Введение

В 1926 г. британский физиолог и фармаколог Филипп Смит разработал способ удаления передней доли гипофиза грызунов (кроликов, крыс и мышей) без повреждения задней доли гипофиза или повреждения головного мозга животного и причинения животному немедленного летального исхода. При этом он обнаружил, что у подвергнутых передней гипофизэктомии животных быстро развиваются атрофия щитовидной железы, коры надпочечников и половых желез. Все эти явления полностью обращались вспять при введении гипофизэктомированным животным внутрибрюшинно или подкожно водно-спиртовых экстрактов из передней доли гипофиза [1].

Это наблюдение дало Ф. Смиту основание предположить, что передняя доля гипофиза производит какие-то гормонально активные вещества, стимулирующие и поддерживающие деятельность эндокринных желез. Он назвал эти гипотетические управляющие (тропные) гормоны, влияющие на деятельность щитовидной железы, коры надпочечников и половых желез, соответственно тиротропином, кортикотропином и гонадотропином. При этом Ф. Смит, разумеется, еще не имел представления о том, что гонадотропных гормонов на самом деле существует три — фоллитропин, лютропин и пролактин [1].

Однако при попытке выделить эти гипотетические гормоны в чистом виде из экстрактов передней доли гипофиза кроликов Ф. Смит потерпел неудачу. Только в 1933 г. биохимик Джеймс Коллип (участвовавший ранее в очистке инсулина в совместной работе с Фредериком Бантингом и Чарльзом Бестом) сумел выделить и провести примитивную очистку самого простого из гормонов передней доли гипофиза — кортикотропина, или адренокортикотропного гормона (АКТГ), состоящего всего из 39 аминокислотных остатков. Уже к 1943 г. процедуры очистки этого гормона значительно усовершенствованы [1].

Фоллитропин же, молекула которого устроена гораздо сложнее, чем молекула АКТГ, долгое время не поддавался очистке и выделению в свободном виде (см. рисунок). Впервые выделить чистый фоллитропин (фолликулостимулирующий гормон — ФСГ) из экстрактов передней доли гипофиза овец удалось в 1949 г. коллективу японских ученых под руководством Ли [1]. Этот гормон оказался по своему строению гликопротеином с молекулярной массой около 35 500 Да. Он представляет собой гетеродимерный комплекс, состоящий из двух субъединиц (α- и β-). При этом обе субъединицы необходимы для проявления биологической активности гормона [1].

Рис. Молекула фоллитропина человека. Субъединицы и функциональные группы выделены разными цветами.

Кроме того, выяснилось, что сразу после синтеза обеих полипептидных цепочек (α-субъединицы и β-субъединицы) ФСГ не проявляет никакой биологической активности. Для ее проявления необходима посттрансляционная модификация получившегося белка (гликирование с присоединением к остаткам аспарагина в строго определенных местах молекулы остатков N-ацетилгалактозамина, маннозы, N-ацетилглюкозамина, галактозы и сиаловой кислоты в строго определенном порядке) [1].

Альфа(α)-субъединица ФСГ состоит из 92 аминокислот и полностью идентична α-субъединицам других гликопротеиновых гормонов передней доли гипофиза (лютеинизирующего и тиреотропного гормонов), а также α-субъединице хорионического гонадотропина человека (ХГЧ), производимого плацентой [2]. Ген универсальной α-субъединицы, общей для всех этих гормонов, расположен у человека на хромосоме 6q14.3. Бета(β)-субъединица ФСГ уникальна для этого гормона, состоит из 111 аминокислот и кодируется геном, расположенным у человека на хромосоме 11p13. Именно β-субъединица ФСГ отвечает за взаимодействие готового гетеродимерного белка ФСГ с его специфическим рецептором (рецептором ФСГ) [1].

Фоллитропины человека: чем они отличаются

Первоначально человеческий фоллитропин получали, выделяя его из мочи женщин, находящихся в ранней постменопаузе, когда секреция ФСГ передней долей гипофиза и его выделение с мочой резко возрастает. Однако фоллитропин, выделенный из мочи женщин в постменопаузе, подвергся частичной биотрансформации за время своего существования в организме. Поэтому он несколько отличается по своему строению и биологическим свойствам от того фоллитропина, который изначально выделен в кровь этой же женщины клетками передней доли ее гипофиза. В частности, различаются некоторые места гликирования в молекуле [1].

Поэтому фоллитропин, выделенный из мочи женщин, находящихся в постменопаузе, называют менотропином или урофоллитропином (чтобы подчеркнуть как его происхождение, так и его биологические отличия от исходного, не подвергшегося биотрансформации фоллитропина, производимого передней долей гипофиза) [1].

С развитием технологий генной инженерии стало возможным получение очищенного рекомбинантного человеческого фоллитропина без использования мочи женщин в постменопаузе. Современная технология производства рекомбинантных фоллитропинов человека заключается в генетической модификации культуры клеток яичника хомячка с внедрением в нее генов α-субъединицы и β-субъединицы человеческого фоллитропина и последующим использованием этих клеток для производства нужного белка [1].

Разные версии этой технологии приводят к получению немного разных рекомбинантных фоллитропинов человека, которые полностью совпадают по аминокислотной последовательности (первичной структуре), но могут немного различаться по местам посттрансляционного гликирования в готовой молекуле или по особенностям свертки третичной структуры [2].

Первопроходцем технологии рекомбинантных фоллитропинов человека была компания Serono, ныне входящая в состав международной фармацевтической компании Merck KGaA, чья штаб-квартира располагается в Дармштадте (Германия). Ее вариант фоллитропина человека, впервые созданный в 1988 г., получил название фоллитропин альфа. В этом названии подразумевается вовсе не то, что фоллитропин альфа содержит только α-субъединицу, — он, как и любые другие активные формы ФСГ, по определению обязан содержать обе субъединицы — α- и β-; фоллитропину альфа присвоена первая буква греческого алфавита, поскольку это исторически первый рекомбинантный фоллитропин человека [2].

В 1995 г. фоллитропин альфа этой фирмы получил разрешение на клиническое применение в странах ЕС как у мужчин, так и у женщин под торговым названием GONAL-f [3]. В США аналогичное разрешение выдано FDA в 2004 г. [4].

Позднее стали доступны две другие биологически подобные версии фоллитропина альфа, также предназначенные для использования как у мужчин, так и у женщин: препарат Ovaleap компании Teva BV (Нидерланды), которая получила разрешение на его продажу и клиническое применение в странах ЕС в 2013 г. [5], и препарат Bemfola (Afolia) компании Finox Biotech AG (Лихтенштейн), которая получила разрешение на его продажу и клиническое использование в ЕС годом позже — в 2014 г. [6].

Другие модификации этой же генно-инженерной технологии привели к получению несколько отличающихся фоллитропинов человека — фоллитропина бета, фоллитропина гамма и фоллитропина дельта [2].

Для проявления физиологической и фармакологической активности ФСГ обе субъединицы белка ФСГ должны быть гликированы как минимум в следующих обязательных (мандаторных) местах молекулы: α-субъединица — по остаткам аспарагина в 51-й и 78-й позициях, β-субъединица — по остаткам аспарагина в 7-й и 24-й позициях. Дополнительные (факультативные) места гликирования, а также разница в конкретных боковых цепях конкретных моносахаридов, присоединяемых к остаткам аспарагина, предопределяют различия между разновидностями генно-инженерного человеческого фоллитропина, производимыми разными фирмами (альфа, бета, гамма и дельта), а также между ними и природным человеческим фоллитропином [2].

Несмотря на то что разнообразные тесты на животных в целом не позволяют обнаружить никакой разницы в биологической активности между разновидностями фоллитропина (например, между фоллитропином альфа и фоллитропином бета) и используются для доказательства их биологического подобия, в клинической практике показано, что у человека их биологическая активность может несколько различаться [2].

В частности, фоллитропин альфа, применяемый в комплексе мер для индукции овуляции перед естественным зачатием или перед экстракорпоральным оплодотворением (ЭКО), имеет тенденцию к повышению частоты успешных беременностей, в то время как фоллитропин бета в тех же клинических условиях обеспечивает несколько меньшую частоту успешных беременностей, но зато сильнее стимулирует продукцию яичниками эстрогенов, в первую очередь эстрадиола [2].

Иммуногенность разных фоллитропинов человека

Как известно, любой пептидный или белковый препарат, вводимый в организм человека или животного, способен проявлять иммуногенные свойства (то есть служить причиной образования у человека или животного антител к этому пептиду или белку). Не являются исключением из этого правила и пептидные гормоны. Так, в частности, в период, когда в медицине широко применялись инсулины крупного рогатого скота (КРС) и свиней, часто встречались аллергические реакции на них, связанные с образованием антител класса IgE, а также отмечалось снижение или полное отсутствие гипогликемического эффекта от вводимого инсулина, связанное с образованием нейтрализующих антител класса IgG. Это послужило в конечном итоге причиной полного отказа от применения в медицине инсулина КРС, а затем и от применения более близкого к человеческому инсулина свиней и полного перехода к использованию исключительно генно-инженерного человеческого инсулина, который обладает меньшей аллергенностью и меньшей потенциальной иммуногенностью [7, 8].

Однако неверно полагать, будто иммуногенностью обладают только чужеродные белки. Хорошо известен феномен образования антител и к генно-инженерному человеческому инсулину, и к другим, формально биологически подобным человеческим, белкам, пептидным продуктам генной инженерии. Это связано с тем, что производство и очистка генно-инженерных продуктов является весьма сложным делом и даже небольшие вариации в применяемой технологии могут значительно влиять на степень очистки конечного препарата (наличие в нем примесей, которые тоже могут обладать потенциальной иммуногенностью или аллергенностью), а также на процессы посттрансляционной модификации и/или третичной и четвертичной свертки белка даже при одинаковой аминокислотной последовательности (задаваемой геном, пересаженным в бактериальную или эукариотическую клетку) [9].

Разумеется, проблема потенциальной иммуногенности и связанного с этим возможного снижения эффективности терапии (или даже полного отсутствия эффекта от нее) или же риска возникновения аллергических реакций и осложнений, таких как сывороточная болезнь, касается и препаратов рекомбинантного человеческого фоллитропина [9].

В связи с этим большое научное и практическое значение имеет изучение вопроса о том, какие из препаратов фоллитропина обладают наименьшей потенциальной иммуногенностью, а значит, и наименьшим риском потери эффективности или вызывания побочных эффектов и аллергических реакций, вплоть до анафилаксии, при повторных введениях. Ниже мы представим найденные нами данные литературы по этому вопросу.

По данным литературы, препараты фоллитропина в целом обладают очень низкой иммуногенностью в отличие от многих других пептидных препаратов (например, в отличие от многих моноклональных антител, таких как ритуксимаб, или даже от генно-инженерных препаратов инсулина). Тем не менее разные препараты фоллитропина от разных производителей могут обладать разной степенью иммуногенности. Эти различия могут иметь важное клиническое значение [10].

Риск образования антител к фоллитропину зависит также от многих других факторов, таких как общая экспозиция по отношению к фоллитропину (общая длительность лечения, количество курсов лечения, продолжительность каждого курса, разовая и суммарная курсовая доза, частота введения, способ введения). Он может зависеть даже от конкретной партии препарата и от условий его хранения, способных изменить хрупкую третичную структуру этого белка, или от небольших модификаций в производственном процессе конкретной фирмы [10].

В 2016 г. опубликованы результаты открытого исследования фазы III, являющегося продолжением двойного слепого рандомизированного контролируемого исследования (РКИ). Проведено сравнение эффективности и безопасности препарата фоллитропина альфа Ovaleap с эффективностью и безопасностью референсного фоллитропина альфа — GONAL-f компании Merck Serono. В этом же открытом исследовании женщинам, у которых не наступила беременность во время первого (рандомизированного) овуляторного цикла, предлагалось уже в открытом режиме продолжить получать тот же препарат на протяжении еще 1—2 циклов. При этом изучалась не только сравнительная эффективность и безопасность обоих препаратов, но и их сравнительная иммуногенность, так как она имеет большее значение при повторных введениях фоллитропина [11].

Как у женщин, получавших GONAL-f, так и у женщин, получавших Ovaleap, регистрировался очень низкий уровень иммуногенности (6 женщин группы Ovaleap и 2 женщины группы GONAL-f). Из-за низкого уровня иммуногенности у женщин обеих групп и небольшого размера выборки (147 женщин суммарно дошли до 2-го цикла, 61 женщина — до 3-го цикла применения выбранного препарата) разница между группами не достигла статистической значимости, однако здесь виден числовой тренд в пользу меньшей иммуногенности GONAL-f. Ни у одной из женщин обеих групп, у которых проявились антитела к ФСГ, не зарегистрированы аллергические реакции, развитие сывороточной болезни или другие иммунные осложнения. Кроме того, выявленные у них антитела не обладали большой нейтрализующей силой, относились к классу IgA и быстро исчезали из крови после прекращения терапии экзогенным ФСГ [11].

В 2017 г. опубликован интересный обзор, в котором описывались результаты двух РКИ. Одно посвящено сравнению иммуногенности двух разных препаратов рекомбинантного человеческого фоллитропина альфа — препарата Fostimon (IBSA, Швейцария) и референсного препарата GONAL-f (Merck, Германия), а другое — сравнению иммуногенности двух разных менотропинов (вариантов ФСГ, получаемых из мочи женщин в постменопаузе) — нового препарата Meriofert, производимого той же швейцарской компанией IBSA, и эталонного препарата — Menopur производства компании Ferring Pharmaceuticals, тоже расположенной в Швейцарии. Иммуногенность всех четырех изученных фоллитропинов оказалась сопоставимой и очень низкой. Вместе с тем наблюдался числовой тренд в пользу более низкой иммуногенности оригинального препарата GONAL-f по сравнению с новым «биологически подобным» препаратом компании IBSA. Следует отметить, что традиционное убеждение многих врачей-репродуктологов о более низкой иммуногенности менотропинов по сравнению с рекомбинантными человеческими фоллитропинами не нашло в этом исследовании научного подтверждения: прямого сравнения между ними не проводилось, но частота образования антител и их средний уровень были примерно одинаковыми в обеих группах менотропинов и в группе GONAL-f [12].

В 2019 г. индийские ученые предприняли довольно крупное (285 женщин-участниц в возрасте от 20 до 40 лет, которые не могли забеременеть естественным путем в течение как минимум 2 лет до момента включения в исследование) многоцентровое двойное слепое постмаркетинговое РКИ IV фазы, посвященное изучению вопроса о сравнительной эффективности и безопасности, в том числе сравнительной иммуногенности, препарата фоллитропина альфа Foligraf производства компании Bharat Serums and Vaccines Ltd., расположенной в Мумбаи (Индия), и эталонного препарата фоллитропина альфа — GONAL-f производства компании Merck — создателя рекомбинантного фоллитропина человека [10].

Все женщины, которые приняли участие в этом РКИ, рандомизированы в две группы: одна (143 женщины) получала Foligraf, другая (141 женщина) — GONAL-f. В общей сложности проведено 354 цикла стимуляции овуляции (некоторые женщины достигли успеха в первом же цикле, некоторые — при повторных стимуляциях). Некоторые женщины пытались забеременеть естественным (интравагинальным) путем в дни овуляции, другие получали препараты фоллитропина альфа в качестве составной части режима подготовки к ЭКО. Средние дозы фоллитропина альфа, использовавшиеся для стимуляции естественной овуляции, у женщин обеих групп (Foligraf и GONAL-f) незначительно различались и составляли 816±543 IU на протяжении 8,1±3,6 дня и 812±231 IU на протяжении 7,2±2,4 дня соответственно. Средние дозы фоллитропина альфа, использовавшиеся для стимуляции суперовуляции в рамках подготовки к ЭКО, были значительно выше: 2183±869 IU на протяжении 9,5±2,2 дня у женщин группы Foligraf и 2170±754 IU на протяжении 8,4±2,4 дня у женщин группы GONAL-f (A. Majumdar и соавт., 2019) [10].

Авторы этого РКИ показали, что оба изученных ими препарата фоллитропина альфа обладают хорошими параметрами эффективности и безопасности, в частности очень низкой иммуногенностью. Так, образование антител к фоллитропину наблюдалось у незначительного меньшинства женщин обеих групп: у 3 женщин, получавших Foligraf, и у 1 женщины, получавшей GONAL-f. Ни в одном из этих случаев выделенные у них антитела к фоллитропину не обладали сильной нейтрализующей активностью (не мешали дальнейшему проведению терапии фоллитропином) и не послужили причиной развития аллергических реакций. Более того, у женщин обеих групп антитела к фоллитропину оказались короткоживущими — они исчезли из крови женщин при повторном тестировании — спустя 3 мес после последнего введения фоллитропина альфа [10].

Вместе с тем авторы данного РКИ заключили, что GONAL-f проявлял тенденцию к очевидно меньшей иммуногенности по сравнению с Foligraf. Не только количество женщин, у которых обнаружено образование антител к фоллитропину, было меньшим в группе GONAL-f (одна женщина по сравнению с тремя в группе Foligraf), но и уровень антител у этой женщины оказался ниже, чем уровни антител у женщин, получавших Foligraf. Авторы сделали вывод, что изученный ими препарат фоллитропина альфа производства Индии является вполне пригодным для клинического применения, эффективным и безопасным, тем не менее процесс его производства, очевидно, нуждается в усовершенствовании, в том числе для снижения иммуногенности и повышения эффективности, поскольку он по этим параметрам все еще уступает эталонному препарату — GONAL-f [10].

В другом недавнем, также 2019 г., двойном слепом РКИ III фазы сравнивали эффективность и безопасность, в том числе иммуногенность, фоллитропина альфа (эталонного препарата — GONAL-f) и планируемого к регистрации фоллитропина дельта. И вновь иммуногенность обоих препаратов оказалась очень низкой и сопоставимой (0,8% у GONAL-f и 1,1% у фоллитропина дельта). Сопоставимыми оказались и другие параметры эффективности и безопасности: частота успешных индукций овуляции, количество извлеченных зрелых ооцитов, частота успешного оплодотворения, количество родившихся живыми детей [13]. Из-за столь небольшой разницы в иммуногенности, не достигающей статистической значимости, трудно сделать вывод о преимуществе по этому параметру какого-либо из двух препаратов. Тем не менее в этом исследовании, как и в других, наблюдается числовой тренд в пользу несколько меньшей иммуногенности Gonal-F по сравнению с планируемым к регистрации фоллитропином дельта [13].

В том же 2019 г. группа российских авторов во главе с А.А. Солдатовым опубликовала в престижном журнале Current Medical Research and Opinion большой обзор о «биологически подобных» пептидных гормонах. В нем они подвергли уничтожающей критике саму концепцию «биологического подобия» (biosimilarity), указав, что она является чисто маркетинговой концепцией, «продавленной» через регулирующие органы разных стран фармацевтическими компаниями, производящими «биологически подобные» пептидные продукты, в целях «облегчения и упрощения» себе жизни и уменьшения расходов на дополнительные исследования своих препаратов перед регистрацией [14].

Подобно производству биоэквивалентных дженериков оригинальных брендовых препаратов из числа «малых молекул», разрешение на производство «биологически подобных» пептидных препаратов другие компании могут получить только после того, как истечет срок патентной монополии оригинального производителя. Теоретически это могло бы принести общественную пользу за счет усиления конкуренции на рынке, снижения стоимости биологических белковых препаратов и повышения их доступности для пациентов. Как известно, с дженериковыми версиями оригинальных брендовых препаратов из числа «малых молекул», а в конечном итоге и с самим брендовым препаратом обычно происходит именно это [14].

Однако авторы этого обзора справедливо указывают, что концепция «биологического подобия» для пептидных препаратов — совершенно не равнозначна концепции «биоэквивалентности» для препаратов из числа «малых молекул». Если для дженерикового препарата, допустим флуоксетина, действительно достаточно показать его фармакокинетическую эквивалентность оригиналу (то есть то, что он создает примерно такую же концентрацию флуоксетина в плазме крови и имеет примерно такую же ROC-кривую ее изменения, как и оригинальный препарат), а также отсутствие в дженериковом препарате недопустимых примесей и не нужно проводить дополнительные РКИ по его эффективности и безопасности (которые проведены при регистрации бренда), то для пептидных препаратов это «так не работает» [14].

Дело в том, что пептидные гормоны разных производителей могут, совпадая по аминокислотной последовательности (задаваемой генной инженерией), тем не менее значительно отличаться от референсного препарата (препарата оригинального производителя). Они могут различаться по местам гликирования (или другой необходимой посттрансляционной модификации), по особенностям свертки третичной и четвертичной структуры белка, по спектру и характеру присутствующих в препарате примесей и т.д. Все это может обусловливать различия и в эффективности, и в безопасности, и в иммуногенности «биологически подобных» препаратов по сравнению с оригиналом [14].

Далее авторы этого обзора доказывают свой тезис на конкретных примерах, в том числе на примерах разных препаратов рекомбинантного человеческого гормона роста, рекомбинантного генно-инженерного инсулина человека, рекомбинантного фоллитропина, и делают заключение, что концепция «биологического подобия» нуждается в значительном изменении и улучшении (если не в радикальном отвержении) и что для «биологически подобных» препаратов помимо доказательства их «биологического подобия» оригиналу требуются также более строгие доказательства их безопасности и низкой иммуногенности, возможно столь же строгие, как при регистрации оригинального референсного препарата [14].

А до того как регулирующие органы разных стран придут к мысли о необходимости отказа от концепции «биологического подобия» для пептидных препаратов или о необходимости значительной модификации этой концепции и повышения стандартов безопасности, авторы этого обзора рекомендуют практикующим врачам из соображений безопасности пациентов по возможности отдавать предпочтение пептидным гормонам от оригинального производителя, то есть в случае фоллитропинов — препарату GONAL-f [14].

Заключение

Как видно из приведенных нами данных литературы, рекомбинантные фоллитропины человека в целом как класс препаратов обладают достаточно низкой иммуногенностью. Тем не менее между разными препаратами рекомбинантного фоллитропина человека существуют некоторые различия по этому параметру, обусловленные различиями в технологиях производства и очистки, характером и наличием гликирования молекулы фолликулостимулирующего гормона в факультативных местах гликирования, характером присоединяемых моносахаридных остатков в облигатных местах гликирования и т.д.

Имеющиеся данные литературы позволяют утверждать, что гонал-ф, являющийся оригинальным (исторически первым на рынке) препаратом рекомбинантного фоллитропина альфа, имеет преимущество перед рядом более поздних аналогов фоллитропина альфа от других производителей по параметру иммуногенности. Он также демонстрирует по этому параметру превосходство над фоллитропинами бета и дельта и сопоставимую с менотропинами (вариантами фолликулостимулирующего гормона, получаемого из мочи женщин, находящихся в постменопаузе) иммуногенность.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.