АБА — аллергическаябронхиальнаяастма

БА — бронхиальная астма

ГКС — глюкокортикостероиды

ИМТ — индекс массы тела

НАБА — неаллергическая БА

IL — интерлейкин

Известно, что доминирующую роль в развитии и дифференцировке клеток Th2 играют интерлейкин (IL) 4 и транскрипционный фактор STAT6.

На многочисленных экспериментальных моделях животных показано, что трансгенные мыши, экспрессирующие IL-4 или конституитивно активный STAT6, характеризуются развитием аллергического воспаления, тогда как редукция воспалительного ответа связана с дефицитом (метод программируемого нокаута генов) IL-4 или STAT6 [1].

У больных аллергической бронхиальной астмой (АБА), не получающих глюкокортикостероиды в фазе обострения, показано увеличение экспрессии активированного pSTAT6 (фосфорилированная форма) в лимфоцитах периферической крови, что ассоциировалось с выраженным клеточным воспалительным процессом за счет активации STAT6 [2]. Вместе с тем предполагают, что для развития и дифференцировки Th2 необходимо участие наряду со STAT6 транскрипционного фактора STAT3. Хотя известно, что STAT3 участвует в дифференцировке лимфоцитов Th17 и Thf, IL-6 и лептин, активируя STAT3, способствуют тому, что этот транскрипционный фактор участвует в экспрессии Maf (подтип транскрипционного фактора AP-1 — фактора, необходимого для последующей экспрессии IL-4 в клетках Th2). STAT3 непосредственно связывает локусы Maf и Batf. Однако окончательная роль STAT3 в развитии Th2-ответа неясна [3].

В этой связи представляют большой интерес изучение особенностей лептиновой сигнализации на пострецепторном уровне, в частности участие транскрипционных факторов, а именно STAT3, экспрессия которого при бронхиальной астме (БА) практически не изучена. STAT3 экспрессируется в эпителиальных клетках, T-лимфоцитах CD4+ и участвует в развитии аллергического воспаления у мышей. Модуляция хронического аллергического воспаления при ингаляции аллергена у животных индуцировала активность STAT3 в эпителии бронхов, гладкой мускулатуре и клеток окружения. STAT3, экспрессируясь в эпителии бронхов, индуцирует хемокины ТАRC (ССL17), при этом снижение экспрессии STAT3 демонстрировало уменьшение эозинофилии и количества лимфоцитов Тh2 в бронхах, снижение активности воспаления и гиперреактивности бронхов.

Недавно показано, что транскрипционный фактор STAT3 кооперируется с STAT6 в процессе дифференцировки лимфоцитов Th2 и развитии аллергического воспаления. У мышей, сенсибилизированных овальбумином, специфическая делеция в Т-лимфоцитах STAT3 приводила к уменьшению воспаления в бронхах и эозинофилии наряду с понижением уровня цитокинов Th2 профиля и IL-17 в дыхательных путях.

Вклад STAT3 в индуцированное аллергическое воспаление оценивали на мышиных моделях при делеции STAT3 в Т-лимфоцитах, сохранив конституционально активным фактор STAT6VT [3]. Оказалось, что при «сохранном» STAT3 активация STAT6VT характеризовалась зависимым от IL-4 спонтанным воспалением в легких и коже, блефаритом. При STAT3 дефиците (STAT6VT-stat3CD4–/–) активация STAT6 не вызывала воспаления в легких и коже, блефарита, демонстрируя, что экспрессия STAT3 в Т-лимфоцитах важна в развитии аллергического ответа Th2. Авторы [3] делают вывод, что экспрессия STAT3 в клетках некоторых типов играет ключевую роль в развитии аллергического воспаления.

Показано [4], что развитие Th2 лимфоцитов у мышей связано с коэкспрессией активных форм STAT6 и STAT3, при этом экспрессия STAT3 необходима для кооперации Т- и В-лимфоцитов. Кроме того, экспрессия STAT3 в лимфоцитах Th2 и Tfh нужна для последующего взаимодействия между Tfh-лимфоцитами и В-лимфоцитами. Tfh-лимфоциты (от анг. follicular helper — фолликулярный хелпер) —относительно недавно открытая, важнейшая субпопуляция T-клеток CD4, расположена в лимфоидных фолликулах и осуществляющая хелперную функцию для В-лимфоцитов посредством продукции IL-21, вызывая их созревание и терминальную дифференцировку в плазматические клетки. Кроме IL-21 лимфоциты Tfh могут также продуцировать IL-6 и IL-10, необходимые для дифференцировки В-лимфоцитов. Нарушение функции этой популяции приводит к развитию аутоиммунных заболеваний. Авторами установлено, что экспрессия STAT3 в лимфоцитах Th2 усиливает сдвиг от IgG к IgE in vivo.

Цель нашего исследования состояла в оценке экспрессии рSTAT3 в мононуклеарах периферической крови и особенностей ее модуляции лептином при различных вариантах Б.А. Мы определяли экспрессию рSTAT3 исходно и в присутствии рекомбинантного лептина у больных БА и здоровых лиц.

Обследовали 67 больных БА и 25 практически здоровых лиц в возрасте от 19 до 65 лет. Из них 25 больных АБА, 33 с неаллергической БА (НАБА), 15 больных АБА с избыточной массой тела (индекс массы тела — ИМТ) ≥25 кг/м², 24 больных НАБА с избыточной массой тела (ИМТ ≥25 кг/м²); больных с ожирением в исследование не включали. В зависимости от пола и возраста больных БА разделили на 2 группы — старше и моложе 45 лет. Все обследованные больные БА находились в клинике госпитальной терапии им. акад. М.В. Черноруцкого ПСПбГМУ им. акад. И.П. Павлова. Проводили комплексное клинико-лабораторное и инструментальное обследование, включавшее общеклинические методы, цитологический и бактериологический анализы мокроты, а также аллергологическое исследование и проводили исследование функции внешнего дыхания. Диагноз устанавливали и проводили лечение в соответствии с критериями и стандартами международного консенсуса по вопросам диагностики и лечения БА (GINA, 2014).

В качестве модели для исследования выбраны мононуклеары периферической крови. Не позднее чем через 40 мин после получения венозной крови выделяли клетки путем центрифугирования в градиенте плотности «Lymphoseparatium Mеdium» («MP Вiomedicals», США), плотность 1,077 г/см³ [5]. Гепаринизированную кровь разводили 2 раза раствором хлорида натрия (9 гл, рН 7,2), наслаивали на 3 мл градиента плотности и центрифугировали 30 мин при 400g. Образовавшееся в интерфазе «кольцо» мононуклеаров отбирали пипеткой, полученную клеточную взвесь трижды отмывали раствором хлорида натрия и доводили концентрацию до 2·10⁶ клеток/мл. Жизнеспособность клеток определяли по связыванию трипанового синего; она составляла 95—100%.

Определение концентрации активной (фосфорилированной) формы транскрипционного фактора STAT3 (pSTAT3) методом проточной флюориметрии проводили по стандартному протоколу Bio-Plex на иммуноанализаторе (проточном флюориметре) Bio-Plex («Bio-Rad», CША) с применением технологии xMAP (селективное связывание определяемых цитокинов) и сорбированных на поверхности микрочастиц антител с использованием 3 наборов: набор для определения белка phosphor STAT-3 (Tyr 641) (тип Bio-Plex Phosphoprotein Assays), 96 well; Bio-Plex Phospho Reagent Kit, 96 well; Bio-Plex Cell Lysis Kit, 96 well.

Порядок проведения анализа. Выделяли мононуклеары методом градиентного центрифугирования. Проводили инкубацию мононуклеаров периферической крови лептином. Лимфовзвесь разделяли на 2 части: образец № 1 контроль — 100 мкл, образец № 2 — 90 мкл. К образцу № 2 добавляли 10 мкл (10 нг) рекомбинантного лептина (Leptin, human, recombinant expressed in a E. сoli «Sigma» CША) [6].

Приготовление лизирующего раствора. Приготовлялся 500 мМ раствор PMSF: 0,436 г PMSF растворяли в 5 мл DMSO. 40 мкл фактора-1 и 20 мкл фактора-2 добавляли к 9,9 клеточно-лизирующего буфера (cell lysis buffer), после перемешивания на вортексе образовавшийся раствор помещали на лед. К этому раствору добавляли 40 мкл 500 мM раствора PMSF. Затем из суспензии выделенных мононуклеаров в среде (RPMI-1640) готовили лизат: к взвеси мононуклеаров (проба № 1 и проба № 2) добавляли промывочный буфер (стандартный Wash-buffer) температуры 0 °C в соотношении: 2 объема буфера к 1 объему взвеси мононуклеаров. Затем клетки центрифугировали в течение 5 мин при 1000—1500 об/мин (0,2 g) при температуре 4 °C, после чего удалялся надосадок. Затем к осадку добавляли лизирующий раствор (стандартный Lysis buffer) по 75 мкл на пробу. После этого образцы подвергали ресуспензированию 5 раз и помещали на шейкер при 300 об/мин на 20 мин при температуре 4 °C. Затем образцы центрифугировали при 4500 g в течение 20 мин при температуре 4 °C. После этого забирали надосадок (без повреждения осадка) и к нему добавляли равный объем аналитического буфера (стандартный Assay-buffer). Образцы хранили при температуре –20 °С. Проведение анализа. Поверхность нитроцеллюлозных фильтров 96-луночной платы смачивали промывочным буфером (стандартный Wash-buffer). В каждую из лунок вносили 100 мкл промывочного буфера, после чего удаляли жидкость с помощью вакуумного отсоса. Рабочий раствор микрочастиц перемешивали на вортексе и вносили в объеме 50 мкл в каждую из лунок. Удаляли буфер с помощью вакуумной фильтрации. Вносили 100 мкл промывочного буфера, после чего его удаляли с помощью вакуумной фильтрации. Этот этап повторяли еще раз. Вносили по 50 мкл предварительно разведенных стандартных проб и определенных образцов. Проводили инкубацию на шейкере в течение 30 мин. Буфер удаляли с помощью вакуумной фильтрации. Плату отмывали 3 раза промывочным буфером. Рабочий раствор антител перемешивали на вортексе и вносили по 25 мкл в каждую лунку. Проводили инкубацию на шейкере в течение 30 мин. Буфер удаляли с помощью вакуумной фильтрации. Плату отмывали 3 раза промывочным буфером. Вносили 50 мкл конъюгата стрептавидин/фикоэритрин. Инкубацию проводили на шейкере в течение 10 мин. Удалялся буфер с помощью вакуумной фильтрации. Плату отмывали 3 раза промывочном буфером. Микрочастицы ресуспензировали в 125 мкл рабочего буфера в течение 30 с. Плату инкубировали на шейкере, после чего помещали в рабочую станцию иммуноанализатора Bio-plex («Bio-Rad», США) и считывали результаты.

Статистическая обработка. Для анализа результатов исследования разработана специальная база данных на основе программы SPSS для Windows (русифицированная версия 20.0). Статистическую обработку полученных данных выполняли с помощью методов параметрической и непараметрической статистики с использованием описательной статистики. Оценивали 95% доверительные интервалы распростраренностипризнака; при распределениях, отличающихся от нормального, и при малых выборках вычисляли медианы с 25-м и 75-м процентилями.

Для оценки различий между группами применяли критерий t Стьюдента при сравнении двух групп в параметрической статистике и ранговый критерий Манна—Уитни в непараметрической статистике. Для проведения множественных сравнений (более двух групп сравнения) в параметрической статистике использовали метод однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA), а для непараметрической статистики — критерий Крускала—Уоллиса. При этом при поиске парных различий применяли поправку Бонферрони. Для сравнения парных (связанных) выборок (динамическое наблюдение за больными, определение показателя до и после воздействия) использовали парный критерий t Стьюдента (параметрическая статистика) и критерий Вилкоксона (непараметрическая статистика). Критический уровень значимости (достоверности) нулевой статистической гипотезы (об отсутствии различий и влияний) принимали равным 0,05.

Наибольшая экспрессия рSTAT3 выявлена при БА; при этом максимальные значения этого показателя установлены у больных АБА, значительное снижение отмечено при НАБА. Указанные уровни экспрессии рSTAT3 оказались статистически значимыми. Обращает особое внимание группа больных, получающих системные пероральные глюкокортикостероиды (ГКС), в которой экспрессия рSTAT3 оказалась минимальной (табл. 1). Различия по экспрессии рSTAT3 выявлены также в зависимости от ИМТ. Так, при ИМТ ≥25 кг/м² экспрессии рSTAT3 у больных АБА оказалась статистически значимо выше, чем при НАБА (табл. 2).

Механизмы, объясняющие полученные результаты, могут быть предположительно связаны, во-первых, с суперэкспрессией pSTAT3 при АБА, во-вторых, не исключается активация рSTAT3 в кооперации с STAT6 и коэкспрессия этих двух транскрипционных факторов. Уместно напомнить мнение авторов [7, 8] о том, что именно IL-4 обеспечивает основной сигнал, уменьшающий дифференцировку Th17, иммунный ответ и снижение выраженности симптомов моделируемого аутоиммунного воспаления.

Повышенная экспрессия рSTAT3 наиболее выражена в группе больных АБА старше 45 лет с ИМТ ≥25 кг/м². Это может быть предположительно связано с тем, что в этой группе больных имеется суперэкспрессия обоих транскрипционных факторов STAT3 и STAT6 в мононуклеарах периферической крови. Максимальное снижение экспрессии транскрипционного фактора выявлено в группе больных БА, получающих системные пероральные ГКС. Снижение экспрессии pSTAT3 при этом варианте БА связано с возможным влиянием терапии ГКС и известным ингибирующим действием ГКС на эффекты лептина, опосредуемые транскрипционным фактором pSTAT3 [9].

При НАБА нами получено статистически значимое снижение уровня pSTAT3 как у относительно больных АБА, так и в контрольной группе. При этом установлено, что экспрессия мРНК в мононуклеарах периферической крови такого негативного регулятора лептиновой сигнализации, как белок SOCS3 (Suppressor of Cytokine Signaling 3) повышена при БА [10]. Повышение экспрессии этого белка может приводить к нарушению фосфорилирования рецептора к лептину OB-Rb и таким образом блокировать трансдукцию лептинового сигнала [10]. Возможно, активация SOCS3 по механизму негативной обратной связи ассоциирована с развитием резистентности к лептину при гиперлептинемии, установленной при НАБА. Индуцированный лептином STAT3 сигнальный путь активирует негативную ответную регуляцию SOCS3, которая ингибирует индуцированную лептином сигнальную трансдукцию [11].

Рассмотрим экспрессию рSTAT3 в условиях модуляции лептином при Б.А. Следует отметить, что в целом экспрессия рSTAT3 при БА, как при АБА, так и при НАБА, до и после воздействия лептином статистически значимо не различалась, что может быть связано с разнонаправленностью реагирования на пострецепторном уровне по типу прироста или снижения экспрессии рSTAT3 и нивелированием суммарных результатов (табл. 3). В противоположность этому в контрольной группе здоровых лиц нами получено статистически значимое повышение экспрессии рSTAT3 в условиях модуляции лептиновой сигнализации рекомбинантным лептином (см. табл. 3).

При анализе группы больных АБА в зависимости от возраста и ИМТ различия как показателя, так и знака (направленности — повышение или понижение) экспрессии транскрипционного фактора рSTAT3 оказались выраженными.

Анализ экспрессии рSTAT3 при модуляции лептином у больных АБА в отличие от НАБА и здоровых выявил статистически значимые разнонаправленные типы ответа экспрессии рSTAT3 (повышение или снижение транскрипционного фактора в различных группах больных АБА в зависимости от возраста, ИМТ и пола представлено в табл. 4, 5).

Так, в подгруппе больных АБА старше 45 лет и у мужчин с ИМТ <25 кг/м² отмечалось статистически значимое повышение экспрессии рSTAT3 по сравнению с исходной. При это в подгруппе больных АБА моложе 45 лет и женщин с ИТМ ≥25 кг/м² выявлено статистически значимое парадоксальное снижение уровня транскрипционного фактора по сравнению с исходным.

Анализируя подгруппы больных НАБА, мы не нашли отличий экспрессии транскрипционного фактора рSTAT3 как исходно, так и в присутствии лептина, хотя при этом отмечалась однонаправленность ответа с незначительным приростом транскрипционного фактора. Таким образом, мы предполагаем, что выявленная нами подгруппа больных АБА, женщин моложе 45 лет с ИМТ ≥25 кг/м² и парадоксальным снижением экспрессии рSTAT3 в условиях модуляции лептином — это особый подтип фенотипа БА в сочетании с избыточной массой тела.

Большое значение для понимания направленности типа реагирования: повышение — снижение уровня рSTAT3 при модуляции лептином — имеет анализ динамики транскрипционного фактора у здоровых лиц. Изменения экспрессии рSTAT3 в условиях модуляции лептином в контрольной группе практически здоровых лиц представлены в табл. 6. Следует отметить, что повышение экспрессии рSTAТ3 отмечалось у всех практически здоровых лиц и оказалось аналогичным в подгруппе больных АБА (женщины старше 45 лет с избыточной массой тела).

Таким образом, можно предположить, что подгруппа больных АБА — лица моложе 45 лет, с избыточной массой тела, парадоксальным снижением экспрессии pSTAT3, может быть рассмотрена как отдельная, отличающаяся по направленности реагирования транскрипционного фактора в сравнении не только с контрольной группой, но и с группой больных НАБА, в которой также отмечался прирост уровня рSTAT3, хотя и статистически незначимый.

Суммируя изложенное, еще раз отметим, что экспрессия рSTAT3 при НАБА исходно значительно снижена и не зависит от модуляции лептином.

У здоровых лиц в условиях модуляции лептиновой сигнализации рекомбинантным лептином отмечается увеличение экспрессии рSTAT3. У больных АБА экспрессия рSTAT3 максимально повышена, суперэкспрессия рSTAT3 увеличивается с возрастом, а при стимуляции лептином характер ответа также зависит от возраста больных АБА. У больных АБА старше 45 лет отмечается увеличение экспрессии рSTAT3 и при этом выявляется сходство по характеру реагирования с контрольной группой здоровых лиц. У больных АБА моложе 45 лет и ИМТ ≥25 кг/м² отмечается парадоксальное уменьшение экспрессии рSTAT3, по-видимому, свойственное атопическому состоянию, что позволило выделить эту подгруппу больных АБА как отдельную, относящуюся к субтипу фенотипа БА в сочетании избыточной массой тела.

Обсуждая значение динамики рSTAT3 с позиций участия в воспалении при различных вариантах БА, следует отметить выявленную нами корреляцию между уровнем адипонектина и рSTAT3. Оказалось, что при НАБА, а также в группе практически здоровых лиц уровень транскрипционного фактора рSTAT3 положительно коррелировал с адипонектином, как исходно, так и в условиях модуляции лептином, (ρ=0,34; n=32; p=0,05 и ρ=0,42; n=32; p=0,01). Примечательно, что эта связь сохранялась и в фазе ремиссии заболевания (ρ=0,8; n=14; p=0,001), тогда как при АБА такой связи не установлено, а направленность связи имела противоположный характер (ρ=–0,11; n=25; p=0,5 и r=–0,08; n=25; p=0,5). Можно предположить, что низкий уровень рSTAT3, сопряженный с ростом уровня адипонектина при НАБА, может иметь протективный характер.

Работа выполнена на базе лаборатории Научно-методического центра по молекулярной медицине на базе ПСПбГМУ им. акад. И.П. Павлова при непосредственном методическом содействии зав. лабораторией аутоиммунных заболеваний к.м.н. С.В. Лапина и с.н.с., к.м.н. К.А. Сысоева.

Конфликт интересов отсутствует.