При увеитах различной этиологии происходит увеличение содержания в тканях цито- и хемокинов, которые способствуют образованию свободных радикалов [1]. Увеличение количества свободных радикалов приводит к активации факторов транскрипции, в том числе NF-κВ, в результате чего увеличивается синтез медиаторов воспаления [2]. Факторы воспаления провоцируют дальнейшее увеличение количества свободных радикалов, что приводит к образованию порочного круга, развитию окислительного стресса и неконтролируемому усилению воспаления. Выявлена корреляция между тяжестью течения увеита и истощением антиоксидантных резервов глаза [3].
Контроль уровня супероксид-аниона - основного фактора, запускающего окислительный стресс, осуществляют изоферменты супероксиддисмутазы (СОД), которые присутствуют в местах образования этого радикала: в митохондриях, микросомах, цитозоле, а также в межклеточном матриксе. СОД дисмутирует супероксид-анион до перекиси водорода, которая далее инактивируется каталазой.
В ответ на развитие окислительного стресса повышается активность СОД, но уровня эндогенного фермента может быть недостаточно, тем более что СОД может инактивироваться в результате нитрования ее образующимся при окислительном стрессе пероксинитритом [4, 5].
Цель исследования - при экспериментальном увеите изучить изменение биохимических показателей во влаге передней камеры, отражающих интенсивность окислительного стресса и воспаления; оценить действие антиоксидантного фермента СОД при местном применении в виде глазных капель на характер клинического течения и локальные метаболические процессы при экспериментальном увеите у кроликов.
Материал и методы
Работа выполнена на 25 кроликах (50 глаз) породы шиншилла массой 2,0-2,5 кг. У 22 животных воспроизводили увеит путем двукратного введения нормальной лошадиной сыворотки: 1-ю дозу (5 мл) вводили подкожно, 2-ю (0,07 мл) - интравитреально на 10-е сутки после 1-й [6]. Три здоровых кролика (6 глаз) были взяты для контроля биохимических показателей.
Для лечения использовали препарат Рексод (ООО «НПП Ферментные технологии», Россия), представляющий собой рекомбинантную СОД человека.
Кролики с увеитом были разделены на две группы по 11 животных. Кроликам 1-й группы ежедневно в течение 7 дней, начиная со дня введения разрешающей дозы, проводили инстилляции раствора СОД 3 раза в день по 0,03 мл в оба глаза, 2-й группы - инстилляции плацебо (буферный раствор pH 7,4).
Клиническую оценку течения увеита проводили ежедневно путем биомикроскопии с помощью щелевой лампы. В условных баллах по принятой в лаборатории шкале оценивали выраженность следующих признаков: отек и гиперемия век, бульбарной конъюнктивы и радужки, отек роговицы, вид экссудата и количество фибрина в передней камере глаза, наличие задних синехий, помутнение хрусталика.
На 4-е и 8-е сутки увеита у 4 кроликов (8 глаз) из каждой группы отбирали из каждого глаза около 0,15 мл влаги передней камеры и выводили животных из эксперимента. Водянистую влагу центрифугировали и супернатант использовали для исследований.
Определяли следующие показатели: концентрацию общего белка по Лоури [7]; антиокислительную активность в отношении гидроксильных радикалов (АОА-ОН•) и супероксид-анион-радикала (АОА-О
Величину оптической плотности образцов измеряли на микропланшетном фотометре Synergy MX («Bio-Tek», США). Кинетику хемилюминесценции регистрировали на хемилюминометре Биотокс-7 (НПО «Энергия»). Статистическую обработку результатов проводили с использованием статистических пакетов программ Excel и Statistica.
На 4-е сутки у трех кроликов (6 глаз) из каждой группы энуклеировали оба глаза и провели их гистологическое исследование. Микротомные срезы толщиной 4-5 мкм окрашивали гематоксилином и эозином. Анализ препаратов проводили с использованием светового микроскопа Olympus BX51 с цифровой видеокамерой SDU («Спецтелетехника», Россия).
Результаты и обсуждение
У кроликов с увеитом без лечения на 4-е сутки течения увеита содержание белка в водянистой влаге возрастало в 40 раз по сравнению с нормой (см. таблицу)
Во влаге передней камеры в большом количестве обнаруживались лейкоциты. Развивающееся воспаление и активная миграция лейкоцитов приводят к массивному выбросу активных форм кислорода [1], поэтому закономерно, что антиокислительная активность водянистой влаги по отношению к гидроксильному радикалу в острую фазу увеита значительно снижалась (до 20% от нормы) вследствие расходования эндогенных антиоксидантов на нейтрализацию высокотоксичных гидроксильных радикалов.
В то же время антиокислительная активность водянистой влаги по отношению к супероксид-анион-радикалу возрастала, по-видимому, за счет выявленного нами повышения активности СОД на 164%. Увеличение активности СОД является компенсаторной реакцией на усиление свободнорадикальных процессов и характерно для развития окислительного стресса [5]. Возрастало и содержание продуктов метаболизма NO, что связано с усилением его продукции при воспалении. Одновременное наличие в тканях большого количества супероксид-анион-радикала и радикала NO создает условия для образования высокотоксичного радикала пероксинитрита, который способен нитровать различные функциональные и структурные белки, в том числе СОД, с потерей их свойств [4, 5]. Показана и способность пероксинитрита вызывать структурные изменения в эндотелиальном слое роговицы [12, 13].
В острый период увеита в водянистой влаге значительно увеличивалась активность ингибитора протеаз α
У кроликов, получавших инстилляции СОД, во влаге передней камеры было значительно меньше лейкоцитов (рис. 1)
На 7-е сутки течения увеита отмечалось повышение антиокислительной активности и снижение всех остальных показателей, что характерно для уменьшения интенсивности воспалительного процесса.
У нелеченных животных в течение всего периода наблюдения признаки увеита были ярко выражены: конъюнктива отечна и гиперемирована, развивался прогрессирующий отек роговицы, отек и гиперемия радужки, во влаге передней камеры в большом количестве обнаруживался фибрин, формировались задние синехии, в большинстве случаев круговые, хрусталик становился диффузно мутным, стекловидное тело сквозь него не визуализировалось, позже во всех глазах развилась катаракта. На 6-7-е сутки пальпаторно определялось повышение внутриглазного давления, что свидетельствует о развитии вторичной гипертензии.
У животных, получавших инстилляции раствора СОД, клиническая картина заметно отличалась. Признаки конъюнктивита были выражены незначительно (р<0,05 по сравнению с нелеченными животными), перикорнеальная инъекция конъюнктивы - умеренно. Отек роговицы был локальным, нерезко выраженным и со временем уменьшался, как и отек радужки. Количество фибрина в передней камере было достоверно меньше (р<0,05). Во время лечения отмечались регресс задних синехий и частичное восстановление реакции зрачка на свет. Помутнение хрусталика было незначительным.
Гистологическое исследование показало, что у животных, не подвергавшихся лечению, развился выраженный панувеит. У всех животных отмечались резкое утолщение, отек и плотная нейтрофильная инфильтрация сосудистой оболочки во всех отделах глаза и отложение на ней фибринозно-гнойного экссудата. Отек и инфильтрация распространялись на ткань цилиарного тела, склеру и сетчатку. Имелась частичная деструкция пигментного эпителия сосудистой оболочки и эпителия цилиарных отростков. В роговице отмечались разрыхление коллагенового каркаса, очаговая деструкция десцеметовой мембраны и десквамация эндотелия (рис. 2)
Заключение
Развитие увеита сопровождается значительными изменениями активности локальных антиокислительной, антипротеолитической систем и продукции NO. Применение антиоксидантного фермента СОД способствует нормализации биохимических показателей во влаге передней камеры и существенно улучшает клиническое течение экспериментального увеита.
Участие авторов:
Концепция и дизайн исследования: В.Н., Н.Ч., О.К.
Сбор и обработка материала: О.Б., Г.Б., А.Ш., П.Б.
Статистическая обработка данных: О.Б.
Написание текста: О.Б.
Редактирование: Н.Ч., И.Н., О.К.
Конфликт интересов отсутствует.