кислотой

Гиалуроновая кислота (ГК) принадлежит к семейству гликозаминогликанов, синтезируется на внутренней поверхности цитоплазматической мембраны ооцита и является основным компонентом внеклеточного матрикса кумулюсно-ооцитарного комплекса. Рецепторы к ГК присутствуют на мембране сперматозоида, что обеспечивает его прикрепление к блестящей оболочке ооцита. Предполагается, что только структурно зрелые сперматозоиды, закончившие спермиогенез, могут связываться с Г.К. Это явление легло в основу метода «физиологического» ИКСИ. Существует 2 варианта использования ГК для селекции сперматозоидов: методы ПИКСИ и SpermSlow. Метод ПИКСИ проводят в чашках с заранее нанесенными на дне микроточками с сухой ГК. В чашку добавляют культуральную среду и суспензию отмытых сперматозоидов. Зрелые сперматозоиды связываются головкой с ГК, активно вращая хвостом; их захватывают иглой для ИКСИ и инъецируют внутрь ооцитов.

SpermSlow представляет собой вязкую среду с Г.К. Зрелые сперматозоиды в такой среде резко замедляют свое движение, что помогает отобрать их для ИКСИ. В сравнительном анализе двух систем — SpermSlow и ПИКСИ, проведенном L. Parmegiani и соавт. [2], не отмечено статистически значимых различий в их эффективности. В группе ПИКСИ авторы зафиксировали возрастание времени процедуры ИКСИ в среднем на 3 мин. В мультицентровом клиническом исследовании выявлены некоторое повышение ЧНБ и значительное снижение частоты прерывания беременности (3,3% у пациенток исследуемой группы, 15,1% — контрольной) при использовании метода ПИКСИ у пациентов с частотой связывания сперматозоидов с ГК менее 65% [3]. Несмотря на то что в ряде работ отмечено снижение числа сперматозоидов с высоким индексом фрагментации ДНК и маркерами апоптоза при использовании ГК [4—6], увеличения ЧНБ в целом не наблюдалось [7, 8].

В Кохрановском обзоре не выявлено преимуществ при использовании систем с ГК по сравнению с традиционным ИКСИ [9]. По мнению большинства авторов, необходимы дальнейшие исследования для оценки эффективности данного метода при выборе сперматозоида для процедуры ИКСИ.

Селекция сперматозоидов на основании исследования поверхностного заряда их мембран

Зета-потенциал

Цитоплазматическая мембрана зрелого сперматозоида обладает отрицательным зарядом от –16 до –20 mV. Этот электрический заряд называется зета-потенциал (электрокинетический потенциал). Заряд обусловлен сиаловыми гликопротеинами на поверхности мембраны и уменьшается после капацитации. Отрицательно заряженные сперматозоиды за счет электростатических сил прикрепляются к положительно заряженной стенке пробирки. Положительный заряд пробирки достигается с помощью трения о латекс. Метод разработан P. Chan и соавт. [10] в 2006 г. При использовании данного метода авторы отметили значительное улучшение морфологии сперматозоидов (17,4% по сравнению с 5,4% контрольной группы) и снижение индекса фрагментации ДНК (85% по сравнению с 69,5% контрольной группы). Эти результаты послужили основанием для предположения об эффективности метода в программах ЭКО.

В своем исследовании M. Kheirollahi-Kouhestani и соавт. [11] использовали зета-потенциал в комбинации со стандартным центрифугированием в двойном градиенте плотности с последующим ИКСИ. Отмечено снижение уровня фрагментации ДНК у пациенток исследуемой группы, однако ЧНБ статистически значимо не различалась. Схожий дизайн использован в двойном слепом рандомизированном клиническом исследовании, выполненном M. Nasr Esfahani и соавт. [12]. При этом получены результаты, свидетельствующие о значительном увеличении ЧНБ (43,1% у пациенток основной группы, 23,7% — контрольной) и снижении частоты прерывания беременности (7,5 и 18,2% соответственно) при использовании центрифугирования в двойном градиенте плотности в комбинации с зета-потенциалом. Несмотря на противоречивые данные литературы, есть все основания для внедрения этого метода в рутинную практику, так как он прост, безопасен и не требует никаких финансовых затрат. К недостаткам можно отнести то, что данный метод не подходит для пациентов с олигозооспермией.

Микроэлектрофорез

Метод основан на разделении сперматозоидов в камере для электрофореза. Камера заполняется буфером для электрофореза, подается ток напряжением от 6 до 14 мА [13]. Положительно заряженные сперматозоиды движутся по направлению к катоду, отрицательно заряженные — к аноду. С помощью иглы для микроинъекций сперматозоиды с отрицательным зарядом на мембране отбирают для ИКСИ. Первую беременность и рождение ребенка с использованием данного метода описали C. Ainsworth и соавт. [14] в 2006 г., особенно подчеркивая пригодность метода при работе с криоконсервированной спермой и сперматозоидами, полученными при тестикулярной биопсии. Отмечено также снижение числа сперматозоидов с фрагментированной ДНК (исследовано методом TUNEL) при их электрофоретическом разделении.

К сожалению, существует не так много работ по использованию этого метода. L. Simon и соавт. [13] также отмечают перспективность электрофореза, однако указывают на вероятные ограничения в связи с отсутствием данных о влиянии электрического тока на сперматозоиды и на возможность осмотического повреждения сперматозоидов при использовании гипотонического буфера для электрофореза.

Селекция сперматозоидов на основании выявления ранних маркеров апоптоза (магнитоактивированная клеточная сортировка)

Апоптоз (запрограммированная гибель клетки) играет важную роль в элиминации дефектных герминативных клеток на разных стадиях спермиогенеза. Более того, в исследованиях показано, что в эякуляте человека присутствуют сперматозоиды с маркерами апоптоза, такими, например, как активная каспаза 3-го типа. Так, S. Weng и соавт. [15] пришли к выводу, что у бесплодных пациентов фракция слабоподвижных сперматозоидов имеет повышенную активность каспазы 3-го типа и высокий индекс фрагментации ДНК.

Существует множество методов определения маркеров апоптоза в клетках, однако для селекции сперматозоидов применима лишь магнитоактивированная клеточная сортировка (МАКС). Одним из ранних признаков апоптоза является нарушение целостности цитоплазматической мембраны, что приводит к появлению на ее поверхности фосфатидилсерина. Этот фосфолипид имеет высокую аффинность к аннексину V типа, который используется в качестве маркера апоптоза. Таким образом, аннексин V типа, конъюгированный с магнитными микрочастицами (микросферами), находясь в магнитном поле, способен связывать апоптотические сперматозоиды. Несвязанные сперматозоиды свободно проходят через магнитное поле и могут быть использованы в процедуре ИКСИ. В метаанализе, проведенном M. Gil и соавт. [16], рассмотрены 5 исследований, включающих 499 пациентов в программах ЭКО. В 367 случаях оценивалась ЧНБ, у пациенток группы МАКС она составила 45,49%, а у пациенток контрольной группы — 30,12%. Частота имплантации и прерывания беременности статистически значимо не различалась. К преимуществам данного метода можно также отнести высокую скорость сепарации, что позволяет отбирать сперматозоиды не только для ИКСИ, но и для внутриматочной инсеминации [17]. Однако имеющиеся на сегодняшний день данные не дают возможность сделать вывод об эффективности этого метода, что обусловливает необходимость продолжения исследований. Рациональное развитие метода может заключаться в поиске новых поверхностных маркеров апоптоза и создании наночастиц для конъюгации с ними. J. Odhiambo и соавт. [18] для магнитной сепарации сперматозоидов быка использовали 2 типа наночастиц: покрытые антителами к убиквитину и покрытые лектином PNA, который связывается с гликанами на поверхности цитоплазматической мембраны. Авторы пришли к выводу, что присутствие этих маркеров ассоциировано с многочисленными дефектами сперматозоидов и отрицательно коррелируют с фертильностью.

Анализ морфологии сперматозоидов при сверхвысоком увеличении

В рутинной эмбриологической практике для оценки морфологии сперматозоидов в процессе их селекции в процедуре ИКСИ используется увеличение в 400 раз. Однако такого увеличения недостаточно для детального исследования субклеточных органелл. Анализ морфологии сперматозоида при сверхвысоком увеличении более чем в 6000 раз разработан B. Bartoov и соавт. [19] в 2001 г. и получил название MSOME (motile sperm organellar morphology examination). Селекция сперматозоидов в процедуре ИКСИ при таком увеличении носит название ИМСИ (intracytoplasmic morphologically selected sperm injection — IMSI). Оценивают 6 клеточных структур: акросому, постакросомную пластинку, шейку, хвост, митохондрии и ядро. Исследование проводится в чашках со стеклянным дном. Присутствие вакуолей в головке сперматозоида часто ассоциируют с высоким индексом фрагментации ДНК и низкой ЧНБ. Так, по данным K. Knez и соавт. [20], ЧНБ у пациенток группы ИМСИ составила 48% по сравнению с 24% у пациенток контрольной группы. Авторы также отметили более высокую частоту оплодотворения и развития эмбрионов при использовании сперматозоидов без вакуолей. A. Setti и соавт. [21] в своей работе сделали акцент на прогностических возможностях MSOME. Авторы пришли к выводу, что присутствие больших (>13% от площади ядра) вакуолей в головке сперматозоидов коррелирует с численными аномалиями пронуклеусов, плохим дроблением и низким качеством бластоцист. Несмотря на то что существуют отдельные исследования, позволяющие положительно оценить эффективность ИМСИ, наиболее информативным можно считать Кохрановский метаанализ [22], в котором проведено сравнение ИМСИ и традиционной ИКСИ. Авторами проанализированы данные 2014 супружеских пар в программах ЭКО. Группа ИМСИ составила 1002 пары, контрольная группа ИКСИ — 1012. Результаты исследования показали, что ИМСИ не имеет преимуществ перед ИКСИ, не приводит к увеличению ЧНБ и не снижает частоту прерывания беременности. Авторы не рекомендуют данный метод селекции сперматозоида для рутинной практики. Остается дискуссионным и вопрос об оптимальном увеличении изображения при ИМСИ. Максимально полезное увеличение изображения обычно составляет ×1000 [23]. При использовании увеличения ×6000 и более артефакты можно принять за патологические структуры сперматозоида. Кроме того, данный метод удлиняет процедуру ЭКО.

Поляризационная микроскопия

Поляризационная микроскопия позволяет выявлять структуры, состоящие из высокоорганизованных молекул. Поляризованный свет, проходя через анизотропные структуры сперматозоида, преломляется на 2 луча, распространяющихся с разной скоростью, вследствие чего между ними возникает возрастающая разность фаз. Данное явление называется двойным лучепреломлением и проявляется в виде свечения, исходящего от этих структур. Анизотропными свойствами в ядре сперматозоида обладают продольно расположенные нуклеопротеиновые филаменты, а в акросоме — протеиновые филаменты. Поляризационная микроскопия позволяет оценить степень зрелости акросомы. Отсутствие свечения головки свидетельствует о незрелой акросоме. Частичное свечение головки сперматозоида в области постакросомной пластинки характерно для прореагировавшей акросомы. L. Gianaroli и соавт. [24] отметили повышение частоты имплантации при инъекции сперматозоидов с прореагировавшей акросомой (39% по сравнению с 8,6% у пациентов контрольной группы). C. Petersen и соавт. [25] пришли к выводу, что сперматозоиды с частичным свечением головки имеют приоритет при селекции для ИКСИ по сравнению со сперматозоидами с полным свечением головки или без него, так как такие сперматозоиды имеют менее выраженную фрагментацию ДНК. B. Vermey и соавт. [26] определили оптимальный размер фазового сдвига (свечения) головки сперматозоида (от 0,56 до 0,91 нм), при котором наблюдалась положительная корреляция с ЧНБ. A. Garolla и соавт. [27] предложили комбинировать поляризационную микроскопию и ИМСИ, что позволило уменьшить число сперматозоидов с фрагментированной ДНК до 2,8%.

Поляризационная микроскопия — это эффективный и перспективный метод, который можно использовать для селекции сперматозоидов как самостоятельно, так и в комбинации с другими методами. Однако необходимы дальнейшие мультицентровые исследования для определения его возможностей в повышении ЧНБ.

Микрофлюидика («лаборатория-на-чипе»)

Микрофлюидика — манипулирование клетками в малых объемах жидкости (от микролитров до пиколитров). В устройствах, работающих по принципу «лаборатория-на-чипе» («lab-on-chip»), имитируются условия для селекции сперматозоидов в микроканалах, близкие к физиологическим. Их можно разделить на несколько типов [28, 29]:

— использующие пассивное движение подвижных сперматозоидов по микроканалам;

— использующие реотаксис (сперматозоиды движутся против тока жидкости);

— использующие хемотаксис (сперматозоиды движутся в сторону хемоаттрактанта — клетки кумулюса, ацетилхолин);

— использующие термотаксис (сперматозоиды движутся по микроканалам в сторону области с более высокой температурой);

— комбинированные устройства.

Данные методики являются в большей степени экспериментальными, для их выполнения используют устройства в основном кустарного производства, что означает отсутствие единого стандарта в таких исследованиях. В экспериментальном исследовании K. Shirota и соавт. [30] продемонстрировано значительное сокращение частоты фрагментации ДНК сперматозоидов при использовании системы для сортировки клеток на основе чипа с микроканалами (0,8% по сравнению с 10,1% у пациентов контрольной группы с центрифугированием и swim-up). H. De Martin и соавт. [31] использовали явление реотаксиса для сортировки сперматозоидов. По сравнению со стандартным методом центрифугирования в двойном градиенте плотности авторы отметили лучшую морфологию сперматозоидов в исследуемых образцах и высокую степень зрелости хроматина. Дальнейшее изучение возможностей систем для клеточной сортировки на основе микрофлюидики представляется перспективным, в особенности в комбинации с импедансной и Рамановской спектроскопией [32].

Конфокальная Рамановская спектроскопия

В процессе Рамановской спектроскопии происходят возбуждение молекулы и переход ее из основного квантового состояния в колебательное квантовое с последующим возвращением в исходное. При этом возникает энергетический сдвиг между падающим и рассеянным светом, являющийся уникальной характеристикой каждой молекулы, что дает возможность производить химическую идентификацию соединений в образце (получить биохимический «отпечаток» клетки). Совмещение Рамановского спектроскопа с современным конфокальным микроскопом позволяет исследовать клетку на уровне органелл. Для возбуждения молекул используется видимый свет. В последнее десятилетие появляется все большее число работ, посвященных применению конфокальной Рамановской спектроскопии для исследования биологических тканей, живых клеток, субклеточных органелл и метаболических внутриклеточных процессов. Однако исследованию сперматозоидов посвящено не так много работ, несмотря на то что впервые Рамановская спектроскопия клетки выполнена именно на сперматозоиде лосося в 1986 г. [33].

T. Huser и соавт. [34] сравнивали Рамановские спектры, полученные от сперматозоидов с нормальной и аномальной морфологией. Исследователи пришли к выводу, что не всегда морфология сперматозоида коррелирует с правильной упаковкой его ядерной ДНК. K. Meister и соавт. [35] изучали спектры, полученные от субклеточных органелл, а также влияние на них ультрафиолетового излучения.

Дальнейшую работу по применению Рамановской спектроскопии в визуализации повреждений ядерной ДНК сперматозоидов продолжили C. Mallidis и соавт. [36], которые использовали ультрафиолетовое излучение для нарушения структуры ядерной ДНК сперматозоида, а V. Sánchez и соавт. [37] вызывали окислительное повреждение ДНК в реакции Фентона с перекисью водорода. Спектры, полученные со сперматозоидов, поврежденных таким образом, полностью соответствовали представленным ранее в работе C. Mallidis и соавт. [36]. Следует отметить, что все исследования до недавнего времени проводились на фиксированных клетках, и только в 2016 г. вышла работа X. Li и соавт. [38], в которой описано использование конфокальной Рамановской спектроскопии на нефиксированных живых сперматозоидах быка в микроканальном устройстве для микрофлюидики. Для удержания сперматозоида в фокусе использовали так называемый оптический (лазерный) пинцет. Данная методика пока является исключительно экспериментальной, но, несмотря на это, представляется весьма перспективной для дальнейших исследований [39].

Заключение

Несмотря на постоянное появление новых методов селекции сперматозоида для процедуры интрацитоплазматической инъекции сперматозоида, ни один из них на сегодняшний день не может считаться доказанно эффективным, т. е. способствующим повышению частоты наступления беременности. Ведется постоянный поиск новых методов, имеющих различные точки приложения: поверхностный заряд мембраны, маркеры апоптоза, зрелость акросомы, целостность ядерной ДНК. Оригинальной является гипотеза о том, что все изменения, выявленные разными методами, являются, по сути, разными стадиями одного процесса — апоптотической гибели сперматозоидов, начиная с ранних проявлений (изменения поверхностного заряда мембраны, экстернализация фосфатидилсерина на цитоплазматической мембране) и заканчивая относительно поздними процессами (фрагментация ядерной ДНК и формирование внутриядерных вакуолей). В связи с этим представляется целесообразным направить дальнейшие исследования не только на поиск новых методов, но и на сочетание уже имеющихся. Безусловно, для проведения статистически значимых и релевантных исследований необходимы стандартизация методов, тщательный подбор групп пациентов и строгий контроль на каждом этапе выполнения.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.

Сведения об авторах

Р.В. Назаренко — д.м.н., проф. ООО «Клиника профессора Здановского», Москва, Россия; e-mail: nazruslan@yandex.ru; https://orcid. org/0000-0002-0185-6340

В.М. Здановский — д.м.н., проф., ООО «Клиника профессора Здановского», Москва, Россия

Автор, ответственный за переписку: Назаренко Р.В. — д.м.н., проф., ООО «Клиника профессора Здановского», Москва, Россия; e-mail: nazruslan@yandex.ru

Corresponding author: R.V. Nazarenko — Doct. Med. Sci., Professor, Zdanovskiy medical centre, Moscow, Russia, 115191;
e-mail: nazruslan@yandex.ru

Список литературы:

  1. Cho CL, Agarwal A. Role of sperm DNA fragmentation in male factor infertility: A systematic review. Arab Journal of Urology. 2018;16(1):21-34. https://doi.org/10.1016/j.aju.2017.11.002
  2. Parmegiani L, Cognigni GE, Bernardi S, Troilo E, Taraborrelli S, Arnone A, Maccarini AM, Filicori M. Comparison of two ready-to-use systems designed for sperm-hyaluronic acid binding selection before intracytoplasmic sperm injection: PICSI vs. Sperm Slow: a prospective, randomized trial. Fertility and Sterility. 2012;98(3):632-637. https://doi.org/10.1016/j.fertnstert.2012.05.043
  3. Worrilow KC, Eid S, Woodhouse D, Perloe M, Smith S, Witmyer J, Ivani K, Khoury C, Ball GD, Elliot T, Lieberman J. Use of hyaluronan in the selection of sperm for intracytoplasmic sperm injection (ICSI): significant improvement in clinical outcomes-multicenter, double-blinded and randomized controlled trial. Human Reproduction. 2012;28(2):306-314. https://doi.org/10.1093/humrep/des417
  4. Jakab A, Sakkas D, Delpiano E, Cayli S, Kovanci E, Ward D, Revelli A, Huszar G. Intracytoplasmic sperm injection: a novel selection method for sperm with normal frequency of chromosomal aneuploidies. Fertility and Sterility. 2005;84(6):1665-1673. https://doi.org/10.1016/j.fertnstert.2005.05.068
  5. Huszar G, Ozkavukcu S, Jakab A, Celik-Ozenci C, Sati GL, Cayli S. Hyaluronic acid binding ability of human sperm reflects cellular maturity and fertilizing potential: selection of sperm for intracytoplasmic sperm injection. Current Opinion in Obstetrics and Gynecology. 2006;18(3):260-267. https://doi.org/10.1097/01.gco.0000193018.98061.2f
  6. Huszar G, Jakab A, Sakkas D, Ozenci C-C, Cayli S, Delpiano E, Ozkavukcu S. Fertility testing and ICSI sperm selection by hyaluronic acid binding: clinical and genetic aspects. Reproductive BioMedicine Online. 2007;14(5):650-663. https://doi.org/10.1016/s1472-6483(10)61060-7
  7. Tarozzi N, Nadalini M, Bizzaro D, Serrao L, Fava L, Scaravelli G, Borini A. Sperm-hyaluronan-binding assay: clinical value in conventional IVF under Italian law. Reproductive BioMedicine Online. 2009;19(Suppl 3):35-43. https://doi.org/10.1016/s1472-6483(10)60282-9
  8. Parmegiani L, Cognigni GE, Ciampaglia W, Pocognoli P, Marchi F, Filicori M. Efficiency of hyaluronic acid (HA) sperm selection. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 2009;27(1):13-16. https://doi.org/10.1007/s10815-009-9380-0
  9. McDowell S, Kroon B, Ford E, Hook Y, Glujovsky D, Yazdani A. Advanced sperm selection techniques for assisted reproduction. The Cochrane Database of Systematic Reviews. 2014;10:CD010461. https://doi.org/10.1002/14651858.cd010461.pub2
  10. Chan PJ, Jacobson JD, Corselli JU, Patton WC. A simple zeta method for sperm selection based on membrane charge. Fertility and Sterility. 2006;85(2):481-486. https://doi.org/10.1016/j.fertnstert.2005.07.1302
  11. Kheirollahi-Kouhestani M, Razavi S, Tavalaee M, Deemeh MR, Mardani M, Moshtaghian J, Nasr-Esfahani MH. Selection of sperm based on combined density gradient and Zeta method may improve ICSI outcome. Human Reproduction. 2009;24(10):2409-2416. https://doi.org/10.1093/humrep/dep088
  12. Nasr Esfahani MH, Deemeh MR, Tavalaee M, Sekhavati MH, Gourabi H. Zeta sperm selection improves pregnancy rate and alters sex ratio in male factor infertility patients: a double-blind, randomized clinical trial. International Journal of Fertility and Sterility. 2016;10(2):253-260.
  13. Simon L, Murphy K, Aston KI, Emery BR, Hotaling JM, Carrell DT. Optimization of microelectrophoresis to select highly negatively charged sperm. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 2016;33(6):679-688. https://doi.org/10.1007/s10815-016-0700-x
  14. Ainsworth C, Nixon B, Jansen RPS, Aitken RJ. First recorded pregnancy and normal birth after ICSI using electrophoretically isolated spermatozoa. Human Reproduction. 2006;22(1):197-200. https://doi.org/10.1093/humrep/del351
  15. Weng SL, Taylor SL, Morshedi M, Schuffner A, Duran EH, Beebe S, Oehninger S. Caspase activity and apoptotic markers in ejaculated human sperm. Molecular Human Reproduction. 2002;8(11):984-991. https://doi.org/10.1093/molehr/8.11.984
  16. Gil M, Sar-Shalom V, Melendez Sivira Y, Carreras R, Checa MA. Sperm selection using magnetic activated cell sorting (MACS) in assisted reproduction: a systematic review and metaanalysis. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 2013;30(4):479-485. https://doi.org/10.1007/s10815-013-9962-8
  17. Lee TH, Liu CH, Shih YT, Tsao HM, Huang CC, Chen HH, Lee MS. Magnetic-activated cell sorting for sperm preparation reduces spermatozoa with apoptotic markers and improves the acrosome reaction in couples with unexplained infertility. Human Reproduction. 2010;25(4):839-846. https://doi.org/10.1093/humrep/deq009
  18. Odhiambo JF, DeJarnette JM, Geary TW, Kennedy CE, Suarez SS, Sutovsky M, Sutovsky P. Increased conception rates in beef cattle inseminated with nanopurified bull semen. Biology of Reproduction. 2014;91(4). https://doi.org/10.1095/biolreprod.114.121897
  19. Bartoov B, Berkovitz A, Eltes F. Selection of spermatozoa with normal nuclei to improve the pregnancy rate with intracytoplasmic sperm injection. New England Journal of Medicine. 2001;345(14):1067-1068. https://doi.org/10.1056/nejm200110043451416
  20. Knez K, Tomazevic T, Zorn B, Vrtacnik-Bokal E, Virant-Klun I. Intracytoplasmic morphologically selected sperm injection improves development and quality of preimplantation embryos in teratozoospermia patients. Reproductive BioMedicine Online. 2012;25(2):168-179. https://doi.org/10.1016/j.rbmo.2012.03.011
  21. Setti AS, Braga DP de AF, Vingris L, Serzedello T, Figueira R de C, Iaconelli A, Borges E Jr. Sperm morphological abnormalities visualised at high magnification predict embryonic development, from fertilization to the blastocyst stage, in couples undergoing ICSI. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 2014;31(11):1533-1539. https://doi.org/10.1007/s10815-014-0326-9
  22. Teixeira DM, Barbosa MA, Ferriani RA, Navarro PA, Raine-Fenning N, Nastri CO, Martins WP. Regular (ICSI) versus ultra-high magnification (IMSI) sperm selection for assisted reproduction. The Cochrane Database of Systematic Reviews. 2013;7:CD010167. https://doi.org/10.1002/14651858.cd010167.pub2
  23. Sakkas D, Ramalingam M, Garrido N, Barratt CL. Sperm selection in natural conception: what can we learn from Mother Nature to improve assisted reproduction outcomes? Human Reproduction Update. 2015;21(6):711-726. https://doi.org/10.1093/humupd/dmv042
  24. Gianaroli L, Magli MC, Ferraretti AP, Crippa A, Lappi M, Capitani S, Baccetti B. Birefringence characteristics in sperm heads allow for the selection of reacted spermatozoa for intracytoplasmic sperm injection. Fertility and Sterility. 2010;93(3):807-813. https://doi.org/10.1016/j.fertnstert.2008.10.024
  25. Petersen CG, Vagnini LD, Mauri AL, Massaro FC, Cavagna M, Baruffi RL, Oliveira JB, Franco JG Jr. Relationship between DNA damage and sperm head birefringence. Reproductive BioMedicine Online. 2011;22(6):583-589. https://doi.org/10.1016/j.rbmo.2011.03.017
  26. Vermey BG, Chapman MG, Cooke S, Kilani S. The relationship between sperm head retardance using polarized light microscopy and clinical outcomes. Reproductive BioMedicine Online. 2015;30(1):67-73. https://doi.org/10.1016/j.rbmo.2014.09.011
  27. Garolla A, Cosci I, Menegazzo M, De Palo R, Ambrosini G, Sartini B, Pizzol D, Foresta C. Sperm selected by both birefringence and motile sperm organelle morphology examination have reduced deoxyribonucleic acid fragmentation. Fertility and Sterility. 2014;101(3):647-652. https://doi.org/10.1016/j.fertnstert.2013.11.029
  28. Knowlton SM, Sadasivam M, Tasoglu S. Microfluidics for sperm research. Trends in Biotechnology. 2015;33(4):221-229. https://doi.org/10.1016/j.tibtech.2015.01.005
  29. Nosrati R, Graham PJ, Zhang B, Riordon J, Lagunov A, Hannam TG, Escobedo C, Jarvi K, Sinton D. Microfluidics for sperm analysis and selection. Nature reviews. Urology. 2017;14(12):707-730. https://doi.org/10.1038/nrurol.2017.175
  30. Shirota K, Yotsumoto F, Itoh H, Obama H, Hidaka N, Nakajima K, Miyamoto S. Separation efficiency of a microfluidic sperm sorter to minimize sperm DNA damage. Fertility and Sterility. 2016;105(2):315-321.e1. https://doi.org/10.1016/j.fertnstert.2015.10.023
  31. De Martin H, Cocuzza MS, Tiseo BC, Wood GJA, Miranda EP, Monteleone PAA, Soares JM Jr, Serafini PC, Srougi M, Baracat EC. Positive rheotaxis extended drop: a one-step procedure to select and recover sperm with mature chromatin for intracytoplasmic sperm injection. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 2017;34(12):1699-1708. https://doi.org/10.1007/s10815-017-1024-1
  32. De Wagenaar B, Berendsen JTW, Bomer JG, Olthuis W, van den Berg A, Segerink LI. Microfluidic single sperm entrapment and analysis. Lab on a Chip. 2015;15(5):1294-1301. https://doi.org/10.1039/c4lc01425a
  33. Kubasek WL, Wang Y, Thomas GA, Patapoff TW, Schoenwaelder KH, Van der Sande JH, Peticolas WL. Raman spectra of the model B-DNA oligomer d(CGCGAATTCGCG)2 and of the DNA in living salmon sperm show that both have very similar B-type conformations. Biochemistry. 1986;25(23):7440-7445. https://doi.org/10.1021/bi00371a028
  34. Huser T, Orme CA, Hollars CW, Corzett MH, Balhorn R. Raman spectroscopy of DNA packaging in individual human sperm cells distinguishes normal from abnormal cells. Journal of Biophotonics. 2009;2(5):322-332. https://doi.org/10.1002/jbio.200910012
  35. Meister K, Schmidt DA, Bründermann E, Havenith M. Confocal Raman microspectroscopy as an analytical tool to assess the mitochondrial status in human spermatozoa. Analyst. 2010;135(6):1370-1374. https://doi.org/10.1039/b927012d
  36. Mallidis C, Wistuba J, Bleisteiner B, Damm OS, Gross P, Wübbeling F, Fallnich C, Burger M, Schlatt S. In situ visualization of damaged DNA in human sperm by Raman microspectroscopy. Human Reproduction. 2011;26(7):1641-1649. https://doi.org/10.1093/humrep/der122
  37. Sánchez V, Redmann K, Wistuba J, Wübbeling F, Burger M, Oldenhof H, Wolkers WF, Kliesch S, Schlatt S, Mallidis C. Oxidative DNA damage in human sperm can be detected by Raman microspectroscopy. Fertility and Sterility. 2012;98(5):1124-1129.e3. https://doi.org/10.1016/j.fertnstert.2012.07.1059
  38. Li XX, Wang M, Chen HH, Li QY, Yang H, Xu HY, Lu YQ, Zhang M, Yang XG, Lu SS, Lu KH. Flow cytometric and near-infrared Raman spectroscopic investigation of quality in stained, sorted, and frozen-thawed buffalo sperm. Animal Reproduction Science. 2016;170:90-99. https://doi.org/10.1016/j.anireprosci.2016.04.008
  39. Nazarenko RV, Irzhak AV, Pomerantsev AL, Rodionova OY. Confocal Raman spectroscopy and multivariate data analysis for evaluation of spermatozoa with normal and abnormal morphology. A feasibility study. Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems. 2018;182:172-179. https://doi.org/10.1016/j.chemolab.2018.10.002