Введение
Среднегодовой темп прироста заболеваемости раком шейки матки (РШМ) за последнее десятилетие на территории Российской Федерации составил 2,19%, общий прирост — 24,93%. Стандартизованный показатель (мировой стандарт) заболеваемости РШМ в Республике Мордовия в 2018 г. составил 14,36 на 100 тыс. женского населения (по Российской Федерации — 15,80±0,12). Однако несколько лет назад ситуация по республике была менее благополучная, а в 2010 г. на 100 тыс. населения стандартизованный показатель составлял 13,34 и почти был равен общему показателю по России — 13,71±0,12 [1].
В связи с этим актуальным остается изучение механизмов развития неопластических процессов с целью определения оптимальной тактики ведения пациенток данных групп.
Общепризнанным пусковым механизмом неопластической трансформации эпителия шейки матки служит инфицирование высокоонкогенными штаммами вируса папилломы человека (ВПЧ) [2, 3]. Возникновению неопластического процесса, как правило, способствует несколько стадий:
1. Инфицирование ВПЧ.
2. Нахождение генома вируса в эписомальной форме с воспроизводством вирусных частиц.
3. Поликлональное внедрение вирусной ДНК в геном клетки хозяина.
4. Индукция мутаций в клеточную ДНК, которая вызывает нестабильность генома.
5. Размножение клона клеток с измененной ДНК, содержащей вирусную ДНК.
Однако это лишь способствует инициации опухолевого процесса, но является недостаточным условием для дальнейшей его прогрессии [4, 5].
Риск развития предрака и РШМ имеют только женщины с длительной персистенцией ВПЧ высокого канцерогенного риска (ВПЧ ВКР).
Определенную роль в персистенции папилломавирусной инфекции (ПВИ) и развитии данных процессов играют локальные иммунные механизмы, в частности цитокиновая регуляция локального иммунного ответа на ВПЧ [6, 7].
Классическая концепция цервикального канцерогенеза предполагает последовательную смену: CIN I — CIN II — CIN III — на фоне персистирующей ВПЧ-инфекции [8].
Алгоритм ведения пациенток с CIN I требует активного наблюдения с использованием цитологического исследования и кольпоскопии ввиду высокого уровня спонтанной регрессии и низкого уровня прогрессии этих поражений. Особые трудности возникают при обследовании пациенток с CIN II, поскольку данное поражение имеет высокую степень и наиболее часто связано с длительной персистенцией ПВИ.
Значимую роль в регуляции иммунного ответа играют цитокины, представляющие собой широкую группу факторов межмолекулярного взаимодействия, в которую входят интерфероны (ИФН), интерлейкины (ИЛ), ростовые факторы. В настоящее время система цитокинов представляется как сложная, взаиморегулируемая сеть, каждый компонент которой может дублировать, дополнять, усиливать или подавлять действие других цитокинов [9, 10].
Основополагающими факторами противовирусной защиты на ранних этапах иммунных процессов служат NK-клетки, выполняющие литическую функцию. Они не являются антигенспецифическими клетками, вызывают независимый от антител и комплемента лизис клеток-мишеней, распознают свои клетки-мишени без участия антигенов гистосовместимости и относятся к факторам естественной резистентности. Несмотря на то что NK-клетки реализуют цитотоксическую реакцию без развернутого иммунного ответа, они нуждаются в предварительной активации. У NK-клеток есть рецепторы цитокинов: ИЛ-2, ИЛ-15, ИЛ-18, ИФН-γ, благодаря которым регулируется их активация и пролиферация [11].
ИЛ-18 является потенциальным индуктором синтеза ИФН-γ и NK-клеток. Оказывая влияние на секрецию ИФН-γ, он быстро активирует клетки моноцитарно-макрофагальной системы, что ведет к активации множества антибактериальных, противоопухолевых и антивирусных ответных реакций.
Биологические эффекты ИФН-γ связаны с активацией мононуклеарных фагоцитов с непосредственным влиянием на дифференцировку T- и B-лимфоцитов, активацией нейтрофилов и естественных киллеров, а также эндотелиальных клеток [12, 13].
Фактор некроза опухоли альфа (ФНО α) является важным индуктором апоптоза, который способен оказывать прямое повреждающее действие на клетки-мишени [14]. Он обладает не только противоопухолевой цитотоксичностью, но и воспалительной и иммунной реактивностью.
Цель исследования — изучение уровня провоспалительных цитокинов в цервикальной слизи у женщин репродуктивного возраста с цервикальной интраэпителиальной неоплазией шейки матки II степени.
Материал и методы
Для решения поставленных задач за период с 2018 по 2019 г. были обследованы 172 женщины. Основную группу составили 86 пациенток, обратившихся в амбулаторно-поликлинические учреждения Республики Мордовия для обследования и лечения по поводу патологического состояния шейки матки (CIN II), индуцированного ВПЧ. Равной по численности пациенток (86) являлась контрольная группа, представленная вируснегативными пациентками, имевшими нормальный результат цитологического исследования, соответствующий категории NLIM (no intraepithelial lesion or malignancy — отсутствие интраэпителиального поражения или злокачественности).
Возраст обследованных женщин варьировал от 18 до 49 лет и в среднем составил 37,53±0,45 года.
От всех обследованных пациенток было получено письменное информированное добровольное согласие на участие в исследовании.
В исследование не включались беременные и кормящие женщины, женщины детородного возраста, не использующие адекватную контрацепцию; женщины с наличием сопутствующих урогенитальных инфекций в активной фазе и острых экстрагенитальных заболеваний, которые могут существенно повлиять на ход исследования и дать искаженные результаты.
При типировании ВПЧ у пациенток основной группы исследования были обнаружены различные высокоонкогенные типы ВПЧ. В качестве метода выявления ДНК ВПЧ ВКР использовалась полимеразная цепная реакция (ПЦР) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени при помощи диагностического комплекта «АмплиСенс ВПЧ ВКР скрин-титр-FL». Концентрацию ДНК ВПЧ выражали в lg (ВПЧ на 100 тыс. клеток) и оценивали следующим образом: менее 3 lg — малозначимая, от 3 lg до 5 lg — клинически значимая, более 5 lg — повышенная вирусная нагрузка. Помимо этого, у всех пациенток (n=86) была CIN II по результатам жидкостного онкоцитологического исследования в соответствии с терминологической системой Bethesda (TBS). Это служило критерием включения в исследование.
Материалом для изучения локального иммунного ответа явилась цервикальная слизь. Образцы цервикального отделяемого отбирали методом аспирации с помощью туберкулинового шприца с катетером (без иглы) из цервикального канала в первую фазу менструального цикла.
С целью анализа иммунного статуса были проведены исследования иммунологических показателей цервикальной слизи у женщин с ВПЧ — ассоциированной CIN II степени и в контрольной группе. Проводился углубленный анализ функциональной активности провоспалительных и иммунорегуляторных цитокинов: ИФН-γ, ИЛ-18, ФНО-α. Результаты выражались количественно, в пикограммах на миллилитр (пг/мл).
Цитокины определялись методом конкурентного иммуноферментного анализа с помощью набора реагентов «Вектор-БЕСТ» (Новосибирск) по методикам, приложенным к тест-системам.
Данные пациенток обследуемых групп обрабатывались общепринятыми методами вариационной статистики и представлены в виде средней арифметической и ее стандартной ошибки (M±m). Однородность дисперсий оценивали с использованием теста Фишера. Достоверными считались различия при p<0,05.
Результаты и обсуждение
Исследования последних десятилетий доказывают [15, 16], что высокая вирусная нагрузка, превышающая порог прогрессии (3 lg на 105 клеток), служит важным прогностическим маркером тяжести поражения шейки матки и рассматривается как один из критериев, способствующих длительной персистенции ПВИ.
Стоит отметить, что вирусная нагрузка ВПЧ ВКР у пациенток основной группы находилась в пределах клинически значимой концентрации и соответствовала 4,55±0,07 lg копий/обр. Наиболее часто наблюдались серотипы 16, 18, 51 и 56-й [17, 18] (см. рисунок). Сочетание 2 генотипов ВПЧ и более определялось у 79,4% пациенток с CIN II.
Рис. Распространенность серотипов ВПЧ ВКР при CIN II.
Основной противовирусной активностью среди цитокинов обладают интерфероны. Все они располагаются на 19-й хромосоме и являются ключевыми факторами местного противовирусного ответа [19].
Изменения цитокинового профиля при межгрупповом сравнительном анализе имели свои особенности. У пациенток с CIN II наблюдались изменения иммунологических показателей цервикальной слизи. Несмотря на активирующее влияние ИЛ-18 на синтез ИФН-γ и противовирусный иммунный ответ, тенденция к однонаправленному характеру изменений этих цитокинов не прослеживалась. Хотя ИФН-γ оказывает прямое антивирусное и иммуностимулирующее действие, при определенных обстоятельствах он может быть иммуносупрессором и фактором, способствующим персистенции вируса. Ряд авторов отмечают активацию экспрессии ИФН-генов ВПЧ, которая приводила к повышению содержания ИФН-γ в крови у пациенток, инфицированных ВПЧ. Наибольшую активацию системы ИФН вызывали типы ВПЧ высокого онкогенного риска [20].
Так, у пациенток с CIN II уровень ИФН-γ превышал таковой в контрольной группе в 2 раза, а средний уровень ИЛ-18 снижался до 5,78±0,12 пг/мл, в то время как у пациенток контрольной группы данный показатель оставался на уровне 8,12±0,07 пг/мл (см. таблицу).
Таблица. Уровни цитокинов в цервикальной слизи у пациенток исследованных групп
| Показатель | Группа обследованных пациенток | ||||
| M±m | Ме [25-й p; 75-й p] | Min | Max | p | |
| Контрольная (n=86) | |||||
| ИФН-γ, пг/мл | 89,44±0,85 | 90,30 [85,70; 93,42] | 72,10 | 99,15 | 0,0000* |
| ИЛ-18, пг/мл | 8,12±0,07 | 8,15 [7,70; 8,45] | 7,25 | 9,20 | 0,0000* |
| ФНО-α, пг/мл | 2,66±0,05 | 2,63 [2,40; 3,00] | 2,09 | 3,40 | 0,3820 |
| Основная (n=86) | |||||
| ИФН-γ, пг/мл | 163,61±2,06 | 164,87 [152,17; 175,70] | 120,16 | 196,80 | |
| ИЛ-18, пг/мл | 5,78±0,12 | 5,75 [5,05; 6,40] | 3,60 | 8,20 | |
| ФНО-α, пг/мл | 2,72±0,04 | 2,71 [2,43; 2,95] | 1,84 | 3,85 | |
Примечание. * — различие между группами достоверно (тест Манна—Уитни, p<0,05).
Сниженный уровень ИЛ-18, играющего важную роль в формировании иммунного ответа с участием T-лимфоцитов CD8+ в цервикальной слизи, у пациенток с CIN II связан с иммуносупрессивным действием белка E6 ВПЧ [21].
Именно белок Е6 связывается с ИЛ-18, являющимся основным индуктором ИФН-γ, что приводит к блокаде реакций клеточного цитотоксического иммунитета. Доказано негативное действие белков Е6 и Е7 на экспрессию гена, кодирующего ИЛ-18, что свидетельствует о наличии у ВПЧ специфического механизма иммуносупрессии, подавляющего продукцию ИЛ-18.
Уровень другого провоспалительного цитокина — ФНО-α в цервикальном секрете составил 2,72±0,04 пг/мл и почти не отличался от показателя контрольной группы (2,66±0,05 пг/мл). Поскольку уровень ФНО-α является показателем активности воспаления и коррелирует с тяжестью течения инфекционного процесса, то, вероятно, длительная персистенция вируса при цервикальных интраэпителиальных поражениях II степени снижает возможность организма элиминировать ВПЧ и тормозит процесс апоптоза.
В ряде проведенных ранее исследований показано, что ФНО-α ингибирует пролиферацию здоровых эпителиальных клеток шейки матки, а в случае инфицирования эпителия ВПЧ 16-го и 18-го типов тот же ФНО-α стимулирует пролиферацию пораженных клеток [22].
Заключение
Анализируя полученные данные, можно сделать следующее заключение.
Формирование CIN II чаще происходит при инфицировании ВПЧ 2 высокоонкогенных серотипов и более (79,4% пациенток).
У пациенток с CIN II, ассоциированной с ПВИ, характерным отличием от контрольной группы стало снижение уровня провоспалительного цитокина ИЛ-18, участвующего в индукции ИФН-γ.
Инвазия и длительная персистенция ВПЧ при CIN II сопровождаются нарушением рецепторного аппарата вирустрансформированных клеток, экспрессирующих рецепторы ИФН-γ, что делает их нечувствительными к действию изучаемого лимфокина и приводит к тому, что по принципу обратной связи происходит увеличение содержания его в цервикальной слизи у пациенток основной группы.
Участие авторов:
Концепция и дизайн исследования — О.В. Епифанова, О.П. Виноградова, Н.А. Андреева
Сбор и обработка материала — О.В. Епифанова, Н.А. Андреева
Статистическая обработка данных — О.В. Епифанова
Написание текста — О.В. Епифанова
Редактирование — О.П. Виноградова
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Participation of authors:
Concept and design of the study — O.V. Epifanova, O.P. Vinogradova, N.A. Andreeva
Data collection and processing — O.V. Epifanova, N.A. Andreeva
Statistical processing of the data — O.V. Epifanova
Text writing — O.V. Epifanova
Editing — O.P. Vinogradova
Authors declare lack of the conflicts of interests.