Введение

Дисплазия соединительной ткани (ДСТ) — группа генетически детерминированных заболеваний, обусловленных дефектами волокнистых структур и основного вещества соединительной ткани и приводящих к нарушению формообразования органов и систем [1]. У больных с ДСТ повышен риск развития внезапной смерти, обусловленной, прежде всего, патологическими изменениями сердечно-сосудистой системы (разрыв аорты, разрыв аневризмы сосудов головного мозга, острая сердечная недостаточность вследствие нарушений ритма сердца и других причин и т.д.) [2]. Учитывая широкую распространенность ДСТ среди популяции (1 случай на 5—47 человек) и частое поражение при этом сердечно-сосудистой системы, раннее выявление этой патологии является актуальной и социально значимой задачей в плане профилактики внезапной смерти лиц с признаками ДСТ [1].

В зависимости от этиологического фактора, ДСТ подразделяют на дифференцированные, в которые входят наследственные нарушения соединительной ткани (ННСТ) (моногенные ДСТ), такие как синдром Марфана (СМ), синдром Элерса-Данлоса, несовершенный остеогенез и др., недифференцированные (полигенные) ДСТ. На сегодняшний момент описано более 30 генов, связанных с ННСТ [3]. В случаях недифференцированных ДСТ заболевание носит полигенно-мультифакторный характер (заболевание с наследственной предрасположенностью), когда имеют место мутации большого количества генов, а случайная перекомбинация аллелей от отца и матери каждый раз приводит к формированию нового уникального генотипа. Нутрициальные факторы, прежде всего дефицит витаминов, макро- и микроэлементов, являются одной из основных причин, способствующих развитию ДСТ [1].

Дифференциальная диагностика между ННСТ и полигенными ДСТ затруднена даже для специалистов, что обусловлено их выраженным клиническим полиморфизмом. Под маской недифференцированных ДСТ сегодня скрывается значительное количество генетически неоднородных моногенных ННСТ, вызванных «мягкими» мутациями и протекающих со стертой клинической картиной, либо еще не диагностированные формы [1, 4]. Применение молекулярно-генетической диагностики способствует решению этой проблемы. Для улучшения эффективности скрининга целых семей и разработки программ профилактики и лечения, в которых крайне нуждаются такие пациенты, необходимо выявлять конкретный генетический дефект, вызывающий развитие заболевания [1, 4].

В настоящей работе представлен клинический случай 41-летнего пациента с симптомами ДСТ, обратившегося в НМИЦ ПМ для обследования, в результате которого при проведении экзомного секвенирования был выявлен новый патогенный вариант гена FBN1 с последующим семейным скринингом и медико-генетическим консультированием.

Описание клинического случая

Пробанд, мужчина 41 года, обратился к кардиологу в НМИЦ ПМ с жалобами на перебои в работе сердца. После кардиологического обследования пациент был направлен на консультацию к врачу-генетику.

Анамнез болезни: с детства обращал на себя внимание высокий рост (школьная форма для 1 класса была куплена на рост пятиклассника), с 17 лет прогрессировала миопия. С 19 лет пациента стали беспокоить отечность голеней и стоп, боли в голенях, развивающиеся в вечерние часы. В 30 лет была проведена двусторонняя флебэктомия вен нижних конечностей.

Семейный анамнез: данных за ранее диагностированные наследственные заболевания не было; по данным предоставленной медицинской документации, у сына 3 лет — воронкообразная деформация грудной клетки, плосковальгусные стопы.

Данные осмотра: астеническое телосложение; рост — 198 см, масса тела — 83 кг, ИМТ — 21,2 кг/м²; арахнодактилия кистей (положительные тесты большого пальца и тест запястья) (рис. 1), сандалевидные стопы, сколиоз грудного отдела позвоночника, килевидная асимметрия грудной клетки, гиперэластичность кожи и гиперподвижность суставов, готическое небо, скученность зубов, множественные «папиросные» рубцы и стрии на коже; дыхание в легких везикулярное, частота дыхания (ЧД) — 18/мин; тоны сердца ясные, аритмичные, шумов нет, частота сердечных сокращений (ЧСС) — 82 уд/мин; АД — 120 и 80 мм рт.ст.; живот мягкий, безболезненный; печень не увеличена; селезенка не пальпируется; стул оформленный, со склонностью к запорам; моча светлая, мочеиспускание безболезненное; щитовидная железа без особенностей; пульсация на артериях нижних конечностей сохранена; пациент ориентирован в пространстве и времени, контактен, очаговой симптоматики нет, миопия (2,5 диоптрии).

Результаты обследования

При ЭКГ были зарегистрированы синусовая брадикардия (ЧСС — 54 уд/мин), нормальное положение электрической оси сердца, предсердные экстрасистолы, предсердные экстрасистолы. Холтеровское мониторирование ЭКГ: средняя ЧСС — 62 уд/мин, 1804 наджелудочковых экстрасистол. Рентгенография органов грудной клетки: очаговых или инфильтративных теней в легких не выявлено. ЭхоКГ: аневризма корня аорты (диаметр на уровне синусов Вальсальвы — 57 мм, диаметр на уровне сино-тубулярного гребня — 48 мм), истончение стенок корня аорты, аортальная недостаточность 0—1-й степени, гемодинамически незначимый пролапс (на 5 мм) митрального клапана, митральная недостаточность 1-й степени, гемодинамически незначимый пролапс створок трикуспидального клапана, трикуспидальная недостаточность 1-й степени. МСКТ аорты: максимальный размер аорты на уровне синусов Вальсальвы — 55,8×58 мм, диаметр синусов Вальсальвы — 40,8 мм, в области перехода корня аорты в восходящий отдел — 45×45 мм, восходящий отдел диаметром 32—34 мм. Коронарография: поражений коронарного русла не выявлено. Дуплексное сканирование брахиоцефальных ветвей дуги аорты: патологические извитости (без значимого нарушения гемодинамики) обеих внутренних сонных артерий, обеих позвоночных артерий. Дуплексное сканирование артерий нижних конечностей: артерии обеих нижних конечностей проходимы, кровоток магистрального типа. Дуплексное сканирование вен нижних конечностей: вены обеих нижних конечностей проходимы, варикозная болезнь в бассейне большой подкожной вены с обеих сторон.

Общий анализ крови, биохимические анализ крови, коагулограмма, общий анализ мочи — без особенностей.

Диагноз на основании клинических данных

На основании данных анамнеза, осмотра и обследования, у пациента было диагностировано ННСТ. Учитывая сочетание у пациента расширения аорты и признаков системного вовлечения соединительной ткани (более 7 баллов), согласно Гентским критериям [1], наиболее вероятным представлялся диагноз СМ. Дифференциальный диагноз следовало проводить с синдромом Элерса-Данло. Пациент был направлен в РНЦХ, где ему была выполнена операция Дэвида (протез Вальсальвы Vascutek Gelweave 32 мм) с применением мини-J-стернотомии. Послеоперационный период проходил без осложнений.

Каскадный скрининг

Семейный анамнез был собран со слов пробанда и его родителей на приеме у врача-генетика (рис. 2). Признаки СМ были выявлены у пробанда (III,3) и его сына (IV,2). У родителей пробанда (II,4 и II,5) при осмотре врачом-генетиком больших и малых признаков синдрома отмечено не было. Генетический анализ был проведен всем членам семьи пробанда, включая сына и его родителей.

Молекулярно-генетический анализ

Выделение ДНК проводили с помощью набора QIAampDNA Blood Mini Kit (Qiagen, Германия). Концентрацию ДНК определяли на флюориметре Qubit 4 (Thermo Fisher Scientific, США). Геномные библиотеки были приготовлены с помощью набора TruSeq DNA Exome (Illumina, США). Соникация ДНК была осуществлена на приборе Covaris S220 (Covaris, США). Далее было выполнено экзомное обогащение с использованием набора xGen hybridization capture of DNA libraries (IDT, США). Контроль качества был проведен с помощью Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent, США) и Qubit 4 (Thermo Fisher Scientific, США). Секвенирование выполнялось на секвенаторе нового поколения NextSeq550 (Illumina, США) с длиной прочтения 2×75 п.о. Все этапы эксперимента проводились согласно протоколам производителей.

Биоинформатический анализ

Парные чтения, полученные после секвенирования, были предоставлены для анализа в формате bcl, который был переведен в формат fastq. Оценка качества чтений была проведена с помощью программы FastQC, после чего были удалены с конца каждого чтения нуклеотиды, вероятность ошибки в которых была более 1 на 100, при помощи программы Trimmomatic. Прошедшие процедуру фильтрации пары чтений были картированы на геном человека версии hg19, в качестве картировщика была выбрана программа BWA-MEM. Удаление дублированных чтений осуществлено с помощью программы SAMtools. В результате для каждого пациента был получен BAM-файл, содержащий информацию об уникальных чтениях, картированных на референсный геном. Неточности выравнивания в областях вставок и делеций были устранены при помощи программы GATK, также с помощью GATK проводили поиск SNP в рамках целевых участков генома. В результате для каждого пациента были получены файлы, содержащие список вариантов нуклеотидной последовательности, их координаты, данные о покрытии и прочие характеристики. Найденные варианты нуклеотидной последовательности были проаннотированы с помощью программы ANNOVAR.

Определение патогенности и приоритезация вариантов нуклеотидной последовательности

В финальный анализ включались варианты, находящиеся в 32 генах, связанных с развитием наследственных синдромов ДСТ: ACTA2, ADAMTS10, COL1A1, COL2A1, COL3A1, COL4A5, COL5A1, COL5A2, DCHS1, EFEMP2, ELN, FBN1, FBN2, FLNA, GATA5, LOX, LTBP2, MAT2A, MFAP5, MYH11, MYLK, NOTCH1, PLOD1, PRKG1, SKI, SLC2A10, SMAD3, SMAD4, TGFB2, TGFB3, TGFBR1, TGFBR2 [2]. Все варианты проходили проверку на соответствие критериям патогенности согласно рекомендациям ACMG 2015 г. Отфильтрованные варианты перед включением в результаты генетического исследования были проанализированы врачом-генетиком и исследованы на предмет упоминания в новейших публикациях.

По данным генетического анализа был найден один новый, ранее не описанный патогенный вариант в гене FBN1(hg19::chr15:48757772_48757775del). Делеция 4 п.о. NM_000138:exon40:c.4932_4935delCACT приводит к сдвигу рамки считывания p.R1644fs.

В других исследуемых генах патогенных и вероятно-патогенных вариантов выявлено не было.

Номенклатура и классификация выявленного генетического варианта

Для описания выявленной мутации: (FBN1:NM_000138:exon40:c.4932_4935del:p.R1644fs.) использовались номенклатурные рекомендации Общества вариаций генома человека (HGVS) [5]. Выявленный вариант не был описан ни в одной из следующих баз данных (по состоянию на 30.09.19), описания мутации проверялись в следующих базах: MutationTaster, SIFT + Provean, OMIM.

Подтверждение найденных вариантов методом секвенирования по Сэнгеру

Были подобраны праймеры, фланкирующие участок с найденными полиморфизмами в нуклеотидных последовательностях: FBN1F_ATGAACAAGGGCCACCACTC и FBN1R_ACTTCAGACGGGCAGAGTAA (размер ПЦР-продукта — 900 пн). Постановку ПЦР осуществляли в 20 мкл смеси, где содержалось по 0,2 мМ каждого нуклеотида, 1х буфер для ПЦР, 20 нг ДНК-матрицы, 10 нг каждого праймера, 2,5 U ДНК-полимеразы. Амплификацию проводили на амплификаторе GeneAmp PCR System 9700 (Thermo Fisher Scientific, США) при следующих параметрах: 95 °С — 300 с; 30 циклов: 95 °C — 30 с, 62 °C — 30 с, 72 °C — 90 с; 72 °C — 600 с. Перед проведением реакции по Сэнгеру была выполнена очистка полученных ампликонов с использованием коммерческого реактива ExoSAP-IT (Affymetrix, США) по протоколу фирмы-производителя. Нуклеотидная последовательность продуктов ПЦР определялась с помощью набора реактивов ABI PRISM BigDye Terminator v. 3.1 с последующим анализом продуктов реакции на автоматическом секвенаторе ДНК Applied Biosystem 3500 DNA Analyzer (Thermo Fisher Scientific, США) (рис. 3).

Результаты каскадного скрининга

После получения данных генетического анализа сын пробанда был дообследован педиатрами детской поликлиники. При обследовании по данным ЭхоКГ были выявлены аневризма аорты (диаметр на уровне синусов Вальсальвы — 21—22 мм, диаметр на уровне синотубулярного гребня — 16 мм), пролапс створок митрального клапана, пролапс створок трикуспидального клапана. Данные клинического обследования семьи представлены в табл. 1.

Учитывая клиническую картину и результаты генетической диагностики, пробанду и его сыну был установлен диагноз ННСТ — СМ.

Обсуждение

В результате обследования пациента с ДСТ и его родственников 1-й степени родства, в том числе с применением молекулярно-генетических методов, был установлен диагноз СМ пробанду и его сыну и выявлен новый, ранее не описанный патогенный вариант в гене FBN1 — делеция 4 п.о., приводящая к сдвигу рамки считывания и выраженным изменениям аминокислотной последовательности белка фибриллина-1. Диагноз сыну пробанда был установлен в раннем возрасте только благодаря проведению каскадного скрининга и генетического тестирования всех членов семьи.

СМ — это аутосомно-доминантное заболевание, вызванное мутацией в гене FBN1, кодирующего синтез гликопротеина фибриллина-1, при котором происходит нарушение строения соединительной ткани, затрагивающее сердечно-сосудистую систему, органы зрения и опорно-двигательный аппарат [1, 3]. Частота возникновения СМ составляет примерно 1 случай на 9800 общей популяции, причем в 26% случаев нет семейного анамнеза и заболевание возникает в результате мутации de novo [6]. Следует отметить, что СМ обладает выраженной клинической гетерогенностью ввиду различной пенетрантности и экспрессивности [1].

Особое внимание при ведении пациентов с СМ необходимо уделять состоянию сердечно-сосудистой системы, так как у них прежде всего имеется высокий риск ранней сердечной смерти, связанный с разрывом аневризмы крупных сосудов (чаще аорты). Следует отметить, что относительно недавно (около 30 лет назад) средняя продолжительность жизни при СМ составляла 32 года [1]. Основными осложнениями СМ являются прогрессирующая дилатация аорты и возникающая в результате этого недостаточность аортального клапана и расслаивающая аневризма аорты [6]; сердечная недостаточность по застойному типу, обусловленная нарушением сократимости сердечной мышцы и недостаточностью митрального клапана [7]; снижение зрения, вплоть до слепоты, которое объясняется слабостью ресничного пояска и подвывихом или вывихом хрусталика [8]. Из-за высокого риска осложнений таким пациентам необходимо дать индивидуальные рекомендации о графике посещений необходимых специалистов и мерах профилактики и лечения заболевания [1]. Специфического лечения СМ не существует, диагностика и лечение направлены на раннее выявление и профилактику осложнений заболевания. В табл. 2 представлена очередность проведения и перечень необходимых обследований для пациентов с СМ [9].

Примечание. * — периоды быстрого роста требуют более тщательного наблюдения; ** — если результаты обследования не соответствуют нормам, необходимо проводить дообследование. Рекомендуется наблюдение пациента в динамике.

Представляются важными ранняя постановка диагноза, в том числе с применением молекулярно-генетических тестов, и дальнейшее ведение пациентов на протяжении всей жизни неонатологом, педиатром и терапевтом. Кроме того, пациентам с СМ необходима своевременная помощь специалистов, таких как кардиолог, офтальмолог, ортопед, невролог, гастроэнтеролог, гематолог, эндокринолог, работающих единой командой [1].

Кардиологическое обследование включает в себя консультацию кардиолога, ЭхоКГ, ЭКГ, холтеровское мониторирование ЭКГ. ЭхоКГ необходимо делать минимум 1 раз в год. Посещение офтальмолога рекомендовано каждые 6 мес. Клиническое обследование сколиоза также предполагает визит к специалистам ежегодно каждые 6 мес. Каждые полгода необходимо посещать с ребенком таких специалистов, как ортопед и невролог [9].

Визиты к специалистам следует начинать с рождения ребенка, важно делать это регулярно, придерживаясь представленного графика. По достижении пациентом 18 лет он должен переходить к взрослым специалистам и продолжать регулярные обследования. Пациентам с СМ рекомендуется прием продуктов питания, обогащенных белками и витаминами (С, А, Е, РР, группы В — В₁, В₂, В_З, В₆) [10]. Кроме того, им показан прием селективных β-адреноблокаторов в индивидуально подобранной дозировке под контролем пульса и уровня артериального давления [11]. При прогрессировании аневризмы сосудов рекомендовано оперативное лечение [1].

Пациентам с СМ противопоказано занятие тяжелой и легкой атлетикой, участие в спортивных соревнованиях, походы на длительные дистанции, психические перегрузки, растяжки, чрезмерное вытяжение позвоночника. Им не следует получать профессии, связанные с большими физическими и эмоциональными нагрузками. При склонности к спонтанному пневмотораксу необходимо избегать резких колебаний атмосферного давления, полетов на самолете, ныряния, частого использования метро, проживания в зонах жаркого климата и повышенной радиации [4]. Рекомендуется проведение медико-генетического консультирования перед вступлением в брак [4].

Раннее выявление СМ у сына пробанда, описанного в статье, позволит своевременно проводить профилактические мероприятия, направленные на предотвращение осложнений заболевания у ребенка.

Заключение

Таким образом, ввиду высокого риска осложнений и ранней смерти пациенты с СМ представляют собой серьезную проблему для здравоохранения и требуют индивидуального подхода в диагностике и лечении. Применение методов молекулярно-генетической диагностики позволяет поставить диагноз СМ максимально рано, до развития серьезных осложнений, и, соответственно, разработать план персонализированной профилактики и лечения, с целью увеличения продолжительности жизни.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — А.М., А.Е., О.Д.

Сбор и обработка материала — Е.К., А.К., А.Ж., М.Д., О.С., И.Е., М.П.

Написание текста — А.М., Е.К., А.К., А.Е.

Редактирование — А.М., А.К., А.Е.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.