Введение
В настоящее время показано, что клиническая оценка эндометриоза зависит от нашего восприятия патофизиологии, а лечение должно основываться на доказательствах. Однако клиническая оценка может варьировать в зависимости от понимания патофизиологии эндометриоза [1].
С момента своего открытия 25 лет назад в качестве основного белка центральной нервной системы (ЦНС) C-концевая убиквитин гидролаза-L1 (UCH-L1) превратилась в важный фермент, регулирующий метаболизм белков головного мозга за счет протеасомального пути деградации белка. Случаи потери активности UCH-L1 включены в семейную и спорадическую болезнь Паркинсона и другие хронические нейродегенеративные заболевания, например, болезнь Альцгеймера. Кроме того, некоторые посттрансляционные модификации UCH-L1 могут способствовать превращению цитозольного UCH-L1 (C) в мембраносвязанную форму UCH-L1 (M), которая играет роль в формировании альфа-синуклеинопатии. Нацеливание на преобразование UCH-L1 (C) в форму UCH-L1 (M) может быть ключом к развитию терапии нейродегенеративных заболеваний, связанных с UCH-L1. UCH-L1 также становится перспективным нейронным биомаркером черепно-мозговой травмы, ишемического инсульта, детской гипоксически-ишемической энцефалопатии, повреждение спинного мозга, эпилептического припадка и остановки сердца. Эти данные показывают, что UCH-L1 имеет большой потенциал в качестве надежной и универсальной мишени как биомаркера для различных форм поражения ЦНС и сопряженной с ней проводящей системы [2].
Воспаление является общим патофизиологическим процессом, а также клинической угрозой, которая встречается у человека во всем мире при различных заболеваниях. Хорошо задокументировано, что ядерный фактор-κB (NF-kB) и митоген-активируемые пути протеинкиназы участвуют в воспалительных реакциях на микробные инфекции в липополисахаридных (LPS)-активированных макрофагах. Деубиквитиназа (убиквитинкарбоксиконцевая гидролаза-L1, UCHL1) проявляет себя как онкопротеин, способствующий росту и прогрессированию раковых клеток. Однако изучение роли регуляторного механизма UCHL1 в воспалении только начинается [3].
Известно, что убиквитин и UCH-L1 являются важными белками, которые регулируют воспалительные реакции и метаболизм нейрональных белков посредством контроля протеасомного пути их деградации. Установлено, что гидролаза UCH-L1 может подвергаться как различным посттрансляционным модификациям, так и генетическим мутациям, связанным с различными формами нейродегенерации. Потеря активности UCH-L1 проявляется при таких заболеваниях, как паркинсонизм и болезнь Альцгеймера. Посттрансляционные модификации O-гликозилирование и фарнезилирование способствуют превращению цитозольного UCH-L1 (C) в мембранно-ассоциированную форму UCH-L1 (M), которая взаимодействует с альфа-синуклеином и может вызывать развитие альфа-синуклеинопатии [4]. Это открывает новую терапевтическую стратегию, нацеленную на посттрансляционные модификации UCH-L1 при различных нейродегенеративных заболеваниях. Кроме этого, UCH-L1 может быть биомаркером воспаления нейронального происхождения повреждения мозга, геморрагического инсульта и травмы спинного мозга, гипоксически-ишемической энцефалопатии, эпилептического припадка и сердечной недостаточности. Однако клинические возможности UCH-L1 как нейробиомаркера воспаления нуждаются в дальнейшей валидации в формальных проспективных исследованиях.
Отсутствие в литературе данных о деубиквитиназе и неконъюгированном убиквитине в эутопическом и эктопическом эндометрии, в перитонеальной жидкости и в крови как об активаторах воспаления и боли при эндометриозе послужило основанием для настоящего исследования.
Цель исследования — изучить роль деубиквитиназы и неконъюгированного убиквитина в эутопическом и эктопическом эндометрии у больных с перитонеальной формой эндометриоза с использованием иммуногистохимического анализа, метода вестерн-блоттинга, количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени, иммуноферментного анализа в крови и перитонеальной жидкости и сопоставить эти данные с наличием хронической тазовой боли.
Материал и методы
Основная группа. В основную группу рекрутированы 60 женщин в возрасте 27—37 лет с перитонеальной формой эндометриоза I—III стадии согласно классификации Американского общества репродуктивной медицины (rASRM), подтвержденного во время проведения лапароскопии, как это описано нами ранее [5]. Клинико-лабораторное обследование больных позволило составить две группы: без признаков хронической тазовой боли (29 больных) и с признаками хронической тазовой боли (31 больная).
Контрольная группа — 25 пациенток, которым произведена стерилизация с использованием лапароскопического доступа. Эндометриоз у пациенток этой группы исключали после тщательного исследования висцеральной и париетальной брюшины на наличие гетеротопических эндометриоидных очагов, как это описано ранее [5].
Дизайн исследования. Проведено ретроспективное одномоментное исследование. Рекрутинг и рандомизацию больных осуществляли совместно с д.м.н., проф. А.С. Гаспаровым, д.м.н. Н.И. Волковым, д.м.н., проф. Т.Е. Самойловой, д.м.н., проф. Л.Н. Кузьмичевым, д.м.н. Е.Д. Дубинской, д.м.н. Е.А. Межевитиновой, д.м.н. А.В. Лединой, к.м.н. М.А. Шороховой, к.м.н. М.Ф. Дорфманом, к.м.н. Н.С. Щетининой, к.м.н. А.С. Онищенко, врачом Н.А. Ильясовой, врачом О.М. Векилян, врачом К.Р. Набиевой. Клиническая характеристика больных и дизайн исследования представлены нами ранее [6].
Характеристика образцов ткани, сыворотки крови и перитонеальной жидкости. Образцы эутопического и эктопического эндометрия, перитонеальной жидкости получены во время лапароскопии, как это описано нами ранее [5]. Верификацию гистологических диагнозов в эутопическом и эктопическом эндометрии осуществляли в Академической больнице г. Уппсала, Швеция (Akademiska sjukhuset, Uppsala). Все экспериментальные исследования проведены совместно с Department of Women’s and Children’s Health, Uppsala University, Uppsala, Sweden, на территории Rudbeck laboratory, Uppsala, Sweden и в тесном контакте с The Human Protein Atlas, Uppsala, Sweden.
Обозначение обследованных групп для исследования тканей: ЭУК/Б— — эутопический эндометрий, контрольная группа, без боли; ЭУЭ/Б— — эутопический эндометрий, эндометриоз, без боли; ЭУЭ/Б+ — эутопический эндометрий, эндометриоз, с болью; ЭКЭ/Б— — эктопический эндометрий, эндометриоз, без боли; ЭКЭ/Б+ — эктопический эндометрий, эндометриоз, с болью.
Обозначение обследованных групп для исследования крови и перитонеальной жидкости: К/Б— — контрольная, без боли, Э/Б— — эндометриоз, без боли, Э/Б+ — эндометриоз, с болью.
Иммуногистохимический анализ (Immunohistochemistry, IHC). Экспрессия деубиквитиназы и убиквитина в эутопическом и эктопическом эндометрии. Проведение иммуногистохимического анализа осуществлялось, как это описано нами ранее [7]. С целью визуализации применяли: для деубиквитиназы кроличьи поликлональные антитела (Polyclonal Rabbit, Anti-PGP 9.5, Kod nr. Z 5116, DacoCytomation) с системой EnVision G/2 System/AP, Permanent Red («Dako Denmark ApS», Дания, «Agilent Technologies Inc.», США), для убиквитина первичные моноклональные мышиные антитела (antiHuman Ubiquitin/Ubiquitin+1 Antibody, MAB701, R&D) с системой DAB («Dako Denmark ApS», Дания, «Agilent Technologies Inc.», США). Экспрессию деубиквитиназы выражали в ее плотности на mm2, а убиквитина — в ед. SCORE. В работе использовали микроскоп высокого разрешения Carl Zeiss microscopy, ZEISS Axio Observer z1 («Carl Zeiss», Германия) с программным обеспечением ZEN 3.0 (blue edition). Исследование проведено В.А. Бурлевым, Н.А. Ильясовой.
Вестерн-блоттинг анализ (Western blotting, WB) для деубиквитиназы и неконъюгированного убиквитина. Вестерн-блоттинг анализ проводили, как это описано нами ранее [5]. Использовали антитела: для деубиквитиназы кроличьи поликлональные (Polyclonal Rabbit, Anti-PGP 9.5, Kod nr. Z 5116, DacoCytomation) («Dako Denmark ApS», Дания), для убиквитина поликлональный кроличий IgG, А-100 («R&D, Boston Biochem Inc.», США), для actin β (C4) мышиные моноклональные антитела (sc-47778, «Santa Cruz Biotechnology, Inc.», США). Для контроля деубиквитиназы использовали UCH-L1 (h): 293T Lysate: sc-176636 («Santa Cruz Biotechnology, Inc.», США), для контроля убиквитина использовали лизат клеточной линии A549 эпителиальной аденокарциномы легких человека (Cell line: A549, human lung adenocarcinoma epithelial, lysate A549 whole cell lysate ab 7910, Ab Cam) или Ubiquitin (h) 293T lysate sc-111402, как лизат трансфицированного убиквитина человека из 293T клеток («Santa Cruz Biotechnology, Inc.», США). Исследование проведено В.А. Бурлевым, E. Davey.
Извлечение матричной РНК и проведение количественной полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени (Real-time polymerase chain reaction, RT-qPCR) для деубиквитиназы и убиквитина. Проведение количественной ПЦР в реальном времени осуществляли, как это описано нами ранее [5]. Использовались праймеры фирмы «Thermo Fisher Scientific» (США) для деубиквитиназы Hs00985157_m1, для убиквитина Hs00704312_s1; для человеческого β-актина, ACTB, 4326315E. Относительные изменения экспрессии генов анализированы с использованием метода 2-ΔΔT. Исследование проведено В.А. Бурлевым, E. Davey, Th. Kunovac Kallak.
Анализ сыворотки крови и перитонеальной жидкости методом иммуноферментного анализа (ИФА). Анализ содержания деубиквитиназы и убиквитина в сыворотке крови и перитонеальной жидкости проводился с помощью ИФА с применением стандартных наборов ELISA Kit: UCHL1 (Ubiquitin Carboxyl terminal Esterase L1, Ubiquitin Thiolesterase, SEG945Hu, «Wuhan USCN Business Co., Ltd.», Китай), Ubiquitin, Human, ELISA Kit E01U0007 («Shanghai Blue Gene Biotech CO., Ltd.», Китай). Проведение реакции и расчет результатов осуществляли в стандартных условиях согласно рекомендациям производителя. Исследование проведено В.А. Бурлевым, Н.А. Ильясовой.
Статистический анализ. Для анализа результатов использовали статистические компьютерные программы IBM SPSS Statistics 20. Результаты исследования представлены как среднее и стандартное отклонение (M±SD). В зависимости от конкретных условий применялись: ANOVA, критерий Вилкоксона, U-критерий Манна—Уитни. Различия между группами считались статистически значимыми при p<0,05.
Результаты
Описание больных основной группы. Анализ анамнестических и клинических данных показал у больных наличие характерных признаков эндометриоза: бесплодие, хронические тазовые боли, метроррагии, диспареуния. При лапароскопии на брюшине выявлены гетеротопии различной локализации. Хроническая тазовая боль наблюдалась статистически значимо у больных с болью (5,2 балла по отношению к больным без боли 0,0 баллов по визуальной аналоговой шкале ВАШ). Клиническая характеристика больных соответствовала ранее представленным данным [6].
Раздел 1. Описание плотности деубиквитиназы и экспрессии убиквитина (HSCORE) в эпителии желез у женщин контрольной группы и у больных эндометриозом в эутопическом и эктопическом эндометрии по данным иммуногистохимического анализа. В табл. 1 представлены данные об экспрессии деубиквитиназы в ткани эндометрия и неконъюгированного убиквитина в эпителии желез у женщин контрольной группы и у больных эндометриозом в эутопическом и эктопическом эндометрии по данным иммуногистохимического анализа.
Таблица 1. Экспрессия деубиквитиназы и неконъюгированного убиквитина в эпителии желез у женщин контрольной группы и у больных эндометриозом в эутопическом и эктопическом эндометрии по данным иммуногистохимического анализа
| Группы | Иммуногистохимический анализ (IHC) | ||
| UCHL1, плотность на mm2 | Ubq, SCORE, эпителий желез | ||
| ЭУК/Б– | 1 | 1,2±1,1 | 0,45±0,2 |
| ЭУЭ/Б– | 2 | 6,3±3,7 | 0,74±0,2 |
| ЭУЭ/Б+ | 3 | 11,2±4,9 | 1,63±0,4 |
| ЭКЭ/Б– | 4 | 7,8±3,9 | 0,51±0,3 |
| ЭКЭ/Б+ | 5 | 15,7±3,5 | 1,13±0,4 |
| p<0,05 | 1—2,3,4,5; 2—3; 4—5 | 1—2,3,5; 2—3; 4—5 | |
Примечание. Данные представлены в виде среднего значения и стандартного отклонения, M±SD. Различия определяли с помощью критерия Манна—Уитни. UCHL1 — белок деубиквитиназы, Ubq — белок убиквитина; ЭУК/Б– — эутопический эндометрий, контрольная группа, без боли; ЭУЭ/Б– — эутопический эндометрий, эндометриоз, без боли; ЭУЭ/Б+ — эутопический эндометрий, эндометриоз, с болью; ЭКЭ/Б– — эктопический эндометрий, эндометриоз, без боли; ЭКЭ/Б+ — эктопический эндометрий, эндометриоз, с болью; IHC — иммуногистохимический анализ; плотность на mm2 — плотность деубиквитиназы; SCORE — экспрессия Ubq по шкале для иммуногистохимического анализа.
Установлено, что плотность на mm2 деубиквитиназы в ткани эндометрия наиболее низкая у женщин контрольной группы, а наиболее высокая в эктопическом эндометрии у больных эндометриозом с наличием боли. Это превышение составляет 13 раз. В эутопическом эндометрии наибольшие значения получены у женщин с наличием боли, и превышение составило 9,3 раза. Имеются статистически значимые различия между характеристикой эндометрия женщин контрольной группы и характеристикой эутопического эндометрия без боли. В эктопическом эндометрии деубиквитиназа наиболее активна у больных с болью.
Учитывая, что поверхностного эпителия в эктопическом эндометрии нет, полученные данные представлены только для эпителия желез. Тем не менее в поверхностном эпителии эутопического эндометрия наблюдаются такие же изменения, как и в эпителии желез. Экспрессия убиквитина в эпителии желез была наиболее активна (статистически значимо) в эутопическом и эктопическом эндометрии у больных с болью. Отмечались статистически значимые различия между характеристикой эутопического эндометрия женщин контрольной группы и группы больных с болью.
Аналогичные изменения отмечены и в эктопическом эндометрии.
Следовательно, по данным иммуногистохимического метода, наблюдается увеличение плотности деубиквитиназы и экспрессии убиквитина в эутопическом и эктопическом эндометрии у больных с эндометриозом и болевым синдромом.
Раздел 2. Описание экспрессии деубиквитиназы и неконъюгированного белка убиквитина по данным вестерн-блоттинга у женщин контрольной группы и у больных эндометриозом в эутопическом и эктопическом эндометрии. В табл. 2 приведены данные об экспрессии белка деубиквитиназы и неконъюгированного убиквитина в эутопическом и эктопическом эндометрии. Как следует из приведенных данных, наименьшая экспрессия деубиквитиназы отмечается у женщин контрольной группы, а наибольшая — в эктопическом эндометрии у больных с болью. В эутопическом эндометрии наибольшая активность установлена у женщин группы с болью. Аналогичные данные получены и в эктопическом эндометрии. Следовательно, по данным вестерн-блоттинг анализа, экспрессия белка деубиквитиназы установлена в эутопическом и эктопическом эндометрии у больных с болью.
Таблица 2. Экспрессия деубиквитиназы и неконъюгированного белка убиквитина по данным вестерн-блоттинга у женщин контрольной группы и у больных эндометриозом в эутопическом и эктопическом эндометрии
| Группы | Вестерн-блоттинг (WB) | ||
| UCHL1/beta-actin | Ubq/beta-actin | ||
| ЭУК/Б– | 1 | 0,43±0,06 | 0,24±0,12 |
| ЭУЭ/Б– | 2 | 0,57±0,09 | 0,16±0,09 |
| ЭУЭ/Б+ | 3 | 0,81±0,17 | 0,51±0,07 |
| ЭКЭ/Б– | 4 | 0,56±0,17 | 0,62±0,35 |
| ЭКЭ/Б+ | 5 | 1,14±0,24 | 2,34±0,44 |
| p<0,05 | 1—2,3,4,5; 2—3; 4—5 | 1—3,4,5; 2—3; 4—5 | |
Примечание. Данные представлены в виде среднего значения и стандартного отклонения, M±SD. Различия определяли с помощью критерия Манна—Уитни. UCHL1 — деубиквитиназа; Ubq —убиквитин с молекулярной массой 8,5 kDa; beta-actin — белок бета-актин; ЭУК/Б– — эутопический эндометрий, контрольная группа, без боли; ЭУЭ/Б– — эутопический эндометрий, эндометриоз, без боли; ЭУЭ/Б+ — эутопический эндометрий, эндометриоз, с болью; ЭКЭ/Б– — эктопический эндометрий, эндометриоз, без боли; ЭКЭ/Б+ — эктопический эндометрий, эндометриоз, с болью; вестерн-блоттинг (WB) — экспрессия белков.
Исследование содержания белка неконъюгированного убиквитина в эутопическом и эктопическом эндометрии показало, что наибольшие статистически значимые показатели получены в эктопическом эндометрии у больных с болью. Однако отсутствовали различия в изменениях содержания неконъюгированного убиквитина в эндометрии у женщин контрольной группы и в эутопическом эндометрии больных без боли, но были статистически значимыми у больных с болью. В эктопическом эндометрии увеличение содержания неконъюгированного убиквитина наблюдалось в группе больных с болью (статистически значимо). Эти данные вестерн-блоттинг анализа убедительно доказывают увеличение содержания белка деубиквитиназы и неконъюгированного убиквитина в эутопическом и эктопическом эндометрии у больных с эндометриозом и болевым синдромом.
Раздел 3. Описание экспрессии генов деубиквитиназы и убиквитина по данным количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени у женщин контрольной группы и у больных эндометриозом в эутопическом и эктопическом эндометрии. Оценка экспрессии гена деубиквитиназы показала, что наиболее высокие и статистически значимые уровни экспрессии наблюдались в эктопическом эндометрии у больных с болью (табл. 3). Кроме этого, имел место градиент нарастания экспрессии гена деубиквитиназы в эутопическом и эктопическом эндометрии от минимальных значений в эндометрии женщин контрольной группы до максимальных в эктопическом эндометрии с болью. Этот градиент распределяется от 0,012±0,0056 в контрольной группе до 0,143±0,0299 в группе эктопического эндометрия с болью (увеличение в 1,8 раза). В то же время градиент нарастания экспрессии гена убиквитина увеличился в 32,8 раза от показателей у женщин контрольной группы до показателей у женщин группы эктопического эндометрия с наличием боли. Следовательно, только увеличение активности гена деубиквитиназы в 1,8 раза приводит к увеличению активности гена убиквитина в 32,8 раза при наличии боли, что является прямым доказательством взаимосвязи между деубиквитиназой и убиквитином на молекулярно-генетическом уровне.
Таблица 3. Экспрессия генов деубиквитиназы и убиквитина по данным количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени у женщин контрольной группы и у больных эндометриозом в эутопическом и эктопическом эндометрии
| Группы | Полимеразная цепная реакция в реальном времени (RT-qPCR) | ||
| UCHL1/beta-actin | Ubq/beta-actin | ||
| ЭУК/Б– | 1 | 0,012±0,0056 | 0,0063±0,0068 |
| ЭУЭ/Б– | 2 | 0,021±0,0062 | 0,0094±0,0054 |
| ЭУЭ/Б+ | 3 | 0,101±0,0369 | 0,0709±0,0309 |
| ЭКЭ/Б– | 4 | 0,079±0,0317 | 0,1221±0,0051 |
| ЭКЭ/Б+ | 5 | 0,143±0,0299 | 0,2072±0,0462 |
| p<0,05 | 1—2, 3, 4, 5; 2—3; 4—5 | 1—2, 3, 4, 5; 2—3; 4—5 | |
Примечание. Данные представлены в виде среднего значения и стандартного отклонения, M±SD. Различия определяли с помощью критерия Манна—Уитни. UCHL1 — ген деубиквитиназы, Ubq — ген убиквитина с молекулярной массой 8,5 kDa, beta-actin — ген бета-актина; ЭУК/Б— — эутопический эндометрий, контрольная группа, без боли; ЭУЭ/Б— — эутопический эндометрий, эндометриоз, без боли; ЭУЭ/Б+ — эутопический эндометрий, эндометриоз, с болью; ЭКЭ/Б— — эктопический эндометрий, эндометриоз, без боли; ЭКЭ/Б+ — эктопический эндометрий, эндометриоз, с болью; RT-qPCR (mRNA expression) — экспрессия мРНК по данным количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени.
Представленные данные доказывают, что минимальное увеличение активности гена деубиквитиназы приводит к многократному усилению гена убиквитина. Следствием этих изменений является высвобождение неконъюгированного убиквитина в эутопическом и эктопическом эндометрии у больных с эндометриозом и наличием боли. Эти результаты получены по данным количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени.
Раздел 4. Описание содержания деубиквитиназы и убиквитина у женщин контрольной группы и у больных эндометриозом в крови и в перитонеальной жидкости по данным иммуноферментного анализа. В табл. 4 представлены данные о содержании деубиквитиназы и убиквитина у женщин контрольной группы и у больных эндометриозом в крови и в перитонеальной жидкости по данным иммуноферментного анализа. Это сравнительное изучение показало, что у женщин с эндометриозом и болью содержание деубиквитиназы в крови и в перитонеальной жидкости статистически значимо повышено по отношению к показателям у женщин контрольной группы в 8,5 раза в крови и в 22,8 раза в перитонеальной жидкости. Содержание убиквитина также повышено у больных с болью в крови в 3,8 раза, а в перитонеальной жидкости — в 6,8 раза. Следовательно, наблюдается преимущественное повышенное накопление деубиквитиназы и убиквитина в перитонеальной жидкости по данным иммуноферментного анализа у больных с эндометриозом и болевым синдромом.
Таблица 4. Содержание деубиквитиназы и убиквитина у женщин контрольной группы и у больных эндометриозом в крови и в перитонеальной жидкости по данным иммуноферментного анализа
| Группы | ELISA (нг/мл) | p<0,05 | ||||
| Кровь | ПЖ | |||||
| UCHL1, ng/ml | Ubq, ng/ml | UCHL1, ng/ml | Ubq, ng/ml | |||
| 1 | 2 | 3 | 4 | |||
| К/Б– | 1 | 0,69±0,2 | 21,2±17,5 | 0,21±0,1 | 13,6±7,4 | 1—3; 2—4 |
| Э/Б– | 2 | 1,5±0,6 | 28,9±12,5 | 1,2±0,8 | 25,7±9,4 | 1—3>0,05 2—4>0,05 |
| Э/Б+ | 3 | 5,9±1,2 | 81,1±19,8 | 4,8±1,1 | 93,8±12,3 | 1—3>0,05 2—4>0,05 |
| p<0,05 | 1—2, 3; 2—3 | 1—3; 2—3 | 1—2, 3; 2—3 | 1—2, 3; 2—3 | — | |
Примечание. Данные представлены в виде среднего значения и стандартного отклонения, M±SD. Различия определяли с помощью критерия Манна—Уитни. UCHL1 — белок деубиквитиназы, Ubq — белок убиквитина; К/Б– — контрольная группа, без боли, Э/Б– — эндометриоз, без боли, Э/Б+ — эндометриоз, с болью; кровь — сыворотка крови, ПЖ — перитонеальная жидкость, ELISA — иммуноферментный анализ (ИФА).
Раздел 5. Описание роли деубиквитиназы (UCH-L1) в накоплении неконъюгированного убиквитина в эутопическом и эктопическом эндометрии, в перитонеальной жидкости и в крови у больных с эндометриозом и тазовой болью.
В результате реализации всех проведенных исследований и на основании принципа траспарантности (прозрачности) удалось осуществить наложение всех полученных данных друг на друга для получения объемных выводов, так как каждый из видов анализа отражал только отдельный компонент, а не всю систему. Как следует из блок-схемы (см. рисунок), повреждение клеток эндометрия при эндометриозе связано с воздействием оксидативного стресса, нитрозативного стресса, воспаления микроокружения, нейрогенного воспаления, эстрогенного воспаления, redox signaling, инверсии ядерных рецепторов к эстрогенам и, как следствие, развивается воспаление микроокружения [5]. Суммирование результатов исследований, представленных в разделах 1—4, показало, что повышенная экспрессия деубиквитиназы в эндометрии при эндометриозе наблюдается в микрососудах и нервных волокнах, а экспрессия неконъюгированного убиквитина — в поверхностном эпителии и в эпителии желез. Причиной повышенной экспрессии деубиквитиназы может служить ее мутация или изменение активности в результате суммирования различных указанных механизмов хронического стресса. Различная локализация деубиквитиназы и неконъюгированного убиквитина указывает на наличие паракринных взаимодействий между различными структурами эндометрия и их взаимной синхронизации. Так, изменения в поверхностном или железистом эпителии влияют на состояние нервных волокон и микрососудов, а повреждение нервных волокон и микрососудов приводит к нарушению убиквитирования в эпителии. Несомненно, что накопление неконъюгированного убиквитина при эндометриозе и тазовой боли свидетельствует об изменениях убиквитин-протеосомальной системы, которая влияет на множество сигнальных путей регуляции и в конечном итоге также способствует проявлению воспаления микроокружения. Накопление неправильно сложенных или поврежденных белков за счет дефицита alphaB-crystallin, как нами показано в предыдущем исследовании [6], также способствуют накоплению внутриклеточных диффузных и нетоксичных агрегатов различных белков. Несомненно, что таргетной точкой этих изменений является нарушение профиля деградации белков в эндометрии, которое искажает процессы транскрипции и трансляции генов, приводя к нейродегенерации. Общей чертой дисфункции эутопического и эктопического эндометрия у больных с эндометриозом и болью является увеличение активности деубиквитиназы, накопление неконъюгированного убиквитина и, как следствие, проявление хронической тазовой боли в ответ на воспаление микроокружения.
Роль деубиквитиназы в накоплении неконъюгированного убиквитина в эутопическом и эктопическом эндометрии, в перитонеальной жидкости и в крови у больных с эндометриозом и тазовой болью (блок-схема).
Обсуждение
Наличие в матке «воспалительно подобной» среды при эндометриозе не вызывает сомнения, следовательно, коммуникация от клетки к клетке может происходить посредством ряда механизмов, включающих прямое клеточное взаимодействие, контактные или паракринные сигналы. Кроме того, внеклеточный матрикс — не просто поддерживающая структура, а скорее динамический компонент различных тканей или своеобразная коммуникационная сеть. Изменения состава матрикса могут играть роль в передаче сигналов между клетками [8].
Важным аспектом при эндометриозе считается дисрегуляция цитокинов, приводящая к воспалению, но могут ли они быть одним из триггеров в развитии эндометриоза, или дисрегуляция возникает после того, как эндометриоз развился через другие механизмы? Эти аберрантные реакции еще более усугубляются уникальной гормональной средой. Однако очевидно, что для запуска аберрантных реакций задействованы дополнительные и еще не изученные механизмы. Основываясь на данных, указывающих на аберрантную модуляцию факторов, которые способствуют имплантации эктопического эндометрия и его выживаемости, не ясно, следует ли рассматривать эндометриоз только как воспалительное заболевание, или же воспаление и аутоиммунные изменения лишь сопровождают эндометриоз [9].
Воспаление представляет собой ряд патофизиологических реакций в ответ на вредные раздражители, такие как физические, микробиологические и химические факторы. Реакция воспаления играет жизненно важную роль при различных видах рака и хронических заболеваниях человека [10]. Макрофаги считаются основными иммунными клетками, которые могут непосредственно противодействовать внешним раздражителям. Активированные макрофаги взаимодействуют с патогенными микроорганизмами и способствуют воспалительным реакциям через несколько провоспалительных медиаторов, в том числе интерлейкин-1β (ИЛ-1β), ИЛ-6, фактор некроза опухоли α [11] и вазоактивный интестинальный пептид (VIP) [5].
Связанные с воспалением медиаторы и цитокины привлекают дополнительные иммунные клетки для защиты организма. Однако избыток этих медиаторов и цитокинов, активированных макрофагами, также способствует воспалительным заболеваниям, включая эндометриоз и многие аутоиммунные заболевания [12, 13]. Механизмы воспаления достаточно сложны. Хорошо известно, что после стимуляции макрофагов липополисахаридом (ЛПС) повышается уровень воспалительных цитокинов и медиаторов с последующей активацией фактора транскрипции ядерного фактора-κB (NF-κB) и митогенактивируемого сигнального пути протеинкиназы (MAPK). Тем самым NF-kB играет важную роль в патогенезе множественных воспалительных заболеваний и контролирует экспрессию множественных провоспалительных генов [14]. Кроме того, MAPK, включая внеклеточную сигнально-регулируемую протеинкиназу (ERK), JNK и p38 MAPK, активируются ЛПС и митогенами, играя важную роль в воспалительных реакциях [15].
Убиквитин-протеасомная система контролирует большую часть убиквитинирования и деградации белков в эукариотических клетках. В целом преобладает процесс убиквитинирования, индуцируемый лигазой Е3 и деградацией субстрата через протеасому 26S, тогда как процесс деубиквитинирования, опосредованный деубиквитиназой (DUBs), отрицательно влияет на процесс убиквитинирования. UCHL1, известная как белок — продукт гена 9.5 (PGP9.5), является одним из наиболее важных членов семейства DUB [16]. У человека установлены, по крайней мере, три родственных фермента в классе UCH (UCH-L3, UCH-L5 и BRC Aassociated белок-1 — BAP1), но только UCHL1 тесно связан с головным мозгом [2].
Ареал распространения UCHL1 представлен в основном в нервной системе, и есть небольшая экспрессия в других тканях [17]. Мутация гена UCHL1 вызывает двигательную дисфункцию, активно экспрессируется в нескольких опухолях, участвует в пролиферации рака и метастазировании [18], выявляется в эндометрии при эндометриозе [19].
Окислительные стрессы в клетках могут приводить к окислительной модификации белков или нитрованию. Полноразмерная UCHL1 является основной мишенью окислительного повреждения в головном мозге при болезни Альцгеймера и болезни Паркинсона [20].
Предыдущие исследования показали связь UCHL1 с воспалением. Так, обнаружено, что UCHL1 может отражать метаболический ответ на острое воспаление при аппендиците [21], а ингибитор UCHL1 снижает воспалительную клеточную инфильтрацию в сердце мыши [22]. Более того, экспрессия UCHL1 была значительно выше при воспалительных заболеваниях почек [23]. Очевидно, эти данные показывают, что UCHL1 участвует в воспалительных реакциях, однако механизм этого участия в настоящее время не ясен.
Установлено, что применение соединения изатин-О-ацилоксима — LDN57444 ингибирует DUB-активность UCHL1 и действует избирательно на UCHL1 по сравнению с другими членами, принадлежащими к семейству UCH. Так, ингибирующее действие LDN57444 на UCHL1 в 28 раз более выражено и селективно по сравнению с действием на UCHL3. Ингибирование или нокдаун UCHL1 с применением LDN57444 регулирует передачу сигналов к NF-κB и MAPK, что приводит к подавлению воспаления, вызванного ЛПС. Противовоспалительные эффекты на основе ингибиторов UCHL1 также доказаны in vivo. Эти данные подтверждают роль UCHL1 в воспалении и обеспечивают принципиально новое понимание регуляции этого процесса [3].
Координация с воспалением биоактивных молекул была предметом исследования, направленного на определение новых мишеней для блокирования этого процесса. VIP является проангиогенным фактором и системным иммунным регулятором. Его повышенная экспрессия установлена в эутопическом и эктопическом эндометрии с одновременным увеличением концентрации в сыворотке крови и в перитонеальной жидкости у больных с эндометриозом и симптомами хронической тазовой боли по сравнению с показателями у пациенток контрольной группы. Это открытие демонстрирует связь между проангиогенной ролью VIP, увеличением микрососудов и нервных волокон при проявлении хронической тазовой боли и устанавливает природу воспаления микроокружения при эндометриозе [5].
На фоне воспаления микроокружения установлено нарушение фолдинга белков за счет снижения содержания шаперона alphaB-crystallin и активации агрегации белков по второму типу в эутопическом и эктопическом эндометрии при эндометриозе на фоне тазовой боли. Дефицит alphaB-crystallin приводит к аморфной агрегации пептидов и, как следствие, к активации процессов, приводящих к нарушению рецептивности эндометрия и/или активации воспаления микроокружения и проявлениям болевого синдрома [6]. Эти белки представляет собой неупорядоченную ассоциацию мономерных пептидов с отсутствием четко определенной структуры. Аморфные агрегаты белков не считаются цитотоксическими в отличие от фибриллярной агрегации, что подчеркивает важность протеостатической сети для поддержания нативной и функциональной активности [24].
В проведенном нами исследовании показано увеличение активности гена деубиквитиназы по данным rt-qPCR с последующим усилением экспрессии белка деубиквитиназы по данным WB и локализацией его в микрососудах и нервных волокнах по данным IHC, что приводит к увеличению неконъюгированного убиквитина в ткани эутопического и эктопического эндометрия. Одновременно с изменениями в изученных тканях наблюдается накопление деубиквитиназы в перитонеальной жидкости и в крови по данным иммуноферментного анализа. Следовательно, увеличение содержания неконъюгированного убиквитина в ткани эутопического и эктопического эндометрия при эндометриозе связано с активацией деубиквитиназы и, как следствие, с изменением сигнального пути регуляции протеасомального пути деградации белков. Однако возникает вопрос о роли избытка конъюгированного убиквитина в индукции воспаления и боли, или может ли избыток неконъюгированного убиквитина служит компонентом конъюгированного убиквитина, который и индуцирует воспаление и боль?
Таким образом, установлено повышение экспрессии UCHL1 в микрососудах и нервных волокнах по данным IHC, WB, rt-qPCR в эутопическом и эктопическом эндометрии у больных с перитонеальной формой эндометриоза и хронической тазовой болью. Этот процесс сочетается с повышением экспрессии Ubq (Ubiquitin) в эпителии желез по данным IHC, неконъюгированного Ubq по данным WB и экспрессии гена Ubq по данным rt-qPCR.
Выводы
Экспрессия деубиквитиназы в микрососудах и нервных волокнах сочетается с экспрессией убиквитина в эпителии желез, что свидетельствует о нарушении регуляции убиквитинизации белков в эндометрии за счет инвазии микрососудов и нервных волокон. При эндометриозе в эутопическом и эктопическом эндометрии наблюдаются высокие уровни экспрессии деубиквитиназы, приводящие к накоплению неконъюгированного убиквитина в железах, что нарушают процесс протеосомальной дезинтеграции белков и оказывает воздействие на функциональную активность эндометрия, а именно на процессы индукции боли. Полученные результаты могут быть использованы для оценки состояния эндометрия и диагностики индукции боли при эндометриозе, выбора тактики лечения.
Работа выполнена в рамках государственного задания Министерства здравоохранения Российской Федерации «Разработка дифференцированного подхода к ведению пациенток репродуктивного возраста с различными формами эндометриоза», № госрегистрации 122020900125-8.
Соответствие принципам этики. Исследование выполнено в соответствии с Федеральным Законом Российской Федерации от 27.07.06 №152-ФЗ (с изменениями на 29.07.17) «О персональных данных»; с Федеральным Законом Российской Федерации от 21.11.11 №323-ФЗ «Об основах охраны здоровья граждан в Российской Федерации» (статья 13 «Соблюдение врачебной тайны»), а также с положениями Хельсинкской декларации с учетом пересмотров.
Благодарности. Выражаем благодарность honorary professor M. Olovsson, PhD Th. Kunovac Kallak, E. Davey, Department of Women’s and Children’s Health, Uppsala University, Uppsala, Sweden за участие, обсуждение и поддержку. Работа выполнена по теме: «Изучение ассоциации между протеасомными и инфламасомными маркерами эндометрия в эутопическом и эктопическом эндометрии у женщин с эндометриозом», учетный номер в НТИМИ 0158/06/19 от 19.03.19. Финансовая, научная, правовая и политическая поддержка осуществлялась Шведской Королевской Академией наук, Шведским медицинским Исследовательским Советом (грант №8683), Фондом планирования семьи в Уппсале, Университетом Уппсалы, Швеция, Rudbeck laboratory i Uppsala, The Human Protein Atlas i Uppsala, Akademiska sjukhuset i Uppsala, ФГБУ «НМИЦ АГП им. В.И. Кулакова» Минздрава России и Минздравом России.
Участие авторов:
Концепция и дизайн исследования — Бурлев В.А.
Сбор и обработка материала — Бурлев В.А., Ильясова Н.А.
Статистический анализ данных — Бурлев В.А.
Написание текста — Бурлев В.А.
Редактирование — Бурлев В.А.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.