Актуальность
В деятельности лечебно-профилактических учреждений (ЛПУ) стоматологического профиля и зуботехнических лабораторий существует несколько критических моментов, представляющих биологическую опасность как для персонала медицинского учреждения, так и для пациентов, поскольку они сопряжены с высоким риском распространения инфекционных заболеваний [1—3]. Прежде всего, таким критическим процессом является изготовление слепков (оттисков) зубных рядов, в результате чего происходит контаминация оттисков, а затем и изготавливаемых зубных протезов [4—7].
По данным современной литературы в области дезинфектологии, многие возбудители из таких групп микромира, как бактерии, вирусы, простейшие и грибы, обладают достаточно высокой выживаемостью на объектах окружающей среды, а тем более контаминированной биологическими выделениями пациента (слюна, слизь, кровь и т.п.). Ряд опасных возбудителей (микобактерии туберкулеза, бациллы сибирской язвы, вирус гепатита В, пневмоцисты, хламидии, прионы) могут сохраняться на объектах даже в условиях жесткой химической обработки [8—11].
Данный круг инфекционных заболеваний правомочно относится к инфекциям, связанным с оказанием медицинской помощи (ИСМП). Поэтому для ЛПУ стоматологического профиля и зуботехнических лабораторий важнейшим профессиональным направлением деятельности является соблюдение современных требований инфекционной безопасности и проведение противоэпидемических мероприятий на рабочем месте [11—13].
Ранее в исследованиях М.С. Саркисяна и соавт. (2000) было показано, что контаминация оттисков таким патогеном, как Enterococcus faecalis, при хранении их 24 ч во влажной камере приводит к увеличению микробного числа более чем в 100 раз, т.е. представители некоторых видов микробов могут не только сохраняться и выживать, но и размножаться при подходящих условиях [7].
Результатом является попадание патогенов в зуботехническую лабораторию, т.е. в зону профессиональной деятельности зубного техника, что, соответственно, приводит к контаминации (инфицированию) всего оборудования, рабочего места специалиста, а также изготавливаемых съемных и несъемных зубных протезов, ортодонтических лечебно-профилактических аппаратов, зубочелюстных конструкций и лицевых эпитезов. Это определяет необходимость и важность проведения дезинфекции данных изделий на уровне рабочего места врача — стоматолога-ортопеда и зубного техника [14—16].
Необходимо учитывать, что в последние годы наблюдается повсеместный рост ИСМП в связи с пандемическим распространением новой коронавирусной инфекции, вызываемой вирусом SARS-CoV-2. Повышенную восприимчивость к инфекционным осложнениям при данной патологии исследователи проблемы объясняют существенным нарушением иммунных процессов в организме больного и регуляции гомеостаза в целом, причем нарушения этих жизненно важных регуляторных процессов сохраняются в течение длительного времени также и в период реконвалесценции [17—19].
В условиях пандемии коронавирусной инфекции одной из приоритетных задач является дезинфекция объектов окружающей среды с целью соблюдения противоэпидемического режима. Это требует более тщательных подходов к соблюдению соответствующих методологических приемов и алгоритмов, которые описаны в руководствах по дезинфектологии, методических рекомендациях и стандартах, включая международные [1—3, 20]. В частности, при проведении дезинфекции оттисков зубов необходимо обеспечение максимального снижения степени микробной обсемененности объектов обработки и минимизации риска распространения ИСМП.
При деконтаминации оттисков (слепков), изготовленных из силикона и альгинатов, а также и самих протезов из полимеров, которые подвержены образованию микробных биопленок, предполагается следующая этапность обработки, которая включает:
1) предстерилизационную очистку;
2) собственно дезинфекцию;
3) стерилизацию (при необходимости).
Химическая дезинфекция оттисков (слепков) проводится методом погружения в дезинфицирующий раствор с использованием химически активных соединений. Поэтому важным условием инфекционной безопасности производства протезов является подбор таких дезинфицирующих препаратов, которые не оказывали бы существенного влияния на объемные параметры и текстуру оттиска, не вызывали бы деструкции оттискного материала [4, 6, 9]. Следует также учитывать, что применение большинства химических дезинфектантов сопряжено с риском для медицинского персонала из-за побочного токсического или аллергогенного действия [4, 5, 8, 10]. Все описанные обстоятельства необходимо учитывать при выборе оптимального препарата для проведения деконтаминации.
Поэтому задача оптимизации процесса химической дезинфекции и оценки влияния комбинаций антисептических препаратов друг с другом и с препаратами, очищающими (деконтаминирующими) после изготовления оттисков зубного ряда и самих протезов, остается актуальной и требует тщательного изучения.
Цель исследования — применение инновационного метода экспериментального микробиологического исследования — программируемого культивирования — для выбора оптимальных средств эффективной дезинфекции оттисков зубного ряда.
Материал и методы
Культуральное исследование. Первичные посевы проводили на питательные среды производства Himedia Laboratories Pvt. Limited (Индия): для выделения клинических изолятов Staphylococcus spp. — М521 (стафилококковый агар N110); Actinomyces spp., Corynebacterium spp., Enterococcus spp., Streptococcus spp. — М144 (колумбийский агар с 5% (об/об) дефибринированной крови и селективной добавкой для выделения стрептококков); Prevotellla spp., Porphyromonas spp., Fusobacterium spp. — М144 (колумбийский кровяной агар с 5% (об/об) дефибринированной крови и селективной добавкой для выделения неспоровых анаэробов (гемин, менадион)); C. albicans, С. krusei — М1297 (хромогенный агар с селективной добавкой для дрожжевых грибов Candida (хлорамфеникол 0,50 г/л)). Посевы помещали в термостат при температуре 37°C для бактериальной микробиоты и 25,0°C для грибковой микробиоты. Результат роста культур учитывали через 48 ч [9, 16].
Дальнейшую идентификацию полученных культур осуществляли с учетом биохимических свойств в тестах Biochemical Identification Test Kits (Himedia, Индия).
Штаммы микроорганизмов. В процессе проведения эксперимента использовали следующие штаммы: Staphylococcus aureus АТСС 25993; Fusobacterium necroforum, Candida albicans, Candida krusei. Непосредственно перед проведением эксперимента in vitro применяли методику подращивания бактериальных клеток тест-штаммов микроорганизмов с целью получения полноценной планктонной взвеси определенной оптической плотности в среде накопления (полужидкая среда на основе сердечно-мозгового бульона, 0,5% агар-агара).
Для решения задачи экспериментальной части исследования использовали биореактор (рис. 1) «Реверс-Спиннер RTS-1» (BioSan, Латвия), который позволяет реализовать инновационный тип перемешивания планктонной фазы биокультур микроорганизмов, что дает возможность провести количественную оценку этапов роста популяции в режиме реального времени, в том числе при параллельном воздействии антимикробными агентами (дезинфектантами). Для сравнительной оценки были взяты отечественные препараты из группы ЧАС: бензалкония хлорид (БАХ), цитилпиридиния хлорид (ЦПХ), бензилдиметил[3-(миристоиламино)пропил]аммония хлорид (БМХ), коммерческое название «мирамистин». Интерпретацию результатов проводили с помощью компьютерной программы по изменению оптической плотности (OD) при длине волны λ=850 нм.
Рис. 1. Система автоматизированного культивирования микроорганизмов «Реверс-Спиннер RTS-1» (BioSan, Латвия).
Для определения чувствительности выделенных штаммов применяли модификацию метода серийных разведений, разработанную на кафедре микробиологии, вирусологии, иммунологии МГМСУ им. А.И. Евдокимова, с учетом, с цифровой регистрацией результатов и с оценкой кривых роста микробных популяций в динамике на протяжении 72—96 ч после внесения дезинфектанта [21].
Для каждого эксперимента отдельно в стерильных пробирках объемом 15 мл готовили бактериальную взвесь в общем количестве 5 мл. Оптическую плотность полученной взвеси измеряли с помощью денситометра DEN-1B (BioSan, Латвия), для каждого эксперимента она составила 0,5±0,3 McF (1,5·108 КОЕ). Исследование динамики роста микроорганизмов проводили в нескольких параллелях, что отражалось на графиках развития бактериальных популяций. Оценка контроля роста соответствующего вида бактерий или грибов отражалась в изменении значений оптической плотности, на основании чего была построена кривая.
Результаты исследования и их обсуждение
На первом (клиническом) этапе работы была проведена количественная оценка микробной обсемененности альгинатных оттисков зубных рядов (всего 30 образцов) с последующей идентификацией наиболее значимых представителей микробиоты. В результате проведенного нами микробиологического исследования получены следующие данные о составе микробиоты альгинатных оттисков верхней и нижней челюсти (16 и 14 образцов соответственно) съемных зубных протезов. В качестве примера на фотографии представлен альгинатный оттиск нижней челюсти под полный съемный протез (рис. 2).
Рис. 2. Первичный альгинатный оттиск нижней челюсти под полный съемный протез.
Как свидетельствуют представленные данные, в смывах с альгинатных оттисков доминировали представители Streptococcus sanguis (100%), Enterococcus spp. (90,0%), Corynebacterium spp. (100,0%), Lactobacillus spp. (93,3%), анаэробных возбудителей — Fusobacterium spp. (90,0%), Prevotella intermedia и Porphyromonas gingivalis (75—76%), а также дрожжевые грибы Candida (90,0%), причем преобладали представители вида C. albicans (70,0%).
Несколько реже, но практически у каждого второго пациента (примерно 50%) определяли прочие виды Streptococcus spp., а также Staphylococcus spp., Actinomyces spp., Enterobacteriaceae spp., Leptotrichia spp. (табл. 1).
Таблица 1. Характеристика микробиоты альгинатных оттисков
| Род, вид | Кол-во оттисков (n=30) | Частота (% от кол-ва оттисков) | Микробное число (КОЕ/ед) |
| Streptococcus sanguis | 30 | 100,0 | 108±102* |
| Streptococcus spp. | 15 | 50,0 | 107±102* |
| Staphylococcus spp. | 14 | 46,7 | 105±102* |
| Enterococcus spp. | 27 | 90,0 | 108±102* |
| Actinomyces naeslundii | 14 | 46,7 | 105±102 |
| A.israelii | 11 | 36,7 | 105±102* |
| Corynebacterium spp. | 30 | 100,0 | 107±102* |
| Fusobacterium spp. | 27 | 90,0 | 106±102* |
| Prevotella intermedia | 23 | 76,7 | 106±102* |
| Prevotella spp. | 12 | 40,0 | 105±102 |
| Porphyromonas gingivalis | 20 | 75,0 | 107±102* |
| Enterobacterium spp. | 14 | 46,7 | 106±102* |
| Lactobacillus spp. | 28 | 93,3 | 106±102 |
| Leptotrichia buccalis | 18 | 60,0 | 105±102* |
| Candida albicans | 21 | 70,0 | 106±102* |
| Candida spp. | 8 | 26,7 | 105±102* |
| Всего штаммов | 312 | 100,0 | — |
Примечание. * — достоверная разница по сравнению со средним нормативом микробной обсемененности слизистой рта 104+102 при pm–u<0,05.
При этом количественный уровень микробной обсемененности был довольно значительным (от 105 до 108 КОЕ/ед) и для большинства видов существенно превышал установленные нормативы [22], в том числе по стрептококкам, энтерококкам, энтеробактериям, анаэробам и дрожжевым грибам, которые представляют опасность как возбудители ИСМП.
Полученные результаты клинических исследований позволили нам поставить вопрос о необходимости обоснованного выбора оптимальной концентрации препарата для химической дезинфекции оттисков с использованием инновационного метода программируемого культивирования тестовых штаммов в биореакторе в реальном времени при условии добавления в разные линии прибора исследуемых препаратов в разных концентрациях. С другой стороны, с учетом полученных данных был проведен выбор тестовых штаммов микроорганизмов. При оценке результатов компьютерных графиков развития микробных популяций анализировали все основные фазы роста популяций: адаптивную (лаг-фазу), экспоненциальную (лог-фазу), стационарную, отмирания, а также скорость прироста бактериальных популяций, которые были индивидуальны для каждого вида микроорганизма и менялись в пробах с исследуемыми препаратами.
На втором (экспериментальном) этапе исследования проводили сравнительную оценку эффективности различных дезинфектантов группы ЧАС с использованием инновационного метода программируемого культивирования тестовых штаммов микроорганизмов (каждый эксперимент проводили в 3-разовой повторности). При этом учитывали не только концентрации, ингибирующие рост, но и время наступления восстановления размножения тест-штамма как показатель бактериостатического эффекта.
На рис. 3 представлен график, иллюстрирующий кривые роста тест-штамма S. aureus в течение 2 сут наблюдения при использовании рабочих растворов БАХ. По сравнению с контрольным ростом в бульоне видно, что пробы, содержащие разные концентрации препарата — от 0,012% до 0,2%, давали угнетение роста различной степени выраженности, а при концентрациях 0,1—0,2% достоверного роста патогена не наблюдалось. Следует обратить внимание на то, что рост культуры в зависимости от концентрации восстанавливался через 6—12 ч (0,012—0,025%), максимально — через 32 ч (0,05%), что расценивали как максимальную бактериостатическую концентрацию. Соответственно, бактерицидные концентрации, при которых рост тест-штамма отсутствовал на протяжении всего периода наблюдения, составляли 0,1—0,2%.
Рис. 3. Кривые роста референс-штамма S. aureus с разными концентрациями БАХ.
При исследовании влияния ЦПХ на тест-штамм S. aureus картина принципиально не отличалась (рис. 4). Рост культуры в зависимости от концентрации восстанавливался через 6—10 ч (0,012—0,025%), максимально — через 12 ч (0,05%), что расценивали как максимальную бактериостатическую концентрацию. Однако по скорости восстановления микробной популяции при использовании бактериостатической концентрации препарат уступал бензалкония хлориду. Бактерицидные концентрации не отличались и составляли 01—0,2%.
Рис. 4. Кривые роста референс-штамма S. aureus с разными концентрациями ЦПХ.
Результаты исследования препарата БМХ в отношении тест-штамма S. aureus по сравнению с контролем роста культуры в бульоне и с контролем стерильности посева представлены на рис. 5. Рост культуры в зависимости от концентрации восстанавливался через 16—18 ч (0,012—0,025%), максимально — через 20 ч (0,05%), что расценивали как максимальную бактериостатическую концентрацию. Следовательно, по скорости восстановления микробной популяции при использовании бактериостатической концентрации препарат превосходил ЦПХ и не уступал БАХ. Бактерицидные концентрации препарата БМХ были аналогичными другим ЧАС (0,1—0,2%).
Рис. 5. Кривые роста референс-штамма S. aureus с разными концентрациями БМХ.
Суммарные данные, полученные при анализе чувствительности к исследуемым дезинфектантам ЧАС всех использованных в исследовании аэробных и анаэробных тест-штаммов, представлены в табл. 2.
Таблица 2. Чувствительность тест-штаммов к исследуемым ЧАС по результатам анализа кривых роста микробных популяций in vitro
| Название препарата и штамм | Бактерио/фунгистатическая концентрация, % | Микробоцидная концентрация, % |
| 1. Бензалкония хлорид | ||
| S. aureus | 0,025 | 0,05 |
| F. necroforum | 0,025 | 0,05 |
| C. albicans | 0,05 | 0,1 |
| C. krusei | 0,1 | 0,2 |
| 2. Цитилпиридиния хлорид | ||
| S. aureus | 0,012 | 0,05 |
| F. necroforum | 0,012 | 0,025 |
| C. albicans | 0,025 | 0,1 |
| C. krusei | 0,1 | 0,2 |
| 3. Бензилдиметил[3-(миристоиламино)пропил]аммоний хлорид | ||
| S. aureus | 0,012 | 0,025 |
| F. necroforum | 0,012 | 0,012 |
| C. albicans | 0,025 | 0,05 |
| C. krusei | 0,025 | 0,2 |
Очевидно, что бактерицидная концентрация, при которой полностью блокировался рост аэробных и анаэробных бактерий, составила 0,05% для БАХ, 0,05—0,025% для ЦПХ и 0,025—0,012% для БМХ. Следовательно, бактерицидная концентрация БМХ была в 2 раза ниже по сравнению с другими ЧАС для обоих тестируемых бактериальных видов, что можно отметить как важное преимущество препарата. Для дрожжевых грибов C. albicans и C. krusei отмечался некоторый сдвиг действующих концентраций в сторону более низкой чувствительности к препаратам, чем у тест-штаммов бактерий — до 0,1% и 0,2% для C. abicans и C. krusei соответственно. Представители C. krusei были более устойчивы к воздействию, причем БМХ показал самую низкую бактерицидную концентрацию по отношению к штамму C. albicans — 0,05%, т.е. в 2 раза ниже, чем у других исследуемых ЧАС (p<0,05).
Обсуждение результатов
При использовании метода химической дезинфекции применяют различные химические вещества, позволяющие провести процедуру полноценной деконтаминации методом погружения в раствор дезинфектанта. При этом активность определенного дезинфектанта различна для разных видов микроорганизмов и зависит от концентрации, температуры, pH и некоторых других параметров. Среди основных механизмов биоцидного (антибактериального) действия выделяют: деструктивный с литическим или денатурирующим эффектом, окислительный механизм, мембраноатакующий механизм, блокирующий ферментную и токсинную активность патогенов [13, 16, 22].
В качестве контрольных микроорганизмов обычно используют штаммы представителей вида Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Candida albicans. В амбулаторных и стационарных ЛПУ стоматологического профиля рекомендуют использовать штаммы микроаэрофильных стрептококков Streptococccus sanguis, актиномицетов и анаэробов пародонтопатогенной группы [6, 7, 20, 23].
Как отмечается в ряде ранних исследований, вопрос о влиянии дезинфектанта на свойства оттискных материалов заслуживает особого внимания. Соотношение степени эрадикации и возможного отрицательного действия на оттиск является важным показателем для конкретного дезинфектанта. Последнее, по мнению профессора С.Д. Арутюнова и соавт., должно служить объектом применения цифровых технологий в ортопедической стоматологии [9].
Очевидно, что при выборе оптимального дезинфектанта и метода дезинфекции оттисков зубного ряда следует учитывать особенности микробной контаминации, в частности наличие биологических выделений самого пациента (слизь, слюна, кровь и т.п.), которые затрудняют процесс деконтаминации [4, 10—12].
В этом плане ЧАС представляют собой весьма перспективную группу, так как обладают свойствами детергентов и высокой антимикробной активностью. В цитируемых работах рассматриваются возможные механизмы усиления биоцидной активности дезинфицирующих композиций на основе ЦПХ и БАХ с наночастицами соединений меди, что было доказано результатами бактериологического исследования и сканирующей электронной микроскопии. Безопасность композиций была подтверждена на модели экспериментального псевдотуберкулеза у белых мышей [24, 25].
Оптимальное соотношение бактерицидного эффекта и сохранности обрабатываемых материалов показано для дезинфектантов группы ЧАС и в других работах [6, 8—10].
Подтверждением данного положения являются также и результаты настоящего исследования, полученные с применением инновационного метода культивирования тест-штаммов микроорганизмов в биореакторе с цифровой регистрацией результатов и построением кривых роста бактериальных популяций на компьютере. На основании проведенного исследования можно констатировать, что в настоящее время наиболее перспективными препаратами группы ЧАС по проявлению бактериостатического и бактериоцидного действия в минимальных концентрациях (по сравнению с другими препаратами) и по фунгицидной активности в отношении дрожжевых грибов являются дезинфектанты отечественного производства.
Выводы
1. Бактерицидная концентрация, при которой полностью блокировался рост аэробных бактерий (S. aureus) и анаэробных бактерий (F. necroforum), составила 0,05% для БАХ, 0,05—0,025% для ЦПХ и 0,025—0,012% для БМХ.
2. Активность в отношении штаммов дрожжевых грибов C. albicans и C. krusei составила 0,1% и 0,2% соответственно у БМХ.
3. Бактерицидная концентрация БМХ была в 2 раза ниже по сравнению с другими ЧАС для всех тестируемых штаммов, что можно отметить как важное преимущество препарата.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.