Сокращения:

ГЛК — гипертрофия лимфаденоидного кольца

ХРС — хронический риносинусит

ЕСР — эозинофильный катионный белок

IgE — общий иммуноглобулин E

IL — интерлейкин

IFN — интерферон

МРО — миелопероксидаза

TGF — трансформирующий фактор роста

TNF-α — фактор некроза опухолей альфа

Введение

При хроническом риносинусите (ХРС) воспалительный процесс приводит к ремоделированию слизистой оболочки цитокинами, медиаторами, ферментами и другими факторами, включается механизм повреждения эпителиального барьера. Многие вопросы остаются без ответа, включая механизм инициации ХРС, однако, по-видимому, развитие этой патологии является результатом сочетания факторов окружающей среды, генетической предрасположенности и случайных событий, которые в совокупности способствуют разрушению эпителиального барьера. Большое число исследований не привело к пониманию этиологии ХРС, т.к. сочетание триггерных факторов является очень индивидуальным [1, 2]. Кроме того, терапия, направленная на устранение агентов окружающей среды, редко бывает успешной для лечения ХРС. У взрослых пациентов для некоторых эндотипов ХРС были определены типичные клинические симптомы [3] и лабораторные маркеры, что облегчает выбор лечебной тактики. В отношении детей однозначной позиции по диагностике ХРС на сегодняшний день нет. Более того, в большинстве случаев некоторые симптомы ХРС (например, полипы) манифестируют в зрелом возрасте, поэтому определить эндотип заболевания по фенотипу у ребенка не всегда представляется возможным. Для оптимизации диагностики и выбора персонифицированной тактики ведения детей с ХРС необходимо раннее определение эндотипа заболевания.

Цель исследования — разработка алгоритма диагностики эндотипов ХРС у детей.

Пациенты и методы

Определение маркеров воспаления в носовом секрете было проведено у 160 детей с ХРС в возрасте от 5 до 17 лет, находившихся на лечении в клинике кафедры оториноларингологии РостГМУ в период с января 2018 г. по февраль 2022 г., из которых была сформирована основная группа. Контрольную группу составили 30 практически здоровых детей в возрасте 5—17 лет, не имеющих жалоб на нарушение носового дыхания, без хронических заболеваний, из групп диспансерного наблюдения. Пациенты основной группы были разделены на 5 подгрупп по фенотипам ХРС: 42 больных ХРС без полипов и коморбидной патологии, 40 больных ХРС с полипами, 28 больных ХРС с аллергическим ринитом, 16 больных ХРС и бронхиальной астмой, 34 больных ХРС с гипертрофией лимфаденоидного кольца (ГЛК) глотки. Всем пациентам было проведено эндоскопическое исследование, компьютерная томография околоносовых пазух. При обследовании особое внимание уделяли анализу медицинской документации (амбулаторная карта ребенка, выписки из истории болезни при госпитализации по поводу коморбидной патологии), подтверждающей сопутствующий ХРС диагноз. Для определения эндотипов ХРС у детей было выбрано 12 биологических маркеров воспаления: интерлейкин (IL)-5, интерферон (IFN)-γ, IL-17α, фактор некроза опухолей (TNF)-α, IL-22, IL-6, IL-33, IL-35, эозинофильный катионный белок (ECP), миелопероксидаза (МРО), трансформирующий фактор роста (TGF)-β1, общий иммуноглобулин E (IgE). Уровень цитокинов определяли в сыворотке крови и в носовом секрете. Носовой секрет собирали с помощью рассасывающейся полиуретановой губки NasoPore (Polyganics, Нидерланды) размером 20×10×5 мм в течение 10 мин. Удаленные кусочки губки полностью погружали в 20 мл физиологического раствора на 10 мин. После удаления губки раствор центрифугировали при 1000 об/мин в течение 10 мин. Центрифугат хранили при температуре −70 °C [4].

Результаты и обсуждение

Ранее авторами настоящей статьи было проведено исследование маркеров сыворотки крови [5], в ходе которого с помощью кластерного анализа выделено 5 кластеров (эндотипов ХРС). По маркерам носового секрета с помощью кластерного анализа было выявлено 3 кластера. Более того, по сравнению с распределением больных по эндотипам сыворотки крови по показателям носового секрета наметилась более четкая тенденция распределения больных по 3 эндотипам (рис. 1).

Рис. 1. Дендрограмма при кластеризации показателей сыворотки крови (а) и носового секрета (б).

При сравнительном анализе средних значений уровня маркеров в кластерах сыворотки крови и носового секрета установлено, что Th-2-эндотип (1-й эндотип) по показателям носового секрета схож по диагностическим показателям с 3 субэндотипами по показателям сыворотки крови — это субэндотипы с полипами (1.1), с аллергическим ринитом (1.2), и бронхиальной астмой (1.3). Th-1-эндотип (2-й эндотип) носового секрета аналогичен 2-му эндотипу сыворотки, а 3-й эндотип носового секрета полностью соответствует 3-му эндотипу сыворотки (табл. 1). Распределение фенотипов в кластерах эндотипов представлено на рис. 2.

Таблица 1. Средние значения уровня маркеров в сыворотке крови и носовом секрете больных для каждого эндотипа

Примечание. * — значимые отличия по сравнению с контрольной группой p<0,001.

Рис. 2. Сопряжение между фенотипами и эндотипами по показателям носового секрета (c² (Yates)=209,8; p<0,0001).

Анализ сопряжения между фенотипами и всеми эндотипами подтвердил, что фенотип ХРС с полипами и сопутствующими заболеваниями (аллергический ринит и бронхиальная астма) имеет один эндотип по маркерам носового секрета, но разные субэндотипы (1.1, 1.2 и 1.3) по маркерам сыворотки крови. Паттерн изменения уровня маркеров имеет сходные векторы (рис. 3 б). Достаточно четко прорисовывается Th-2 иммунный ответ, связанный с экспрессией IL-5, IL-17, IL-33, играющих значительную роль при эозинофильном ХРС и других формах ХРС с проявлением воспаления 2-го типа. Аллергическое воспаление может изменить физиологический механизм слизистой оболочки и способствовать развитию ХРС. Известно, что распространенность бронхиальной астмы у больных ХРС и аллергическим ринитом достигает 40%, что в 4 раза превышает распространенность этого заболевания в детской популяции [6]. Это подтверждает идею о том, что клинический контроль ХРС может иметь важное значение для оптимизации контроля трудноизлечимой астмы. Верификация Th-2-эндотипа на ранних стадиях ХРС до проявления сопутствующих заболеваний позволит решить эту задачу [7, 8].

Рис. 3. Средние стандартизированные значения для показателей каждого эндотипа.

Фенотип ХРС без полипов и сопутствующей патологии имеет практически одинаковый набор маркеров в носовом секрете и в сыворотке крови, т.е. это один эндотип (см. рис. 3, а). Характерными маркерами стали цитокины Th-1-воспаления. В отличие от 2-го пути, Th-1-ответ менее прогнозируем. В ответ регулируемые местные сигналы, предшественники Th-0-клетки, могут генерировать характеристики других подтипов (процесс, известный как «пластичность» [9]) под влиянием цитокинов и хемокинов антиген-представляющих или эпителиальных клеток. Однако большинство исследователей связывают этот фенотип с персистенцией вирусной инфекции или другими факторами, вызывающими повреждение клеток эпителиального барьера (например, рефлюкс-синдрома, анатомических причин, др.) [7]. В некоторых случаях диагноз ХРС может быть «маской» других заболеваний.

Фенотип ХРС на фоне ГЛК глотки стал наиболее ярким проявлением собственного эндотипа и по маркерам носового секрета, и по маркерам сыворотки крови с высокой степенью сопряжения (см. рис. 3, в). Недавние обзоры литературы подтвердили гипотезу о роли аденоидов в формировании ХРС [10, 11]. Несмотря на это, никакие исследования не показали корреляции между размером аденоидов и выраженностью симптомов ХРС. Эти данные позволяют предположить, что аденоиды способствуют развитию ХРС не только и не столько как механическое препятствие, но и являются бактериальным резервуаром. Данный эндотип характеризуют маркеры ремоделирования тканей TGF-β1, MPO, а также высокие концентрации IL-35. В последнее время широко исследуется роль регуляторных T-клеток (Treg) в балансировании эффекторного звена иммунной системы. Эти регуляторные реакции используют разные механизмы подавления воспаления. Недавно идентифицированный IL-35 обладает мощной супрессивной функцией in vitro и in vivo [12], секретируется Treg, может регулировать B- и T-клетки, индуцировать собственную пролиферацию [13]. Кроме того, IL-35 не только обладает способностью непосредственно подавлять эффекторные T-клеточные ответы, но и способен расширять регуляторные ответы, создавая мощную популяцию индуцируемых Treg [14]. Ремоделирование определяется как ненормальное изменение поврежденных тканей в результате воспаления. Возможно, при недостаточном иммунном ответе на бактериальный возбудитель, за счет подавления воспаления 2-го типа, происходит стимуляция пролиферации в виде гипертрофии элементов лимфокольца глотки.

Как связаны между собой эндотипы и могут ли они заменять друг друга, пока не ясно. У пациентов могут проявляться разные симптомы воспаления в различной степени выраженности. Вероятно, могут существовать подтипы, в которых отдельные факторы воспаления в определенное время выходят на первый план. В настоящее время стала доступна биологическая терапия, нацеленная на определенные аспекты воспаления Th-2-типа. Поэтому весьма актуальными на сегодняшний день являются исследования, направленные на поиск вариантов персонализированной терапии для пациентов с ХРС, при которой лечение основано на молекулярных биомаркерах эндотипа или субэндотипа, активированных у отдельного пациента.

Полученные нами данные о диагностических маркерах эндотипов ХРС позволяют разработать алгоритм диагностики. Наименее инвазивным способом исследования у ребенка с ХРС, помимо рекомендованных регламентирующими документами, является забор носового секрета. Таким образом, на первом этапе для выявления эндотипа ХРС можно исследовать воспалительные маркеры в носовом секрете, по экспрессии которых определить Th-1- и Th-2-эндотипы и эндотип, ассоциированный с ГЛК глотки.

При разработке математической модели алгоритма были сопоставлены результаты лабораторных исследований с классами эндотипов и с помощью пошагового дискриминантного анализа отобраны показатели, которые в совокупности обладали высокой дискриминантной мощностью и позволили разделить пациентов на подгруппы. Наличие дискриминирующих особенностей переменных определяли по критериям лямбда Уилкса, частная лямбда Уилкса и по значению F-статистики.

Для показателей носового секрета в этот комплекс предикторов вошло 10 из 12 маркеров: IFN-γ, IL-5, IL-17, IL-22, IL-33, IL-35, TGF-β1, МРО, ЕСР, IgE. Все переменные, включенные в статистическую модель, имели статистически значимое влияние на результат классификации эндотипов. Из всех переменных наиболее выраженная дискриминирующая мощность отмечена для IL-35, MPO, IFN-γ, ЕСР, TGF-β1, IL-33 (табл. 2).

Таблица 2. Дискриминирующая мощность модели по маркерам носового секрета

Методом дискриминантного анализа в математических выражениях для 3 функций, соответствующих 3 эндотипам, были найдены коэффициенты для 10 показателей с целью автоматизированного расчета. Таким образом, основными маркерами 1-го эндотипа (Th-2-эндотип) стали ЕСР и IL-33, маркером 2-го эндотипа (Th-1-эндотип) — IFN-γ, маркерами 3-го эндотипа (эндотип, ассоциированный с ГЛК) — IL-35, МРО, TGF-β1.

Для определения субэндотипов Th-2-эндотипа можно провести второй этап диагностики — определение маркеров в сыворотке крови. Определение субэндотипов ХРС Th-2-эндотипа позволяет выявлять маркеры риска развития ХРС с полипами (эндотип 1.1), аллергического ринита (эндотип 1.2), бронхиальной астмы (эндотип 1.3). Высокой дискриминантной мощностью среди показателей сыворотки крови обладали 8 из 12 маркеров: IFN-γ, IL-22, IL-33, IL-35, IL-5, IL-17, ЕСР, IgE. Из этих переменных наиболее выраженная дискриминирующая мощность была отмечена для IL-35, ECP, IL-17, IL-22, IL-5 (табл. 3).

Таблица 3. Дискриминирующая мощность модели по маркерам сыворотки крови

После расчета коэффициентов для 3 функций, соответствующих 3 субэндотипам, было установлено, что основными маркерами субэндотипа ХРС с полипами стали IL-17 и IL-22, маркером субэндотипа ХРС с аллергическим ринитом — ЕСР, маркерами субэндотипа ХРС с бронхиальной астмой — IL-35. Причем для IL-35, в отличие от остальных маркеров, показателем является его значительное снижение (рис. 4).

Рис. 4. Алгоритм диагностики эндотипов ХРС у детей.

Выводы

1. Основными маркерами носового секрета для Th-2-эндотипа ХРС являются ECP и IL-33, маркером Th-1-эндотипа — IFN-γ, маркерами эндотипа ХРС, ассоциированного с ГЛК глотки — IL-35, MPO, TGF-β1.

2. Для определения субэндотипов Th-2-эндотипа ХРС можно использовать маркеры сыворотки крови: для субэндотипа ХРС с полипами — IL-17 и IL-22, для субэндотипа ХРС с аллергическим ринитом — ECP, для субэндотипа ХРС с высоким риском развития бронхиальной астмы — снижение уровня IL-35.

3. Определение эндотипа и субэндотипа ХРС позволит своевременно выявлять и проводить профилактику неконтролируемых форм ХРС и коморбидных состояний.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — И. В. Стагниева

Сбор и обработка материала — И. В. Стагниева, Н.В. Бойко, П.А. Статешная, С.Д. Стагниев

Написание текста — И.В. Стагниева, Н.В. Бойко, П.А. Статешная

Редактирование — И.В. Стагниева

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.